ESTUDIO DE RESTOS FETALES MEDIANTE ARRAYS

 ESTUDIO DE RESTOS FETALES MEDIANTE ARRAYS
DE CGH (POC-Products of Conception)
1.‐ Presentación. ¿Qué es? Los arrays de CGH permiten el estudio de los 24 cromosomas para descartar aneuploidías en restos fetales. Las aneuploidías son alteraciones en el número de cromosomas que pueden producir abortos espontáneos y cromosomopatías en recién nacidos. En parejas que se someten a tratamientos de reproducción asistida las aneuploidías también pueden dar lugar a fracaso reproductivo tras realizar un tratamiento. 2‐ Objetivo. ¿Para qué sirve? En las parejas en las que se ha producido un aborto espontáneo es crucial conocer la causa que ha llevado a la pérdida gestacional. Entre las diferentes causas que pueden producir un aborto espontáneo destaca la presencia de anomalías cromosómicas. Sabemos que más del 50% de las pérdidas gestacionales en el primer trimestre, tanto en gestaciones espontáneas como en tratamientos de reproducción asistida, son debidas a anomalías cromosómicas (Martínez et al., 2010; Campos‐Galindo et al., 2012). Por este motivo, el estudio genético de las muestras procedentes de pérdidas gestacionales es una herramienta crucial en parejas con gestaciones detenidas para establecer su etiología y aportar asesoramiento reproductivo a la pareja, así como plantearse futuros tratamientos de reproducción asistida en los que se incluya la posibilidad de analizar el contenido cromosómico de los embriones. Los arrays de CGH permiten descartar anomalías para los 24 cromosomas y se pueden aplicar al estudio de alteraciones cromosómicas numéricas en restos abortivos. El estudio complementario de marcadores en sangre materna nos permite diagnosticar con mayor certeza los casos con resultados 46,XX (Lathi et al., 2014). 3.‐ Indicaciones. ¿Para quién? El estudio cromosómico de los restos abortivos estaría indicado en cualquier pareja que haya sufrido una pérdida gestacional, pero es de vital importancia en aquellas parejas que hayan experimentado abortos recurrentes o en parejas que se sometan a tratamientos de reproducción asistida (Hodes‐Wertz et al., 2012). 4.‐ Ventajas. ¿Qué ventajas sobre otros test? No necesita cultivo. Hasta ahora, el estudio citogenético clásico de los restos fetales, se ha llevado a cabo mediante el cultivo celular de los mismos. Sin embargo, la tasa de fracaso (no crecimiento) en este tipo de cultivos es de hasta el 42% debido a la degradación del tejido, por lo que en estos casos no se puede obtener resultados. Por este motivo, en los últimos años se han desarrollado técnicas moleculares que nos permiten realizar una extracción directa de ADN del tejido sin necesidad de cultivarlo, y a partir de este ADN, podemos analizar el contenido cromosómico de este tejido. Resultados en más del 98% de las muestras analizadas: esta técnica nos ha permitido realizar un diagnóstico genético en prácticamente el 100 % de los tejidos abortivos analizados. Descartar presencia de contaminación materna. En todos los casos en los que se observe un resultado femenino normal en el ADN fetal, se realizará un estudio adicional para descartar un posible diagnóstico erróneo por la posible contaminación con células maternas presentes en la muestra de restos fetales. Con este estudio aumentamos considerablemente la fiabilidad de la técnica, reduciendo los posibles www.igenomix.com falsos negativos, que en el caso de análisis de restos abortivos realizados mediante cariotipo convencional, alcanzan un 33.3% de las muestras analizadas. 5.