RESOLUCIÓN OIV-OENO 511-2013 MÉTODO DE DETERMINACIÓN DE LA RELACIÓN ISOTÓPICA 18O/16O DEL AGUA EN EL VINAGRE DE VINO POR ESPECTROMETRIA DE MASAS ISOTOPICAS LA ASAMBLEA GENERAL, Visto el artículo 2 párrafo 2 iv del Acuerdo del 3 de abril de 2001 por el que se crea la Organización Internacional de la Viña y el Vino, 18 16 Considerando la resolución Oeno 2/96 relativa a la determinación de la relación isotópica O/ O del agua en el vino y el estudio interlaboratorios, Considerando la resolución OIV/OENO 353/2009 relativa a la determinación de la relación isotópica 18 16 O/ O del agua en el vino y el mosto, Por propuesta de la Subcomisión “Métodos de análisis”, DECIDE completar el Compendio de los métodos internacionales de análisis de los vinagres de vino con el siguiente método: 1. Título Método de determinación de la relación isotópica 18O/16O del agua en el vinagre de vino por espectrometría de masas Método de tipo: II 2. Objetivo/ámbito de aplicación Este método permite determinar la relación isotópica 18O/16O del agua en el vinagre de vino tras alcanzar un equilibrio con CO2 y por espectrometría de masas de relaciones isotópicas (IRMS). 3. Definiciones 18 O/16O Relación isotópica del oxígeno 18 y del oxígeno 16 en una muestra dada. δ18OV-SMOW Escala relativa usada para expresar la relación isotópica de oxígeno 18 y del oxígeno 16 en una muestra dada. Se calcula según la fórmula siguiente: Certificado conforme Bucarest, 7 de junio de 2013 El Director General de la OIV Secretario de la Asamblea general Federico CASTELLUCCI © OIV 2013 1 18OV SMOW 18O 18O 16 16 O muestra O patrón 1000 ‰ 18O 16 O patrón El patrón V-SMOW se toma como referencia para la escala relativa δ. BCR Oficina Comunitaria de Referencia OIEA Organismo Internacional de la Energía Atómica, con sede en Viena (Austria) IMMR Instituto de Medidas y Materiales de Referencia IRMS Espectrometría de masas de relaciones isotópicas m/z Relación masa/carga NIST Instituto Nacional Estadounidense de Patrones y Tecnología MR Material de referencia V-SMOW Viena Standard Mean Ocean Water (Patrón de Viena para la composición promedio del agua oceánica) (18O/16O = RV-SMOW = 0,0020052) GISP Greenland Ice Sheet Precipitacion (Precipitaciones en la calota glacial de Groenlandia) SLAP Standard Light Antarctic Precipitation (Precipitaciones ligeras estándar en la Antártica) 4. Principio La técnica que se describe a continuación está basada en el equilibrio isotópico del agua presente en muestras de vinagre de vino con un gas CO2 estándar, según la siguiente reacción de intercambio isotópico: C16O 2 H 2 18 O C16 O18 O H 2 16 O Tras alcanzar el equilibrio, el dióxido de carbono en fase gaseosa se utiliza para analizar mediante IRMS la relación isotópica 18O/16O. Certificado conforme Bucarest, 7 de junio de 2013 El Director General de la OIV Secretario de la Asamblea general Federico CASTELLUCCI © OIV 2013 2 5. Reactivos y materiales Los productos y los materiales fungibles dependen del método elegido (véase el apartado 6). Pueden utilizarse los siguientes materiales de referencia, soluciones de trabajo y materiales fungibles: 5.1. Materiales de referencia Nombre V-SMOW, RM 8535 BCR-659 GISP, RM 8536 SLAP, RM 8537 Organismo responsable OIEA / NIST IMMR OIEA / NIST OIEA / NIST δ18O con respecto a V-SMOW 0‰ - 7,18 ‰ - 24,78 ‰ - 55,5 ‰ 5.2. Soluciones de trabajo 5.2.1. Dióxido de carbono (anhídrido carbónico) como gas de referencia secundario para la medición (Núm. CAS: 00124-38-9) 5.2.2. Dióxido de carbono para el equilibrado (dependiendo del instrumento, este gas puede ser el mismo que el que se relaciona en el punto 5.2.1. o bien en el caso de sistemas de flujo continuo puede ser una bala que contenga una mezcla de helio y dióxido de carbono. 