reacción enzimática en medio homogéneo y en micelas inversas de

REACCIÓN ENZIMÁTICA EN MEDIO HOMOGÉNEO Y EN MICELAS
INVERSAS DE AOT. EFECTO DEL CONFINAMIENTO
E. SETIEN, J. J. SILBER, N. M. CORREA, F. MOYANO
Departamento de Química, Universidad Nacional de Río Cuarto, Río Cuarto, Córdoba, CP 5800, Argentina.
fmoyano@exa.unrc.edu.ar
INTRODUCCIÓN
METODOLOGÍA
Las micelas inversas son agregados que se obtienen
disolviendo moléculas de surfactantes en un solvente
orgánico no polar. Su estructura es tal que los grupos
cabezas polares del surfactante constituyen el corazón
polar del agregado mientras que las colas
hidrocarbonadas se extienden hacia la solución orgánica
no polar. Dentro de los surfactantes capaces de formar
micelas inversas se destacan el aniónico dioctil
sulfosuccinato de sodio (AOT).1 La cantidad de solvente
polar disuelta en una micela inversa se la define con el
parámetro Ws = [Solvente Polar]/[Surfactante]. Desde
hace unos años2 se ha comenzado ha encapsular
solventes polares tales como: dimetil sulfoxido (DMSO),
etilen glicol (EG), formamida (FA), glicerol (Gly),
propilen glicol (PG), dimetilformamida (DMF),
dimetilacetamida (DMA).
Estos sistemas organizados son llamados “micelas
inversas no acuosas”. El solvente polar, es acomodado en
el centro polar del agregado donde se forma una gota o
"laguna polar", de forma esférica rodeada por el
surfactante. De esta manera, las micelas inversas ofrecen
la posibilidad de disolver diferentes enzimas en su
corazón polar y/o modificar el microambiente (mezcla de
solventes polares) con lo cual traerá aparejado un cambio
en la actividad catalítica y/o estabilidad de las mismas.3
Por tal motivo, estudiar reacciones químicas enzimáticas
en las micelas inversas como medios de reacción y
determinar los parámetros cinéticos de interés (eficiencia
catalítica, Kcat/ KM) reviste de gran importancia para
poder potenciar aplicaciones en la catálisis micelar.4
Al disolver el sustrato en micelas inversas, el mismo
puede repartirse entre las micelas y el solvente orgánico
polar. Con lo cual, existe una partición que modifica la
concentración efectiva del sustrato que debe ser tenida en
cuenta para determinar los parámetros cinéticos de
interés. Además, para poder comprar la eficiencia
catalítica de las micelas con el medio homogéneo, es
necesario determinar la partición del sustrato sin la
presencia del surfactante. Es decir, determinar la
partición del solvente o mezcla de solvente encapsulado
con el solvente orgánico no polar.
Se mostrarán los resultados obtenidos de la reacción
enzimática tanto en medio homogéneo como medio
micelar, determinando la eficiencia catalítica de ambos
medios de reacción.
Todos los solventes utilizados (dimetil sulfoxido,
DMSO y heptano, Hp) son de calidad HPLC, Sintorgan.
El agua utilizada es ultrapura y se la obtuvo de un equipo
Labonco 90901-01. El sustrato de estudio es el BenzoilTirosina-p-nitroanilida (Bz-Try-pNA) compradas en
Sigma-Aldrich. El surfactante utilizado fue el 1,4-bis (2etilexil) sulfosuccinato de sodio (AOT). Se lo seco al
vacío, con P 2 O 5 en un desecador durante dos días. La
enzima utilizada es la α-Chymiotrypsin obtenida de
páncreas bovino, Sigma y se obtuvo comercialmente.
Las experiencias de absorción fueron realizadas en un
UV-visible: Hewlett- Packard HP 8453 a 25,0 °C. El
paso óptico utilizado en las experiencias de absorción fue
de 1 cm.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Se estudio la siguiente reacción de hidrólisis
enzimática, empleando la enzima α-chymiotrypsin (αCT) y el sustrato benzoil-Tirosina-p-nitroanilida (BzTry-p-Na) en diferentes medio. Se trabajo en medio
homogéneo y en micelas inversas de AOT.
O
O
C
C
NH
HO
CH2 CH
α-CT
C
NH
O
Bz-Try-pNA
NO2
HO
H2O-DMSO
NH2
NH
CH2 CH
C
O
OH
+
NO2
pNA
a) Estudio en medio homogéneo
Como la solubilidad del sustrato en DMSO es
elevada, se trabajo con diferentes composiciones de
mezclas de agua-DMSO (20%, 30%, 50%), con el fin de
determinar cual es el rol que cumple el solvente orgánico
polar en la catálisis enzimática.
