APLICACIÓN DE MÉTODOS MOLECULARES PARA DETERMINAR DIVERSIDAD MICROBIANA SULFOXIDANTE EN REACTORES DE CULTIVO CONTINUO E IDENTIFICACIÓN DE AISLADOS B. M. Pérez Ibarraa, A. Hamdan Partida, S. R. Moiseev, H. Ramírez Saad a Departamento de sistemas biológicos laboratorio de ecología molecular. Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco. Calzada del hueso No. 1100, Col. Villa Quietud, C. P. 23-181, D.F, México niqus@yahoo.com RESUMEN Los microorganismos sulfoxidantes provenientes de una comunidad bacteriana en reactores de cultivo continuo a diferentes condiciones de operación fueron aislados y caracterizados mediante técnicas de biología molecular para posteriormente, analizar su comportamiento como parte de un consorcio sometido a proceso de sulfoxidación en presencia de metanol. El proceso fue muestreado en diez tiempos para observar cambios en la comunidad bacteriana debidos a la presencia de metanol. Al analizar el patrón de bandas obtenido por DGGE muestra que la población predominante, en cada una de las muestras obtenidas, corresponde a la de los aislados y a la cepa control Thiobacillus ssp. INTRODUCCIÓN En los ecosistemas como sedimentos marinos, tapetes microbianos, y ventanas hidrotermales ocurren las transformaciones del azufre (sulfato reducción y sulfuro oxidación) recibe el nombre de ciclo sulfureta (Jorgensen, 1982; Van den Ende et al., 1997). En tales sistemas, la oxidación de HS- puede llevarse acabo tanto, por microorganismos aerobios como anaerobios fototrófo en presencia de luz. En la ausencia de luz, las bacterias incoloras del azufre también contribuyen en transferir el azufre. Dichos ecosistemas, tienen importancia científica por la presencia de microorganismos únicos y específicos, además de una importancia ambiental. Procesos biotecnológicos ambientales y el ciclo biológico del azufre Los biotratamientos son ampliamente empleados para tratar aguas municipales e industriales. Un biorreactor puede ser aerobio o anaerobio, dependiendo del agua a tratar, los microorganismos en el reactor actúan como biocatalizadores para degradan los compuestos orgánicos. Cada bioreactor es acoplado a un proceso de manufactura por tanto la composición del agua de desecho contribuye a seleccionar naturalmente la comunidad microbiana en el birreactor. Por ejemplo en fábricas de papel y pulpa los boirreactores encargados del tratamiento de sus aguas estarán enriquecidos de microorganismos celulolíticos y en el caso, de las refinerías de petróleo contendrá microorganismos degradadores de hidrocarburos. Conforme se modifican los procesos de manufactura la composición de las aguas de desecho pueden ir cambiando durante el tiempo, lo que hace que los microorganismos dentro del reactor se adapten. De este modo, la diversidad microbiana en el bioreactor proporciona un nuevo ambiente en el cual nuevas vías bioquímicas pueden desarrollarse; así los microorganismos en competencia pueden continuar explotando los recursos administrados por un corriente de agua de desecho alterada. Procesos de remoción de azufre Los procesos tecnológicos ambientales basados en el ciclo del azufre se apoyan en la formación de intermediarios insolubles, los cuales son separados de la fase acuosa. Como es de esperarse, los mismos intermediarios sólidos como esos que se acumulan en la naturaleza (CaSO 4, sulfuros metálicos, y azufre) se usan en tecnologías ambientales. En el proceso más viejo para la remoción de azufre llamado piedra caliza-yeso, los óxidos de azufre eran removidos de la fase gaseosa por el contacto de dicha fase con una solución sobresaturada de caliza induciendo así la formación de yeso. El yeso es usado en la construcción, pero debido a que contamina