III. Material genético c. Código genético. EL CÓDIGO GENÉTICO Para este 1960 se conocían ya las estructuras del ADN y ARN. Se sabía que el ADN dirigía la síntesis del ARN (Trascripción). Y que el ARN dirigía la síntesis de proteínas a través del RNAt (Traducción). También estaba demostrado que las mutaciones en el DNA restringían la expresión de ciertas proteínas. Se sabía que el DNA se encontraba en el núcleo, mientras que el RNA era particularmente abundante en el citoplasma, donde se sintetizan las proteínas. HOW ??? Proteínas hechas de una combinación de 20 aminoácidos: El ADN consta de 4 nucleótidos: GCAT EL RNA consta también de 4 nucleótidos: GCAU - George Gamow (1954): Primer modelo basado en la reciente descripción de le doble hélice de Watson y Crick. En su propuesta original, a la que llamó “código diamante”, el DNA como tal funcionaba como el molde sobre el que se ensamblaban los aminoácidos para formar proteínas. “cada aminoácido debería estar codificado por un triplete específico de nucleótidos” CODON AAA, AAG, AAC, AAT - Sol Spiegelman (1961): AAA, AAG, AAC, AAU. - Severo Ochoa y Marianne Grimberg-Manago (1955), Kornberg y Ochoa Nóbel en 1959. Descubrieron la polinucleótido fosforilasa, con la cual logró sintetizar un RNA in vitro sin necesidad de molde. RNA poli-A, RNA poli-G, RNA poli-U - Marshal Warren Nirenberg et al., 1961: RNAm sintético constituido solamente por nucleótidos de uracilo poli-U. la primera palabra del código: UUU = fenilalanina 64 combinaciones posibles de tripletes -1 base/codón = 4 aa’s -2 bases/codón = 16 aa’s -3 bases/codón = 20 aa’s Descifran el código genético en junio de 1966 Formando codones o tripletes del RNAm para todos los aminoácidos 1961-1966 Nirenberg, Khorana, Holley, Ochoa y Grunger-Manago RNA polimerasa. Como se sospechaba cada triplete (codon) codificaba para un aminoácido. Ya que hay 4 ribonucleótidos entonces hay 64 codones. UUU-UUU-UUU-UUU CCC-CCC-CCC-CCC AAA-AAA-AAA-AAA UAU-UAU-UAU-UAU 1 = = = = Phe-Phe-Phe-Phe Pro-Pro-Pro-Pro Lys-Lys-Lys-Lys Tyr-Tyr-Tyr-Tyr UUU-AAA-UAU = Phe-Lys-Tyr 2 UUU-AAA-UAU-UUU-AAA-UAU = Phe-Lys-Tyr-Phe-Lys-Tyr UUU-AAA-UAA-UUU-AAA-UAU = Phe-Lys 3 UAA = Codon-STOP Ver experimento « Cracking the genetic code » Experimento desarrollado por Marshall Nirenberg y colaboradores para descifrar el código genético Código genético “universal” • Degenerado 43 = 64 codones: 61 para aa 3 nonsense STOP: UAA ("ocre") UAG ("ambar") UGA (“ópalo") START: Met ATG ó AUG ¾Hay excepciones al código restringidas a algunos procariotas y las mitocondrias Excepciones al codigo Las mitocondrias de animales y microorganismos (no plantas) utilizan UGA para codificar triptofano y no como un finalizador de síntesis. La mitocondria animal utiliza AUA para metionina, no isoleucina. Las mitocondrias de vertebrados utilizan AGA y AGG para finalizar síntesis (STOP). En las levaduras, las mitocondrias, asignan todos los codones que comienzan con CU para sintetizar treonina en lugar de leucina. En cambio, las mitocondrias de las plantas usan el código universal, lo que ha permitido a las angiospermas transferir genes mitocondriales al núcleo de manera muy natural. En procariotas el codon de inicio también puede ser: GUG y UUG. Por ejemplo, Escherichia coli, Enterobacteriaceae, emplea en un una 83% de los casos ATG (AUG en el ARN), 14% GTG (GUG en el transcrito) 3% TTG (UUG en el ARN) y aún algún otro. The distribution of start codons is as follows: ATG, 3542 GTG, 612 TTG, 130 There is also one ATT and possibly a CTG bacteria de la familia Código secuencial, sin puntuación o traslape El numero de codones para cada aminoacido no se correlaciona con su frecuencia de uso en