INGENASA INgezim PPV R.11.PPV.K1 INgezim PPV está basado en la técnica de ELISA indirecto que utiliza un anticuerpo monoclonal (AcM) específico de inmunoglobulinas porcinas (Igs), y antígeno recombinante (proteína VP2 de PPV). BASE TÉCNICA DEL KIT 1. Las placas se suministran tapizadas con antígeno de PPV (cápsidas recombinantes de proteína VP2). Las muestras de suero se añaden en los pocillos y se incuban. 2. Si las muestras contienen anticuerpos específicos de PPV, éstos se unirán al antígeno. 3. Cuando se añade un AcM-PO específico de inmunoglobulinas porcinas, éste se unirá a las Igs unidas al antígeno. Esta unión se revela mediante reacción colorimétrica tras adición de substrato. PLACAS TAPIZADAS CON PPV ADICIÓN DE MUESTRA LAVADO APLICACIÓN Detección y/o titulación de anticuerpos específicos de PPV en muestras de suero porcino. ADICIÓN DE CONJUGADO INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS LAVADO El ensayo establece un Cut Off. Las muestras con un valor de DO superior al Cut Off se consideran Positivas, y las muestras con un valor de DO inferior al Cut Off se consideran Negativas. El título de la muestra será la última dilución de la misma que presente un valor de DO mayor que el cut off. ADICIÓN DE SUSTRATO POSITIVO NEGATIVO SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD 1. Correspondencia con la técnica de referencia IHA (Inhibición de la Hemaglutinación) Con objeto de determinar la sensibilidad y especificidad de INgezim respecto a la técnica IHA, se analizaron 238 sueros de animales de campo. 3. Sensibilidad utilizando sueros de animales vacunados experimentalmente A partir de animales vacunados experimentalmente, se obtuvo el perfil de detección de anticuerpos de este ensayo. En el mismo estudio se llevó a cabo una comparación con la técnica IHA. Los resultados obtenidos se muestran en la siguiente figura. D e t e r mi na c i ó n d e l t í t ul o d e a nt i c ue r p o s p o r E LI S A e I HA SENSIBILIDAD ESPECIFICIDAD 99.5% 100% 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 2. Sensibilidad analítica En la segunda semana post-infección, el ensayo puede detectar títulos de anticuerpos en torno a 1/200. TIT UL O D E E LIS A (log del factor de dilu cción) TITULOS DE ELISA POST INFECCION 5 4 3 0 0 28 49 D í a s p o s t v a c un a c ió n ELISA IHA 4. Especificidad utilizando animales SPF Con objeto de determinar la especificidad del ensayo, se utilizó un panel de 188 animales negativos SPF. Los resultados obtenidos indicaron que la especificidad del ensayo era del 100%. 2 1 0 0 5 10 15 20 25 30 35 Días post infección Serie1 Serie2 Serie3 Serie4 Serie5 Serie6 Serie7 40 5. Titulación a pocillo único Es posible obtener un título aproximado del suero basándose en el valor de su DO, mediante el uso de una fórmula que corresponde a una curva exponencial. COMPOSICION DEL KIT PRODUCTO FABRICADO POR INGENASA REGISTRO Nº 1129-RD Placas de microtitulación de 96 pocillos Viales con Control Positivo Viales con Control Negativo Viales con Conjugado de Peroxidasa Frasco con Solución de Lavado Frasco con Diluyente Frasco con Substrato (ABTS) Frasco con Tampón Sustrato Frasco con Solución de Frenado IT-73840 IT-73780 CADUCIDAD: 9191.INGE 9175.ING2 18 meses Conservado a 2ºC-8ºC Ed.100114 INMUNOLOGÍA Y GENÉTICA APLICADA, SA – C/ Hermanos García Noblejas, 39 – 28037 MADRID (SPAIN) – Tel (+34) 91 368 0501 www.ingenasa.com INGENASA INgezim PPV R.11.PPV.K1 INgezim PPV is based on an indirect ELISA technique, which uses a monoclonal antibody (MAb) specific to porcine immunoglobulines (Igs), and recombinant antigen (VP2 protein of PPV). TECHNICAL BASIS OF THE KIT 1. PLATES COATED WITH PPV 2. SAMPLE ADDITION 3. WASHING CONJUGATE ADDITION Plates are coated with PPV antigen (recombinant capsides of VP2). Sera samples are added and incubated. If the samples contain antibodies specific to PPV, they will bind to the antigen. When a MAb-PO specific of porcine immunoglobulines is added, it will bind to the Igs bound to the antigen. The binding is detected by the development of a colorimetric reaction after the addition of the substrate. APPLICATION Detection and /or titration of specific antibodies to PPV in porcine sera samples. WASHING INTERPRETATION OF THE RESULTS There is one Cut Off for the results interpretation. Samples with an OD higher than the Cut Off value are positive and samples with an OD lower than theCut Off value are negative. The titter of the sample will be the last dilution of the sample showing an OD higher than the Cut Off value. SUSTRATE ADDITION POSITIVE NEGATIVE SENSITIVITY AND SPECIFICITY 1. Correspondence with the reference technique IHA (Inhibition of haemaglutination) 238 field sera were analysed, to determine the sensitivity and the specificity of INGEZIM PPV ELISA technique in relation to the IHA technique 3. Sensitivity using experimentally vaccinated sera. Experimentally vaccinated animals were used and the antibodies detection profile was obtained. In the same study, a comparison with the IHA results was made. The results are represented in the following figure. A n t ib o d ie s t it r e b y E L IS A a n d IH A 4 ,5 SENSITIVITY Titre (Dilution factor log) 4 SPECIFICITY 99.5% 100% 3 ,5 3 2 ,5 2 1 ,5 1 0 ,5 0 0 2 8 D a y s E L IS A 2. Analytical sensitivity On the second week post infection, the assay can detect titres of antibodies around 1/200. ELISA TITRE (dilution factor log) POST INFECTION ELISA TITRES 4 3 2 1 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Days post infection 4. Specificity using SPF animals In order to determine the specificity of the assay, a set of 188 SPF negative animals was used. The results obtained indicated 100% specificity. Serie2 Serie3 Serie4 Serie5 Serie6 Serie7 5. One well titration of sera It is possible to obtain an approximated titre of the sera based on its OD value, by using a formula which corresponds with an exponential curve. PRODUCT MANUFACTURED BY INGENASA REGISTRATION NUMBER: 1129 RD COMPOSITION OF THE KIT IH A 5 0 Serie1 4 9 p o s t v a c c in a t io n Microtitration plates of 96 wells coated with Ag Vials with Positive Control Vials with Negative Control Vials with Peroxidase Conjugate Bottle with Washing Solution Bottle with Diluent Bottle with Substrate (ABTS) Bottle with Substrate Buffer Bottle with Stop Solution IT-73840 IT-73780 9191.INGE SHELF LIFE: 9175.ING2 18 months Stored at 2ºC-8ºC Ed.100114 INMUNOLOGÍA Y GENÉTICA APLICADA, SA – C/ Hermanos García Noblejas, 39 – 28037 MADRID (SPAIN) – Tel (+34) 91 368 0501 www.ingenasa.com