con metales pesados su uso es limitado. De este modo, grandes cantidades de este producto de desecho se forma y se requiere eliminar. El uso de sulfuros para producir precipitados de sulfuros metálicos es un proceso real para el tratamiento de aguas contaminadas con metales pesados. El sulfuro puede ser adicionado como compuesto químico o bien, puede ser producido en un biorreactor sulfato reductor. Los sulfuros metálicos necesitan extraerse de las aguas tratadas y además debe procesarse. Un proceso completo para la remoción de azufre de las aguas de desecho se basa en la formación de azufre elemental. En este proceso, el sulfuro es producido a partir óxidos de azufre en un biorreactor sulfato reductor. En un segundo biorreactor, el sulfuro es subsecuentemente convertido a azufre elemental vía oxidación biológica parcial. El azufre elemental, puede emplearse en la producción de ácido sulfúrico o en la elaboración de fertilizantes. De acuerdo, con lo aquí expuesto las comunidades microbianas poseen un gran potencial ya que, llevan acabo procesos importantes para el sostenimiento de la biosfera a escala global, soportando la vida de muchos otros organismos, y destruyendo muchos de los productos de desecho de la sociedad humana. Tal potencial, es explotado en los procesos biotecnológicos para el tratamiento de aguas residuales. Recientemente, se describió un amplio rango de bacterias sulfato reductoras autótrofas como también, heterótrofas capaces de crecer en condiciones extremas. Estas incluyen termofilos (Thermodesulfobacterium hvragerdense y thermodesulfovibrio islandicus; Sonne-Hansen y Ahring, 1999), psicrofilicos (Desulfofrigus fragila, Desulfofaba gelida, y Desulfotalea psychrophila; Knoblauch et al., 1999), halofilos (Desulfobacter halotolerans; Brandt y Ingvorsen, 1997) y alcalofilos (Desulfotomaculum alkliphilum; Pikuta et al. 2000). Muchos de estos extremofilos se han aislado de sedimentos marinos. El conocimiento de la comunidad bacteriana es la llave para entender procesos tales como, las semejanzas en evolución microbiana y biodiversidad para su posterior aplicación en la biodegradación y bioremediación. Por tal motivo, dado a que los ácido nucleicos se encuentran en todas las formas de vida, su propiedad de ácido nucleico y la diferencia en la secuencia de la estructura primaria es usada para detecciones especializadas en ambientes complejos. Actualmente, apoyados en estas nuevas herramientas se conocen catorce principales linajes (Reinos) de bacterias que se han definido sobre la base de la comparar la secuenciación del gen 16S rRNA de cultivos en laboratorio. Sin embargo, debe tomarse en cuenta que tales metodologías tiene limitaciones. Por ejemplo en los métodos de extracción de los ácido nucleicos de las muestras no se asegura la lisis de todos los microorganismos presentes así como, su recuperación intacta. Además, es importante su purificación para la eliminación de sustancias inhibidoras de la reacción de PCR o la acción de enzimas de restricción (Wilson I. G., 1997). Por otro lado, se ha reportado que la técnica de DGGE o TGGE pueden separar fragmentos pequeños, de hasta 500 pares de bases y esto limita la identificación filogenéticas. Aunque existen reportes sobre la posibilidad de separar secuencias que difieren en una sola base, también se ha reportado la dificultad de separar fragmentos que difieren en 2 o 3 bases (Vallaeys T. et al. 1997). Otras limitaciones de estas técnicas es el número máximo de bandas de DNA que puedan separarse, aunque se ha reportado la detección de poblaciones que constituyen el 1% de la comunidad por PCR-DGGE (Muyzer G. et al., 1993). En cuanto a los métodos In situ, puede ocurrir que no se detecte