ANTIBIOTIC DISCS FOR THE DETECTION OF EXTENDED SPECTRUM BETA-LACTAMASE (ESBL) CARTRIDGE OF 50 DISCS CONFIRMATION TEST FOR THE DETECTION OF ESBL IVD 1- CLINICAL VALUE The detection of extended spectrum Beta-lactamases (ESBL) is complicated by the wide diversity of plasmid enzymes that hydrolyze and inactivate numerous Beta-lactams. These ESBL are becoming more and more widespread in numerous species of bacteria. The utility of detecting this phenotype is two-fold: to enable appropriate treatment and to control the diffusion of this mechanism of resistance (1) (2). 2- PRINCIPLE The technique involves comparing the in vitro activity of discs of third generation cephalosporins (3GC) and of these same 3GC in association with clavulanic acid (3GC + CA). Interpretation will be based on the recommendations of the CLSI/NCCLS and / or the supplier (3) regarding ESBL detection in Enterobacteriaceae, and notably in strains that produce large quantities of cephalosporinase. 3- PRESENTATION Bio-Rad disks are 6.5 mm disks made from superior quality absorbent paper and impregnated with precise concentrations of antimicrobial agents and inhibitor. The disks are clearly identified by a code, comprising 4 letters, printed on each side of the disk. DISK CONTENT SYMBOL PACK SIZE ORDER N° Ceftazidime + Clavulanic Acid 30 / 10 µg CCAZ 1x50 disks 68446 Cefotaxime + Clavulanic Acid 30 / 10 µg CCTX 1x50 disks 68456 Cefepime + Clavulanic Acid 30 / 10 µg CFEP 1x50 disks 68466 4- STORAGE The expiry date applies exclusively to disks contained in intact cartridges stored according to the manufacturer's instructions. The expiry date and batch number are indicated on each packaging (cartridge and container). • Cartridges of disks must be stored in their containers at a temperature between +2°C and +8°C in a dry place. • Containers must be allowed to adjust to room temperature (18-30°C) before opening. After applying the disks, return unused cartridges to a temperature between +2°C and +8°C. • Do not use disks after the expiry date. Do not use any cartridge of disks left at room temperature (18-30°C) for more than 8 hours without verifying an acceptable level of performance before continuing to use this cartridge (5). • If the cartridge remain in the distributor after dispatch, it is necessary to preserve it at +2-8°C in a dry place with dessicants inside. The stability of the disks, of open cartridges placed in distributors (preserved according to the recommendations with dessicants) was validated in routine conditions. The stability in weeks is shown inside this symbol: 4 wks 1 5- MATERIAL REQUIRED BUT NOT SUPPLIED • disk dispenser: : 6 disks ref # 50271 8 disks ref # 50270 12-16 disks ref # 50295 • culture media (Mueller-Hinton) • reagents • bacterial strains for quality control • opacity control equivalent to the Mac Farland 0.5 standard • laboratory equipment necessary for antibiotic susceptibility testing by the agar diffusion method. 6- PRECAUTIONS Follow the instructions of the current guidelines (CLSI/NCCLS, CA-SFM). Always observe the current techniques and precautions concerning protection against microbiological hazards. After use, sterilize the cultures and all contaminated material. 7- PROCEDURE Samples: disks must not be used for tests performed directly on biological samples. Refer to the current guidelines (CLSI/NCCLS, CASFM) defining preparation of the inoculum (pure, fresh culture), inoculation of Petri dishes, the incubation temperature and incubation time. Follow the instructions provided by the CLSI/NCCLS and the CASFM to perform the antibiogram. Place the discs that are impregnated with a predetermined concentration of 3GC+CA (CCAZ, 30µg/10µg, CCTX 30µg/10µg, CFEP 30µg/10µg), as well as those with a 3GC alone (CAZ 30µg, CTX 30µg, FEP 30µg) on the surface of a suitable, inoculated medium. Good laboratory practice should also be applied at all times. 