33466784.B-gal biologica II 2011

TPNº 1 – Química Biológica II – 2011
Regulación de la Expresión Genética
INTRODUCCION
En las Clases Teóricas hemos aprendido sobre los genes, cómo se replican y cómo se
transmiten. También hemos visto que la información contenida en los genes se transcribe a
ARN mensajeros y luego es traducida a proteínas. Además, la célula regula su
funcionamiento, pero… ¿Cómo decide la célula que proteínas necesita producir en cada
momento y qué cantidad de cada proteína es necesario sintetizar?
En los organismos pluricelulares con diferentes órganos y tejidos está claro que
existe un reparto de las funciones, de manera que las células de diferentes tejidos llevan a
cabo distintas misiones y para ello necesitan sintetizar diferentes tipos de proteínas. De
forma que un hepatocito (célula del hígado) produce una colección de proteínas diferentes a
las de una neurona. Por consiguiente, en los diferentes tejidos de un individuo pluricelular
adulto, se están expresando distintos grupos de genes.
En los organismos unicelulares, como las bacterias, también es necesario regular la
expresión de los genes adaptándola a las necesidades ambientales. Es importante para la
economía celular que la expresión de los genes sea regulada según las circunstancias
celulares. Un buen ejemplo de esta situación en bacterias es la regulación de las enzimas
implicadas en el metabolismo de los azúcares. Las bacterias pueden emplear para obtener
energía distintas fuentes de carbono, como la glucosa, lactosa, galactosa, maltosa, ramnosa
y xilosa. Existen proteínas transportadoras cada uno de estos azúcares en la bacteria y
enzimas capaces de metabolizarlos para obtener energía. Lógicamente, sería un derroche
energético producir simultáneamente todas las enzimas necesarias para metabolizar los
diferentes azúcares mencionados. Por consiguiente, es mucho más económico para la célula
producir solamente las enzimas necesarias en cada momento. Por ejemplo, si en el medio en
el que vive la bacteria la principal fuente de carbono es la lactosa, solamente se expresan los
genes necesarios para metabolizar dicho azúcar, mientras que los otros genes no se
expresan. Por lo tanto, es esencial que existan mecanismos de regulación de la expresión
génica, de manera que los genes se expresen cuando sean necesarios. Dentro de ellos
podemos distinguir en las bacterias dos categorías principales:
Mecanismos de regulación asociados a cambios genotípicos. Dentro de esta
categoría podemos incluir a:
I) variaciones hereditarias no asociadas con transferencia de material
genético, las cuales corresponden a diversos tipos de mutaciones;
II) variaciones hereditarias asociadas con transferencia de material
genético entre una bacteria donante y otra receptora, las cuales se producen
por transformación, conjugación o transducción.
Mecanismos de regulación para la adaptación al medio: son cambios moleculares
y fenotípicos que ocurren sin modificación del material hereditario (sin variación del
genotipo). Dichos mecanismos pueden darse por regulación a nivel de la transcripción o de la
traducción, regulando la síntesis de proteínas. Uno de los mecanismos mejor conocido es la
regulación a nivel de la transcripción. A continuación mencionaremos algunos conceptos
importantes sobre este tipo de regulación.
Algunos procesos metabólicos son necesarios para el funcionamiento normal de las
células. Por consiguiente, los genes que codifican para las enzimas necesarias para ese
metabolismo celular básico se están expresando continuamente, es decir, se expresan de
forma constitutiva o continua. Por tal motivo, a este tipo de genes se los denomina genes
constitutivos. Esto no significa que la actividad de los genes que se están expresando
continuamente no esté regulada, simplemente están sometidos a un tipo de regulación
diferente que hace que se estén expresando siempre. Los genes constitutivos codifican para
sistemas enzimáticos constitutivos, que se necesitan siempre para la actividad normal de
la célula.