5.2.3. Soluciones de trabajo cuyos valores de δ18OV-SMOW se hayan calibrado con arreglo a materiales de referencia internacionales. 5.3. Materiales fungibles Helio para análisis (Núm. CAS: 07440-59-7) 6. Equipo 6.1 Espectrómetro de masas de relaciones isotópicas El espectrómetro de masas de relaciones isotópicas determina el contenido relativo de 18O respecto al de 16 O en el gas CO2 con una precisión interna de 0,05 ‰. La precisión interna se define como la diferencia entre dos medidas de la misma muestra de CO2. El espectrómetro de masas destinado a determinar la composición isotópica del gas CO2 está generalmente equipado con un triple colector, que puede medir simultáneamente las siguientes corrientes iónicas: - m/z = 44 (12C16O16O) - m/z = 45 (13C16O16O y 12C17O16O) - m/z = 46 (12C16O18O, 12C17O17O y 13C17O16O) Al medir las intensidades correspondientes, la relación isotópica 18O/16O se ve determinada por la relación de intensidad m/z= 46 y m/z= 44 tras llevar a cabo una serie de correcciones en las especies isobáricas 12C17O16O y 13C17O16O, cuya contribución podría calcularse en función de la intensidad observada para m/z= 45 y en función de la abundancia isotópica de 13C y 17O naturales. El espectrómetro de masas de relaciones isotópicas debe estar equipado con: Certificado conforme Bucarest, 7 de junio de 2013 El Director General de la OIV Secretario de la Asamblea general Federico CASTELLUCCI © OIV 2013 3 - un sistema de doble entrada (sistema de doble ingreso) para medir de forma alterna la muestra y una muestra de referencia - o un sistema de flujo continuo que transfiera de forma cuantitativa en el espectrómetro de masas el CO2 de los recipientes que contienen las muestras en equilibrio y el patrón de CO2. 6.2 Instrumental y materiales Los instrumentos y materiales deben satisfacer las exigencias del método o del equipo utilizado (especificadas por el fabricante). No obstante, también se pueden utilizar otros instrumentos o materiales con las mismas prestaciones. 6.2.1 Viales con septum adaptado al sistema empleado 6.2.2 Pipetas volumétricas con las puntas apropiadas 6.2.3 Sistema de control de la temperatura para que la reacción de intercambio isotópico se lleve a cabo a una temperatura constante (normalmente a ± 1 °C) 6.2.4 Bomba de vacío (si el sistema lo requiere) 6.2.5 Automuestreador (si el sistema lo requiere) 6.2.6 Jeringas para las muestras (si el sistema lo requiere) 6.2.7 Columna de GC para separar el CO2 de otros gases elementales (si el sistema lo requiere) 6.2.8 Sistema para extraer el agua (p. ej.: cryo-trap o membranas permeables selectivas) 7. Preparación de las muestras Las muestras de vinagre de vino y los materiales de referencia se utilizan para el análisis sin tratamiento previo. Si la muestra contiene impurezas, conviene filtrarla con un filtro de diámetro de poro de 0,22 µm. A ser posible, los materiales de referencia usados para calibrar y corregir los datos deberán colocarse al inicio y al final de cada serie e intercalarse cada diez muestras. 