proteinas Los aa mas sencillos son los mas representados → minimiza efecto por mutaciones E.g. CUC por CUG es Leucina o bien CUU por AUU es isoleucina, un aa relacionado. Aminoacil-RNAt-sintetasas (ARS): Activación del RNAt Existen dos tipos de ARS que tienen diferentes puntos de anclaje sobre la molécula de RNAt, dependiendo de la secuencia de esta última. Es así como la conformación espacial del RNAt habilita a alguna de las dos clases de ARS a unirse y pegar el aminoácido correspondiente. Clase I: Incorpora el aminoácido en el carbono 2’ de la ribosa en la adenina terminal 3’ Clase II: Incorpora el aminoácido en el carbono 3’ de la ribosa en la adenina terminal 3’ 3’ 5’ ARS Clase I A C C ARS Clase II 9 Más de un tipo de RNAt puede acarrear el mismo aminoácido Sitios de mayor especificidad involucrados en el reconocimiento y acoplamiento de las ARS. Sitios conservados que permiten que diferentes tipos de RNAt puedan portar el mismo aminoácido. Secuencia consenso (común) a todos los RNAt Si estas bases están en la primera posición (tambaleante) del anticodon…. Entonces el RNAt reconoce codones con estas bases en la tercera posición. Si estas bases están en la tercera posición (tambaleante) del codon…. Entonces el codon puede ser reconocido por un RNAt que tenga estas bases en la la primera posición del anticodon. Lectura de Prueba: Precisión RNAt-aa´s El reconocimiento del RNAt correcto esta pricipalmente controlado por la afinidad de la aminoacil-RNAt-sintetasa por su RNAt específico y además la aminoacilación del residuo de aa cuando no es el correcto es muy lenta. En resumen, la selección del aminoacido correcto esta favorecido sobre alguno incorrecto en un orden promedio de 250:1 Tasa de error Activación de la ARS con un aa incorrecto: 1/225 Incorporación del aa incorrecto al RNAt: 1/270 Tasa global de error: 1/60,000 Lectura de Prueba (Corrección mediante Proofreading) Mediante un cambio de conformación espacial en la ARS se promueve la hidrólisis del aa incorrecto o bien, una vez formado el complejo ARS-aa-RNAt, el aa incorrecto es hidrolizado RNAt supresores Cuando una mutación es capaz de restaurar otra mutación se habla de supresión. Por tanto un RNAt supresor es una molécula mutada de RNAt que tiene anticodones que pueden leer nuevos codones. Una mutación cambia un codon en el RNAm, de manera que el producto peptídico ya no es funcional. La mutación supresora cambia el anticodon en el RNAt de manera que reconoce el codon mutado asi como el codon original en el RNAm. RNAt supersor sin sentido (nonsense): Restaura mutaciones que hacen que un codon para un aminoacido cambie por un codon de terminación. RNAt supresor de sentido equivocado (missense): Restaura mutaciones que hacen que un codon para un aminoácido cambie por un codon para un aminoácido distinto. Supresores sin sentido (nonsense) La tabla muestra las mutaciones supresoras de los RNAt con el que contrarrestan la mutación del codon silvestre (wild type) evitando que la proteína deje de sintetizarse. Cuando el codon silvestre muta y se convierte en una señal de terminación, esta solo puede ser reconocida por un factor de liberación que separa las subunidades ribosomales y termina la síntesis de la proteína. El RNAt supresor compite con el factor de liberación y dada su mayor afinidad, este se incorpora y permite que la síntesis continúe. Si el aminoácido incorporado es el mismo que estaba antes no hay cambio en la función de la proteína. Si es un aminoácido nuevo, la actividad de la proteína puede verse reducida o alterada. Existe un tipo de RNAt supresor sin sentido que modificando su conformación espacial, le da mayor estabilidad a la hélice y esto