Por otro lado, existen genes que se expresan solamente en determinadas situaciones
y que, por consiguiente, codifican para enzimas que solamente se necesitan en momentos
concretos. A este tipo de genes se les llama genes adaptativos y a las enzimas codificadas
por ellos, sistemas enzimáticos adaptativos. Se denominan así pensando en que se
expresan cuando la célula se adapta a una determinada situación ambiental. En algunos
libros de texto se denomina a este tipo de genes, “genes regulados”, sin embargo, esta
denominación no es demasiado buena, ya que así parece que son los únicos genes cuya
expresión está regulada.
1
Sistemas Inducibles y Sistemas Represibles
Sistemas inducibles: son aquellos en los cuales la presencia del sustrato de la
enzima provoca la síntesis de la misma. A este efecto del sustrato se le denomina inducción
positiva. El compuesto que desencadena la síntesis de la enzima se denomina inductor. La
mayoría de los sistemas inducibles se corresponden con procesos catabólicos, por ejemplo,
el operón lactosa, el operón arabinosa, el operón maltosa. Se trata de sistemas enzimáticos
encargados de degradar la lactosa, arabinosa, maltosa, etc.
Sistemas represibles: cuando el producto final de la reacción que cataliza la enzima
impide la síntesis de la misma. Este fenómeno recibe el nombre de inducción negativa. Al
compuesto que impide la síntesis de la enzima se lo denomina correpresor. Los sistemas
represibles se corresponden con procesos de síntesis o anabolismo, por ejemplo el operón
triptófano y el operón histidina. Se trata de las rutas metabólicas que conducen a la síntesis
de triptófano y a la síntesis de histidina.
Elementos del Operón
Jacob, Monod y colaboradores analizaron el sistema genético para el metabolismo de
la lactosa en Escherichia coli, de manera que los resultados de sus estudios permitieron
establecer el modelo genético del operón que permite comprender como tiene lugar la
regulación de la expresión génica en bacterias. Jacob y Monod recibieron en 1965 el Premio
Nobel por estas investigaciones.
“Operón es un grupo de genes estructurales cuya expresión está regulada por los mismos
elementos de control (promotor y operador) y los mismos genes reguladores”.
Los principales elementos que constituyen un operón son los siguientes:
•
•
•
•
Los genes estructurales: llevan información para la síntesis de los polipéptidos. Se
trata de los genes cuya expresión está regulada. Los operones bacterianos suelen
contener varios genes estructurales consecutivos, se los denomina poligénicos o
policistrónicos. Pero existen algunos operones bacterianos que tienen un solo gen
estructural. En su mayoría los operones eucarióticos contienen un sólo gen
estructural, denominados monocistrónicos.
El promotor (P): es una región del ADN con una secuencia que es reconocida por la
ARN polimerasa para comenzar la transcripción, y a su vez es un elemento de control.
Se encuentra antes de los genes estructurales. Abreviadamente se lo designa con la
letra P.
El operador (O): se trata de otro elemento de control, es una región del ADN con una
secuencia que es reconocida por la proteína reguladora. El operador se sitúa
normalmente entre la región promotora y los genes estructurales. Abreviadamente se
le designa por la letra O.
El gen regulador (i): secuencia de ADN que codifica para la proteína reguladora que
reconoce la secuencia de la región del operador. El gen regulador por lo general está
cerca de los genes estructurales del operón, pero no inmediatamente al lado.
Abreviadamente se le denomina gen i.
Elementos de control
Elementos del Operón en
bacterias.
Moléculas difusibles
Genes Estructurales
Gen regulador
Promotor
Operador
Proteínas reguladoras
Efectores
Inductores
Codifican para polipéptidos
Codifica para proteína reguladora
La regulación de la expresión génica más frecuente es la que involucra el inicio de la
transcripción. Las proteínas reguladoras o factores de transcripción influencian la unión de la
ARN-polimerasa a los distintos promotores y ejercen control induciendo o reprimiendo la
transcripción luego de unirse a secuencias específicas. Los promotores de genes distintos
varían en su secuencia y esto se refleja en un mayor o un menor nivel de la transcripción.
2
Control Positivo y Control Negativo
Control positivo: se dice que un sistema está bajo control positivo cuando el producto
del gen regulador activa la expresión de los genes, es decir actúa como un activador.