un microorganismo debido a una permeabilidad insuficiente o a la falta de acceso de las sondas a las regiones a las cuales debe unirse (Amann R. I., 1995). Sin embargo, los avances recientes en los métodos para el análisis de comunidades microbianas hacen posible complementase con los métodos tradicionales para obtener información sobre aspectos importante de la ecología microbiana ambiental desde varios aspectos diversidad, estructura y función. Además de obtenerse resultados en tiempos más cortos que los métodos clásicos de microbiología. MÉTODOS A partir de tres reactores con diferentes condiciones de operación se aislaron y caracterizaron tres cepas sulfoxidantes empleando tanto métodos clásicos de microbiología, composición de ácidos grasos así como 2 también técnicas de biología molecular (extracción DNA, amplificación del gen 16S rRNA por PCR, DGGE y por último secuenciación comparando con la base de datos GENBANK). Por otro lado, en un cuarto reactor alimentado con medio mineral, tiosulfato y metanol fue muestreado en diez tiempos para observar cambios en la comunidad bacteriana como consecuencia de la presencia de metanol. Se extrajo DNA de las cepas y del consorcio proveniente del reactor alimentado con metanol. Entonces el DNA extraído fue usado para amplificar la región del gen 16s rDNA empleando primers universales. Una vez determinadas las condiciones de amplificación se procedió a amplificar la región V6V8 del DNA. Para este PCR se adicionaron primers ricos en GC. Los productos obtenidos fueron colocados en el DGGE (ver fig 1y 2). Las diferentes muestras, tanto aislados como las tomadas del reactor fueron corridas simultáneamente para comparar los patrones de banda respectivos. ANÁLISIS DE RESULTADOS Los datos obtenidos de las diversas metodologías microbiologicas indican que las tres cepas comparten características morfológicas y fisiológicas muy similares. Por tanto, se procedió a la aplicación de herramientas moleculares que pudieran poner de manifiesto diferencias para así ser identificadas en género y especie obteniéndose lo siguiente: Cepas sulfoxidantes aisladas Thiobacillus sp UAM-I Cepa de referencia AIMP1 AUAM1 AR3 Comparación de secuencias con GenBank paquete Blast search Thiobacillus sp. UAM-I 16S ribosomal RNA gene, secuencia parcial Longitud= 1500 Identificación = (98%) Thiobacillus neapolitanus DSM 581 gen 16S ribosomal RNA, secuencia parcial Longitud= 1456 Identificación = (98%) Acinetobacter sp. ANT9054 gen 16S ribosomal RNA, secuencia parcial Longitud = 1486 Identificación = (91%) Thiobacillus neapolitanus DSM 581 gen16S ribosomal RNA, secuencia parcial Longitud= 1456 Identifica = 1205/1211 (99%), De acuerdo, con lo anterior se hace evidente la presencia de dos cepas iguales (Thiobacillus neapolitanus) y una cepas diferente (Acinetobacter sp) la cual, requiere su confirmación debido al porcentaje de similitud tan bajo. Por otro lado, en un cuarto reactor alimentado con medio mineral, tiosulfato y metanol se analizó tanto químicamente como molecularmente el comportamiento del consorcio sulfoxidante y se comparó con la huella genómica de los aislados mediante DGGE (ver fig 1y 2). Encontrándose un patrón de tres bandas A, B, y C que corresponden a una comunidad muy pobre, integrada por tres microorganismos. 