8. Procedimiento A continuación se recoge el procedimiento usual para determinar la relación isotópica 18O/16O mediante equilibrio del agua con una solución de trabajo de CO2 y posterior análisis por IRMS. Los procedimientos pueden adaptarse en función de los equipos e instrumentos utilizados, ya que existen diferentes tipos de sistemas de equilibrado con diferentes funcionamientos. Los dos procedimientos técnicos más importantes para la introducción de CO2 en el espectrómetro de masas son: un sistema de doble entrada y un sistema de flujo continuo. Nota: los volúmenes, temperaturas, presiones y tiempos se dan a título indicativo. Los valores adecuados deben buscarse en las especificaciones facilitadas por el fabricante o determinarse experimentalmente. 8.1 Equilibrio inducido manualmente Con una pipeta, transferir una alícuota de la muestra o de solución de trabajo a un matraz. Ajustar el matraz al extractor. Enfriar a menos de –80 °C para que se congelen las muestras (los extractores equipados con tubos de apertura capilar no requieren la fase de congelado). A continuación, se produce el vacío en todo el sistema. Certificado conforme Bucarest, 7 de junio de 2013 El Director General de la OIV Secretario de la Asamblea general Federico CASTELLUCCI © OIV 2013 4 Una vez alcanzado un vacío estable, se distribuye CO2 procedente de la solución de trabajo en los matraces de fondo redondo. Para inducir el proceso de equilibrio se utiliza un baño de agua a 25 °C (± 1 °C) durante 12 horas (por la noche). Es muy importante que la temperatura del baño de agua se mantenga constante y homogénea. Una vez terminado el proceso de equilibrado, transferir el CO2 resultante de los matraces al fuelle regulador de la muestra del sistema de doble entrada. Las medidas se llevan a cabo por comparación de las relaciones isotópicas del CO2 de la muestra con las de CO2 de la solución de trabajo, situadas en el fuelle regulador de la solución de trabajo (gas estándar de referencia: CO2). Repetir hasta que se hayan medido todas las muestras de la serie. 8.2 Equilibrio inducido automáticamente Con una pipeta, transferir una alícuota de la muestra o de solución de trabajo a un matraz de fondo redondo. Los matraces que contienen las muestras se ajustan al aparato de equilibrio y se enfrían a menos de –80 °C para que se congelen las muestras (los sistemas equipados con tubos de apertura capilar no requieren la fase de congelado). A continuación, se produce el vacío en todo el sistema. Una vez alcanzado un vacío estable, se distribuye CO2 procedente de la solución de trabajo en los matraces de fondo redondo. El equilibrio se alcanza a 22 ± 1 °C transcurridas 5 horas como mínimo y, a ser posible, con agitación suave. Dado que la duración del proceso depende de varios parámetros (por ejemplo, la forma del matraz, la temperatura y la agitación), el tiempo mínimo requerido ha de determinarse experimentalmente. Una vez terminado el proceso de equilibrado, el CO2 resultante se transfiere de los matraces al fuelle regulador de la muestra del sistema de doble entrada. El análisis se lleva a cabo por comparación de las relaciones isotópicas del CO2 de la muestra con las de CO2 de la solución de trabajo (situadas en el fuelle regulador de la solución de trabajo). Repetir hasta que se hayan medido todas las muestras de la serie. 8.3 Preparación manual y equilibrado automático y análisis mediante un sistema de doble entrada acoplado al espectrómetro de masas de flujo continuo Con una pipeta, transferir una alícuota de la muestra o de solución de trabajo (p. ej. 200 μL) a un vial. Los viales abiertos se colocan en una cámara cerrada que contiene el CO2 utilizado para el equilibrado (5.2.2). Después de varias purgas para eliminar todo resto de aire, los viales se cierran y se colocan en la bandeja térmica del automuestreador. El equilibrado se alcanza después de al menos 8 horas a 40 °C. Una vez que se ha terminado el procedimiento de equilibrado, secar el CO2 obtenido y transferir al lugar de la muestra del sistema de inducción con doble entrada. Las medidas se realizan comparando varias veces las relaciones del CO2 contenido en el lado de la muestra y en el lado de la solución de trabajo (CO2 gas estándar de referencia) de la doble entrada. Este procedimiento se repite hasta que se haya medido la última muestra de la secuencia. 