‐ Muestra. ¿Cómo? La muestra de restos fetales se puede obtener mediante biopsia dirigida tras histeroembrioscopia, recogiéndose y transportándose en un tubo cónico (≈ 10mL) con suero fisiológico estéril. En el caso de que la muestra proceda de un legrado convencional, se recogerá en un frasco de orina evitando en la medida de lo posible material de origen materno. Es necesario adjuntar 5 ml de sangre materna extraídos en tubo EDTA. Imagen A – Toma de muestra correcta Imagen B – Toma de muestra incorrecta 6.‐ Envío. ¿Cómo, cuándo, dónde y quién? La muestra se transporta en tubo o frasco de orina sellado, a temperatura ambiente y con la protección adecuada. La muestra debe enviarse en el transcurso máximo de 1 semana, manteniéndose entre tanto a 4 ◦C en el lugar de origen. La dirección de entrega es: España: IGENOMIX, Laboratorio DGP cromosómico, Parc Cientific Universitat de Valencia, C/ Catedrático Agustín Escardino, n99, 46980 Paterna (Valencia). Latam: IGENOMIX Latam 7955 NW 12th St.Suite 415 Miami, Florida 33126 USA 7.‐ Procesamiento de muestras y entrega de resultados. ¿Cuándo? El protocolo en el laboratorio requiere unas 24‐48 horas, estableciéndose una semana como límite máximo de entrega de resultados. 8.‐ Metodología Las principales etapas del ensayo de arrays de CGH son: 1) Obtención del ADN genómico 2) Marcaje del ADN de muestra y los ADN de referencia (masculino y femenino) con fluoróforos Cy3 y Cy5. 3) Combinación del ADN marcado. 4) Hibridación del ADN marcado con los arrays de CGH 24sureV3TM. 5) Lavado de los arrays de CGH y escaneo de los mismos 6) Análisis de las imágenes mediante el software BlueFuseMulti 3.2 7) Interpretación de resultados www.igenomix.com Hibridación ADN restofetal ADN marcado ADN hibridado en array Análisis del array CGH RESULTADOS 46, XX Estudio marcadores Marcaje de ADN Lavado 8) Para descartar contaminación materna en los casos con resultado femenino normal, se realizará en todos los casos la extracción de ADN de una muestra de sangre de la madre para realizar la amplificación de 16 marcadores polimórficos utilizando el kit AmpFISTR Identifier Plus de Applied Biosystems y se analizarán mediante electroforesis capilar. El resultado de la muestra materna se comparará con el obtenido aplicando la misma técnica en el ADN fetal. 9.‐ Limitaciones de la técnica Esta técnica no detecta alteraciones cromosómicas estructurales equilibradas y puede no detectar: aneuploidías en mosaico de bajo grado, dotaciones cromosómicas triploides/tetraploides, disomías uniparentales y deleciones o duplicaciones de tamaño inferior a 6 Mb. 10.‐ ¿Cómo comenzar? España: contacte con info@igenomix.com Latam: info‐america@igenomix.com 11.‐ FAQ`s ¿Puedo enviar la muestra en medio de cultivo? Sí, en medio de cultivo específico para el tipo de tejido del que se trata. ¿Puedo enviar la muestra en frasco de orina? Preferentemente deben enviarse en tubo bien sellado con parafilm. En su defecto puede usarse frasco de orina. ¿Se puede llevar a cabo este análisis en legrados convencionales? Si una vez recibida la muestra somos capaces de distinguir y separar tejido fetal de tejido materno, la determinación es posible. El problema de un legrado convencional es el alto riesgo de contaminación con tejido materno. Por este motivo, en todos los casos en los que tras realizar el estudio de arrays el resultado sea femenino normal, se realizará un test adicional para descartar posibles falsos negativos por contaminación materna. Para ello solicitaremos una extracción de sangre materna (en tubo con EDTA) para estudiar marcadores polimórficos y confirmar que el ADN analizado es de origen exclusivamente fetal. ¿Es válido en casos de embarazos múltiples? Sí. En ese caso será necesario enviar una muestra de cada uno de los fetos en tubos separados, junto con un único tubo de sangre de la madre. www.igenomix.com REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
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