La Figura 1 muestra los perfiles de los espectros de
absorción y el avance de la reacción en la mezcla 20% de
agua-DMSO. De la Figura1 puede observarse que existe
un punto isosbestico a λ = 345 nm evidenciando la
ausencia
de
intermediarios
o
productos
de
descomposición en la reacción. La banda que aparece a λ
= 386 nm es la correspondiente al producto de hidrólisis
p-NA. Se empleó el método de la velocidad inicial y el
modelo de Michaelis-Menten para determinar la
eficiencia catalítica (K cat / K M ), en la mezcla. En la Tabla
1, se muestran los datos de la eficiencia catalítica
corregida (K cat / K M ) corr por la partición del sustrato entre
el solvente polar (agua-DMSO) y el solvente orgánico no
polar (heptano). Dicha eficiencia corregida permite ser
comparada con la que se determinará en las micelas
inversas de AOT.
0,25
Absorbancia
0,20
0,15
[p-NA]
Tiempo(seg)
0
180
360
540
720
1080
1260
1440
1800
2160
2340
0,10
300
350
400
450
500
λ (nm)
Figura 1. Espectros de absorción de la Bz-Try-p-NA con
el balance de la reacción. [α-CT] = 1x10-6 M. [Bz-Try-pNA] = 1x 10-5 M.
Tabla 1. Eficiencia catalítica K cat / K M de la enzima en
medio homogéneo y en micelas inversas de aguaDMSO/AOT/heptano. a,b valores de kp correspondiente
al medio homogéneo y medio micelar, respectivamente.
%
Kp
(K cat /
(K cat / K M ) corr
K M ) corr
aguaen medio
en
medio micelar
DMSO
homogéneo
4.79a
1.04x106
2.63 x 104
10.59b
30
12.48a
2908
--b
50
20.29
ND
6.20 x 104
Se puede observar claramente que a medida que
aumento la concentración de DMSO en la mezcla, la
reacción se va haciendo cada vez más lenta. Es más, llega
un porcentaje de mezcla que no se observan cambios
significativos en los espectros de absorción durante el
periodo de 24 hs (ND). Una posible explicación es que al
aumentar la concentración de DMSO, el solvente
compite con el agua por solvatar sitios activos hasta
llegar un punto en que inhibe la actividad catalítica de la
enzima.
Con el objetivo de evaluar la eficiencia catalítica de
la enzima y el rol del DMSO en medios confinados, se
estudio la reacción de hidrólisis en micelas inversas de
agua-DMSO/AOT/heptano.
b) Estudio en micelas inversas de aguaDMSO/AOT/heptano
Se estudio la reacción de hidrólisis encapsulando
agua-DMSO, en condiciones idénticas a las del medio
homogéneo. Es decir, encapsulando mezclas de aguaDMSO de 20% y 50% en micelas inversas de AOT.
20
k1
E
+ S
kcat
E- S
E
+ P
k-1
Kp
SHeptano
0,05
0,00
250
Si bien los datos cinéticos pueden ser tratados
mediante el mecanismo de Michaelis-Menten, es preciso
hacer notar que existe un equilibrio de partición del
sustrato (Bz-Try-p-NA) entre la micela y el solvente
externo no polar que modifica la concentración efectiva
del sustrato en la reacción y debe ser tenida en cuenta.
Se determinó la constante de partición para ambos
sistemas y se aplicó el método de las velocidades
iniciales. Mediante los datos experimentales obtenidos al
variar la concentración de los sustratos en los distintos
medios estudiados, se determinó la constante de
velocidad catalítica (kcat), la constante de Michaelis Menten (KM) y la eficiencia catalítica de la enzima (kcat
/ KM). Similar a lo realizado en medio homogéneo, se
valió de la constante de partición para determinar
correctamente la eficiencia catalítica de la enzima (kcat /
KM) corr . La misma se muestra en la Tabla 1.
A diferencia de lo que ocurre en medio homogéneo,
fue posible determinar la eficiencia catalítica al 50 % de
mezcla. Más aún, este valor obtenido es similar al
obtenido cuando se encapsula agua-DMSO al 20% en
micelas inversas AOT. Al parecer, la enzima no estaría
inhibida por la presencia del DMSO. Es posible pensar,
que la enzima anclada en la interfaz, sensa el agua de
hidratación de la interfaz y no al DMSO. Este último se
encontraría alejado de la interfaz, posiblemente en el
corazón polar.
CONCLUSIONES
Un incremento en DMSO en la mezcla aguaDMSO en medio homogéneo inhibe la enzima.
No se observa inhibición de la enzima cuando se
encapsula agua-DMSO en diferentes proporciones.
Se observa una solvatación preferencial de la
enzima en la interfaz de micelas inversas de aguaDMSO/AOT/heptano.
REFERENCIAS
1- M. A. Biasutti, E. B. Abuin, J. J.Silber , N. M.
Correa, E. A. Lissi, Adv. Colloid Interface Sci, 136,
1, (2008)
2- N. M. Correa, J. J. Silber, R. E. Riter, N. E. Levinger,
Chem. Rev., 112, 4569, (2012)
3- F. Moyano, R. D. Falcone, J. C. Mejuto, J. J. Silber,
N. M. Correa, Chem.-Eur. J., 16, 8887. ,(2010).
4- A. Kumar, P. Venkatesu, Chem. Rev., 112 (7), 4283,
(2012).