Control negativo: se dice que un sistema está bajo control negativo cuando el
producto del gen regulador reprime o impide la expresión de los genes, es decir actúa como
un represor.
EL OPERÓN LACTOSA: Sistema Inducible y de Control Negativo
El operón lactosa, que abreviadamente se denomina operón lac, es un sistema
inducible que está bajo control negativo, es decir que la proteína reguladora (producto del
gen i), es un represor que impide la expresión de los genes estructurales en ausencia del
inductor. El inductor del sistema es el sustrato, la lactosa. Los genes estructurales del operón
lactosa son los siguientes:
•
•
•
El gen Z+: codifica para la β-galactosidasa que cataliza la hidrólisis de la lactosa en
glucosa y galactosa.
El gen Y+: codifica para la galactósido permeasa que transporta β-galactósidos al
interior de la célula bacteriana.
El gen A+: codifica para la tiogalactósido transacetilasa que cataliza la
transferencia del grupo acetil del acetil Coenzima A al 6-OH de un aceptor
tiogalactósido. Este gen no está relacionado con el metabolismo de la lactosa.
En los estudios del operón lactosa se utiliza como inductor un análogo sintético de la
lactosa que es el isopropil tiogalactósido (IPTG). El IPTG tiene la ventaja que no necesita
ser transportado por la galactósido permeasa para entrar en la bacteria y por otro lado no es
metabolizado por la enzima, por lo que actúa como inductor permanente.
El operón lac en E. coli es inducible, de manera que en ausencia de lactosa (inductor),
la proteína represora producto del gen i se encuentra unida a la región operadora, impide la
unión de la ARN-polimerasa a la región promotora y, como consecuencia, no se transcriben
los genes estructurales (Fig 1).
Fig 1: Estado del operón lactosa en ausencia de inductor.
3
La presencia del inductor (lactosa) hace que se expresen los genes estructurales del
operón, necesarios para metabolizar la lactosa (Fig 2). La lactosa se une a la proteína
reguladora, la que cambia su conformación y se suelta de la región operadora dejando
acceso libre a la ARN-polimerasa para que se una a la región promotora y se transcriban los
genes estructurales.
También es conveniente notar que los tres genes estructurales del operón lactosa se
transcriben juntos en un mismo ARNm, es decir que los ARN mensajeros de bacterias suelen
ser policistrónicos, poligénicos o multigénicos. Sin embargo, en eucariontes los
mensajeros suelen sen monocistrónicos o monogénicos, es decir, corresponden a la
transcripción de un solo gen estructural.
En el trabajo práctico de expresión y purificación de proteínas recombinantes veremos
como la regulación del operon lac sirve para controlar la expresión de proteínas de una
manera muy eficiente.
Fig 2: Estado del operón lactosa en presencia del inductor.
OBJETIVO DEL TRABAJO PRACTICO
En el transcurso del Trabajo Práctico determinaremos la transcripción (o expresión) de
dos operones de la bacteria E. coli mediante una estrategia muy utilizada, en la cual la
secuencia de ADN correspondiente al promotor del gen a estudiar se fusiona con los genes
estructurales del operón lactosa. Esta técnica permite seguir la expresión del gen en estudio,
determinando la actividad β-galactosidasa, la cual es cuantificable mediante un ensayo
sencillo y sensible.
La actividad β-galactosidasa es usualmente ensayada por un método
espectrofotométrico, en el cual la enzima hidroliza a un sustrato sintético cromogénico
(homólogo a la lactosa), el ONPG (o-nitrofenil-β-D-galactopiranosil-D-glucosa), el cual al
hidrolizarse da o-nitrofenol, compuesto de color amarillo cuya absorbancia se lee a 420 nm.
Este método fue descripto por Miller en el año 1992.