3 La banda predominante B en cada una de las muestras obtenidas corresponde a la de los aislados. Cabe señalar que el patrón de bandas de los aislados muestra más de una banda lo cual, requiere ser investigado con más detalle, puesto que se trata de cepas pura. AUAM AR3 T0 T1 T2 T4 T5 T6 T8 T9 A B C AIMP Thiobacillus sp Fig. 1 Comportamiento del consorcio bacteriano sulfoxidante en un reactor de cultivo continuo alimentado con metanol *Formamida/urea 44%/52% Fig. 2 Huella genómica de aislados y comportamiento del consorcio bacteriano en presencia de metanol Al analizar el DGGE obtenido al correr los productos de PCR de la región V6-V8, tanto de los aislados como de las muestras tomadas del cuarto reactor, se observa que la población predominante, en cada una de las muestras obtenidas, corresponde a los aislados y a la cepa control Thiobacillus ssp. CONCLUSIONES A pesar de las pequeñas diferencias en composición de ácidos grasos, características morfológicas, y fisiológicas observadas entre los aislados, los análisis moleculares manifestaron diferencias ya que al analizar la secuencia del gen 16S rRNA de cada uno de los aislados, así como su comparación con el GeneBank indicó que: Las cepas AIMP1 y AR3 corresponden a un mismo microorganismo Thiobacillus napolitanus DSM 581 (98% y 99% de semejanza respectivamente). Cepa de referencia Thiobacillus sp. UAM-I La cepa AUAM1 corresponde a Acinetobacter sp. ANT9054. (95% semejanza) se requiere confirmar. En cuanto al analizar el DGGE obtenido tanto de los aislados como de las muestras tomadas del cuarto reactor, se observa que la población predominante, en cada una de las muestras obtenidas, corresponde a 4 la de los aislados y a la cepa de referencia Thiobacillus ssp. y que las tres bandas corresponden a una comunidad muy pobre integrada por tres poblaciones diferentes. BIBLIOGRAFÍA 1. Jorgensen, B. B. “Ecology of bacteria of the sulfur cycle with special referente to anoxic-oxic interface enviroments”. Phil. Tans. R. Soc. Lond B 298, 1982, pp.543-561. 2. Van den Ende, F. P., Meier, J. y Van Gemerden, H. “Syntrophic growth of sulfatereducing bacteria and colorless sulfur during oxygen limitation”. Fems Microbiol. Eco. 23, 1997, pp. 65-80. 3. Sonne-Hansen J. and Ahring B. K. “Thermodesulfobacterium hveragerdense sp. Nov. and Icelandic hot spring”. System. Appl. Microbiol. 22, 1999, pp. 559-564. 4. Knoblauch C., Sahm K and Jorgensen B.B “Psychrophilic sulfate-reducing bacteria isolate from permanently cold Arctic marine sediments: description of Desulfofrigrus oceanense gen. nov., sp nov., Desulfofrigus fragila sp. nov., Desulfofaba gelida sp nov, y Desulfotalea psychrophila gen. nov., sp y Desulfotalea arctica sp. nov.” Int. J. System. Bacteriol. 49, 1999, pp.1631-1643. 5. Brandt K. K. And Ingvorse K. “Desulfobacter halotolerans sp. nov., a halotolerant acetate-oxidizing sulfate-reducing bacterium isolated from sediments of Great Salt Lake, Utah”. System. Appl. Microbiol. 20, 1997, pp. 366-373. 6. Pikuta E., Lysenko A., Suzina N., Osipov G., Kuznetsov B, Tourova T, Akimenko V and Laurinavichius K. “Desulfotomaculum alkliphilum sp. nov., a new alkaliphic, moderately thermophilic, sulfate-redicing bacterium”. Int. J. System Evolut. Microbiol. 50, 2000, pp. 25-33. 7. Wilson I. G.,. “Inhibition and facilitation of nucleic acid amplification”. Appl. Environ. Microbiol. 63:10, 1997, pp. 3741-3751. 8. Vallaeys T., E. Topp, G. Muyzer, V. Macheret, G. Laguerre y G. Soulas. “Evaluation of denaturing gradient gel electrophoresis in the detection of 16S rDNA sequence variation in rhizobia and methanotrophs”. FEMS. Microbiol. Ecol. 24: 1997, pp. 279285. 9. Muyzer G. Waal EC, Uitterlinden AG. “Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrolisis analysis of polymerase chain reaction- amplified genes encoding for 16S r RNA”. Appl. Environ. Microbiol 59: 1993 pp. 695-700. 10. Amann, R. I. “Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation”. Microbiol. Rev. 59: 1995, pp.143-169. * Agradecimiento: CONACYT proyecto Z 019 por el financiamiento a esta investigación. Beatríz Mónica Pérez Ibarra es becaria CONACYT. 5