hace que puedan aparearse bases sin seguir las reglas generales de la posición tambaleante (wobbling position) en el complejo codonanticodon. En algunos casos un RNAt supresor sin sentido puede provocar que un codon silvestre de terminación no sea reconocido. Al incorporarse al sitio de terminación, el RNAt supresor coloca un aminoácido evitando que el factor de liberación de las subunidades ribosómicas suspenda la síntesis de la proteína. Como consecuencia un supresor RNAt sin sentido puede promover que se produzcan proteínas de mayor longitud que las silvestres. Supresores de sentido equivocado (missense) • En este caso la mutación que genera que un codon coloque un aminoácido que no corresponde con la secuencia nativa de la proteína puede ser suprimida insertando un RNAt mutado que reconoce ese codon mutado insertando el aminoácido nativo o bien un aminoácido que no altere el funcionamiento de la proteína. • En sentido estricto cualquier alteración en la secuencia de aminoácidos constituye una mutación de sentido equivocado. Sin embargo, muchas de estos cambios no son evidenciados pues la redundancia del código, las supresiones con RNAt mutados y la potencial aceptación de un aminoácido que no altere drásticamente la función de la proteína, oculta muchos de los cambios y por tanto estos no pueden ser evidenciados. **Un supresor de sentido equivocado muy probablemente puede ser un promotor de mutaciones. Nada impide que un codon mutado pueda reconocer otros sitios normales y que se inserte un aminoácido incorrecto. La afinidad por los RNAt silvestres es mayor y de esta manera se reduce el potencial incremento en errores de incorporación por todos los supresores presentes. RNAt y su influencia en el marco de lectura El marco de lectura de un RNA mensajero es generalmente invariable, comenzando con un codon AUG y terminando en alguno de los codones de terminación. La lectura de este marco de lectura se realiza de corrido por lo que si hay una inserción o una deleción se produce un cambio en el marco de lecutra del punto de la mutación hacia delante. Esto produce que se traduzca el mensajero a una proteína completamente distinta. Un supresor de marco de lectura restablece el marco de lectura original compensando las deleciones y las inserciones en un gen. Sin embargo, tambien algunas moléculas de RNAt con propiedades aberrantes funcionan como supresores extragénicos de errores en el marco de lectura. Algunos errores originados del copiado del DNA quedan como repeticiones de ciertas bases y esto puede ser solventado por la presencia de anticodones aberrantes que reconocen 4 bases en lugar de 3. • Otra forma de solventar estos errores de desplazamiento o corrimiento del marco de lectura (generadas por inserciones) es mediante un mecanismo que se conoce como “reconocimiento de secuencias resbalosas” en las que el ribosoma puede saltarse o regresarse una base mientras incorpora aminoácidos a la cadena polipéptidica. • Esto quiere decir que la rara pero predecible ocurrencia de eventos de lectura errónea pueden ser considerados como necesarios para la traducción normal de algunos genes. • En la figura se aprecia como en ausencia del aminoácido raro Arginina (Arg) el ribosoma se resbala un ribonucléotido, leyendo de nuevo los tripletes. Esto permite la sintesís de un componente extra del péptido, gen que no hubiera sido traducido en presencia de arginina. RNA polimerasa III Membrana nuclear RNA polimerasa I DNA RNAt RNAhn RNA Polimerasa II aminoácidos RNAr Aminoacil-RNAt anticodon Riboproteína Ribonucleótidos Cadena polipeptídica en síntesis Poro nuclear codon RNAm Ribosoma 5 6 4 1 7 8 10 3 9 2 11 19 12 18 17 16 13 14 15