Se determinará la expresión del operón sdhCDAB que codifica para la enzima del
ciclo de Krebs, succinato deshidrogenada (Fig 3), esta enzima tiene dos subunidades
catalíticas (SdhA, SdhB) más dos subunidades de membrana (SdhC, SdhD). Además se
determinará la expresión del operón copA que codifica para la enzima CopA, presente en la
membrana de la célula bacteriana, y transporta de manera activa el cobre a través de la
membrana, con hidrólisis de ATP (Fig 4).
4
Operon sdh CDAB
P
O
P
O
sdhD
sdhC
sdhA
sdhB
lacY
lacA
A
lacZ
B
Fusión sdh- lacZ
Fig 3: A) Esquema del operón sdhCDAB y B) de la fusión del promotor sdh con el operón lac.
P
O
P
O
copA
A
lacZ
lacY
lacA
B
Fig 4: A) Esquema del operón copA y B) de la fusión del promotor copA con el operón lac.
PARTE EXPERIMENTAL
Se utilizarán cultivos de las cepas bacterianas que contienen las fusiones de cada uno
de los promotores con el operón lac. Las bacterias crecerán durante 2 horas a 37 ºC en
medio rico, LB (Luria Broth), con agitación y luego cada cultivo se dividirá en dos. Una mitad
se incubará durante una hora con sulfato de cobre 500 μM y la otra mitad se usará como
control sin cobre. Transcurrido el tiempo de incubación se determinará la actividad βgalactosidasa en cada fracción.
Cepas de E. coli a utilizar:
TSDH00 (MC4100 λ[Φ (PsdhC-lacZ)]) (contiene la fusión del promotor sdh con el sistema
lac).
WOII260E (BW25113 λ[Φ (PcopA-lacZ)]) (contiene la fusión del promotor copA con el sistema
lac).
Medición de la actividad β-galactosidasa
En primer lugar se determina la absorbancia del cultivo a 560 nm (la cual debe estar
entre 0,3 y 0,8), si esto no es así se deben realizar las diluciones necesarias para obtener
dicha absorbancia.
Luego, en un tubo se agrega:
• 900 µl de buffer Z +
• 100 µl del cultivo bacteriano (A560nm entre 0,3-0,8)
5
•
•
15 µl de cloroformo
15 µl de SDS (dodecilsulfato sódico) al 0,1%
Se agita vigorosamente y se incuba 15 min a temperatura ambiente
• Luego se adiciona 200 µl de ONPG (4 mg ml -1)
Se incuba a 28°C hasta la aparición del color amarillo (IMPORTANTE: medir este tiempo con
cronómetro). Si la reacción es lenta, se incuba durante un período máximo de 20 min.
•
La reacción se detiene adicionando 500 µl de Na 2CO3 1 M que
desnaturaliza a la enzima y aumenta la intensidad del color.
Se determina la absorbancia a 420 y a 550 nm.
El buffer Z tiene altas concentraciones de β-mercaptoetanol el cual protege a la
enzima cuando es liberada al medio cuando las células se permeabilizan por el agregado de
cloroformo y el SDS. La reacción se detiene por la desnaturalización de la enzima por el
agregado del Na2CO3.
La actividad enzimática se expresa como UNIDADES MILLER (UM) y se calcula
según la siguiente fórmula.
A420 − (1,75 x A550)
UM=
x 1000
T x V x A560
Donde T es el tiempo de reacción en min, V es el volumen de cultivo ensayado en ml
(0,1 en nuestro caso). 1,75 es el factor que corrige la absorbancia a 550 nm (A 550). El uso de
ésta fórmula permite normalizar la actividad enzimática para la absorbancia del cultivo (A 560) y
para la absorbancia residual después de la permeabilización (A 550).
Soluciones para determinar actividad de β-galactosidasa
- ONPG 4 mg ml-1 en agua bidestilada (guardado en heladera).
- Na2CO3 1 M en agua bidestilada (guardado en heladera).
-Buffer Z: Na2HPO4 0,06 M; NaH2PO4.2H2O 0,04 M; KCl 0,01 M; MgSO 4.7H2O 0,001 M; βmercaptoetanol 0,05 M, pH 7.
- SDS 0,1 %.
- Cloroformo.
6