8.4 Equilibrio inducido automáticamente y mediante un sistema de flujo continuo Con una pipeta, transferir una alícuota de la muestra o de solución de trabajo a un vial. Se colocan los viales en una bandeja con control de temperatura. Con una jeringa de gases, introducir en los frascos una mezcla de He y CO2. El CO2 permanece en el espacio de cabeza. El equilibrio se alcanza transcurridas, como mínimo, 18 horas, normalmente a una temperatura de 30 ± 1 °C. Certificado conforme Bucarest, 7 de junio de 2013 El Director General de la OIV Secretario de la Asamblea general Federico CASTELLUCCI © OIV 2013 5 Una vez terminado el proceso, transferir el CO2 obtenido mediante el sistema de flujo continuo a la fuente iónica del espectrómetro de masas. También se utiliza el flujo continuo para introducir el patrón de CO2. La medida se efectúa según el protocolo propio de cada espectrómetro. 9. Cálculos En cada serie de medidas, se registran las intensidades para m/z = 44, 45 y 46 en cada muestra y material de referencia. El ordenador calcula, a través del software del equipo IRMS, las relaciones isotópicas 18 O/16O según lo explicado en el apartado 6.1. En la práctica, las relaciones isotópicas 18O/16O se cotejan con una solución de trabajo previamente calibrada con respecto al V-SMOW. Durante la medida en línea, los cambios en las condiciones instrumentales pueden comportar pequeñas variaciones. Si esto ocurriera, se ha de corregir el valor de δ 18O de las muestras según la diferencia existente entre el valor de la solución de trabajo y el valor asignado a δ 18O , previamente calibrado con respecto al V-SMOW. La corrección que se aplica a las muestras varía de forma lineal con respecto al sesgo del valor de las dos soluciones de trabajo que preceden y siguen a las muestras. La solución de trabajo se intercala al principio y al final de cada serie. De este modo, se puede calcular la corrección para cada muestra por interpolación entre dos valores (la diferencia entre el valor asignado y el valor medido de la solución de trabajo). Los resultados finales se expresan en ‰ y como valores δ18OV-SMOW. Los valores en δ18OV-SMOW se calculan según la fórmula siguiente: 18OV SMOW 18O 18O 16 16 O muestra O V SMOW 1000 ‰ 18O 16 O V SMOW El valor de δ18O normalizado respecto de la escala V-SMOW/SLAP se calcula según la fórmula siguiente: 18Omuestra 18OV SMOW 55,5 ‰ 18 18 O O V SMOW SLAP 18OV SMOW / SLAP El valor δ18OV-SMOW aceptado para SLAP es de -55,5 ‰ (véase el apartado 5.1.). 10. Validación del método Se llevó a cabo un estudio colaborativo a nivel internacional (Thomas y Jamin, 2009) para la validación del método. El límite de repetibilidad (r) es de 0,15 ‰ de media. El límite de reproducibilidad (R) es de 0,54 ‰ de media. Certificado conforme Bucarest, 7 de junio de 2013 El Director General de la OIV Secretario de la Asamblea general Federico CASTELLUCCI © OIV 2013 6 En el Anexo A se recogen los datos y resultados del estudio colaborativo a nivel internacional. 11. Bibliografía OIV-MA-AS1-08: Precisión de los métodos analíticos (Resolución 5/99) OIV-MA-AS1-09: Protocolo para la planificación, el desarrollo y la interpretación de los ensayos para la validación de los métodos de análisis (Resolución 6/2000) OIV-MA-AS2-12: Método de determinación de la relación de isótopos 18O/16O del agua en vinos y mostos Protocolo IUPAC de W. Horwitz, Pure Appl. Chem. 67 (2) (1995) 331 Thomas, F., Jamin, E. (2009). (2)H NMR and (13)C-IRMS analyses of acetic acid from vinegar, (18)O-IRMS analysis of water in vinegar: International collaborative study report. Analytica Chimica Acta, 649, 98-105 Certificado conforme Bucarest, 7 de junio de 2013 El Director General de la OIV Secretario de la Asamblea general Federico CASTELLUCCI © OIV 2013 7 ANEXO A RESULTADO DEL ESTUDIO COLABORATIVO A NIVEL INTERNACIONAL Este documento recoge los resultados del estudio de validación del método de análisis de la relación 18 O/16O en el agua del vinagre de vino (Thomas y Jamin, 2009). El estudio se ha llevado a cabo con arreglo al documento OIV-MA-AS1-08 y OIV-MA-AS1-09. 1. Laboratorios participantes En el estudio participaron 14 laboratorios: Bundesinstitut für Risikobewertung, Berlín Central Science Laboratory, York Custom Technical Laboratory, Praga Chemical Institute of the Hungarian Customs and Finance Guard, Budapest Eurofins, Nantes FEM-IASMA, San Michele all’Adige, Trento Joint Reasearch Center, Ispra Arbitral Agroalimentario Del MAPA, Madrid Landesuntersuchungsamt, Speyer Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit, Wurzburg Service Commun des Laboratoires, Burdeos Service Commun des Laboratoires, Montpellier Service Commun des Laboratoires, París Unione Italiana Vini, Verona Alemania Reino Unido Rep. Checa Hungría Francia Italia Italia España Alemania Alemania Francia Francia Francia Italia 2. Muestras El estudio se llevó a cabo sobre 5 muestras dobles ciegos: tres muestras de vinagre de vino (B, C, D), una muestra de vinagre de alcohol (A) y una muestra de vinagre de vino con un 20% de A (Thomas y Jamin, 2009). Para cada muestra, se analizó el 18C del agua. Los resultados se indican en la tabla siguiente. 3. Evaluación estadística Los cálculos estadísticos se realizaron con arreglo al protocolo OIV-MA-AS1-09, que se basa en el protocolo IUPAC de Horwitz. Los valores atípicos se eliminaron de la siguiente forma: prueba de Cochran para eliminar a los laboratorios con mayor varianza, prueba de Grubbs individual o por pares para los valores atípicos individuales o individuales por pares, después, una nueva prueba de Cochran, etc. manteniendo una proporción de valores atípicos <2/9. La desviación estándar para la repetibilidad (sr) y la reproducibilidad (sR) de cada material se calcula a partir de los pares de resultados válidos de los dobles ciegos. Para obtener más datos, consulte la publicación de Thomas y Jamin, 2009. Certificado conforme Bucarest, 7 de junio de 2013 El Director General de la OIV Secretario de la Asamblea general Federico CASTELLUCCI © OIV 2013 8 Descripción Núm. de de la resultados Núm. de muestra válidos repeticiones A 8 2 B 8 2 C 8 2 B+20 %A 8 2 D 5 2 Media δ18C (‰) -6,96 -0,86 -1,38 -1,79 -1,23 sr (‰) 0,06 0,08 0,02 0,05 0,05 Límite de repetibilidad r (2,8×Sr) ‰ 0,17 0,22 0,06 0,14 0,14 sR (‰) 0,22 0,21 0,2 0,2 0,14 Límite de reproducibilidad R (2,8× SR) ‰ 0,62 0,59 0,56 0,56 0,39 El límite de repetibilidad medio (r) es de 0,15 ‰ y el límite de reproducibilidad medio (R) es de 0,54 ‰, por lo que son comparables con los observados en el alcohol del vino (OIV-MA-AS2-12). Certificado conforme Bucarest, 7 de junio de 2013 El Director General de la OIV Secretario de la Asamblea general Federico CASTELLUCCI © OIV 2013 9