8- INTERPRETATION OF THE RESULTS • Precisely measure the diameters of the zones of inhibition observed - Ceftazidime+ Clavulanic acid/Ceftazidime - Cefotaxime + Clavulanic acid /Cefotaxime - Cefepime + Clavulanic acid/Cefepime • The bacterial strain is interpreted as having an ESBL resistance phenotype if 3GC activity is seen to be restored in the presence of CA. • A strain is ESBL positive if at least one of the differences in diameter between the (3GC+CA) and (3GC) is greater than or equal to 5mm (3)(4). 9- PERFORMANCE/QUALITY CONTROL The performances of antibiotic disks are systematically controlled by using the following strains: • Klebsiella pneumoniae ATCC® 700603 ≥ 3 mm - CCAZ-CAZ ≥ 5 mm ≥ 2 mm - CCTX-CTX - CFEP-FEP • Escherichia coli ATCC® 25922 ≤ 2 mm - CCAZ-CAZ ≤ 2 mm ≤ 2 mm - CCTX-CTX - CFEP-FEP : Standard CLSI/NCCLS : Standard Internal 10-QUALITY CONTROL OF THE MANUFACTURER All manufactured and commercialized reagents are under complete quality system starting from reception of raw material to the final commercialization of the product. Each lot is submitted to a quality control and only is released on the market when conforming to the acceptance criteria. The records relating to production and control of each single lot are kept within our company 2 11-LIMITATIONS OF USE • A resistant phenotype such as an ESBL is detected by measuring the diameters in the inhibitory zones: to the nearest millimeter, the difference between the diameters of the two discs tested determines whether or not an ESBL is present. Measurements taken to the nearest millimeter give an acceptable margin of error under laboratory conditions. • The final interpretation, as for all laboratory interpretations, can not be based on the results of one single test but on an overview of the clinical data and other antibiotic test results. • The performances of the test depend not only on the activity of the disks, but also on factors such as the use of an appropriate inoculum and control strains, appropriate and previously tested culture media and adequate storage. 12-REFERENCES 1)Bradford, P. Extended-spectrum beta-lactamases in the 21st century: characterization, epidemiology, and detection of this important resistance threat. Clin Microbiol Rev 2001;14:933-51. 2)Livermore D. Beta-lactamases in laboratory and clinical resistance. Clin Microbiol Rev 1995;8:557-84. 3)Bert F and al. Comparison of disks of cefotaxime, ceftazidime and cefepime combined with Clavulanic Acid for the detection of Extended-Spectrum Beta-lactamases. 24th RICAI 2004; 556/91P 4)CLSI/NCCLS: Clinical and laboratory Standards Institute/ National Committee for Clinical Laboratory Standards 5)CA-SFM: Comité de l’Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33 05/2005 3 DISQUES ANTIBIOTIQUES POUR LA DETECTION DE BETA-LACTAMASE A SPECTRE ETENDU (BLSE) CARTOUCHE DE 50 DISQUES TEST DE CONFIRMATION POUR LA DETECTION DES BLSE IVD 1- INTÉRÊT CLINIQUE La détection des Bêta-lactamases à spectre étendu (BLSE) est rendue difficile par la grande diversité d’enzymes plasmidiques hydrolysant et inactivant de nombreuses Bêta-lactamines. Ces BLSE sont de plus en plus répandues chez de nombreuses espèces bactériennes. La détection de ce phénotype a deux objectifs : adapter la prescription thérapeutique et contrôler la diffusion de ce mécanisme de résistance (1)(2). 2- PRINCIPE La technique consiste à comparer l’activité in vitro de disques de céphalosporines de troisième génération (C3G) et de ces même C3G associées à de l’acide clavulanique (C3G+CA). L’interprétation se fera selon les recommandations du CLSI/NCCLS et/ou du fournisseur (3) pour la recherche de BLSE chez les entérobactéries, notamment les souches hyperproductrices de céphalosporinase. 3- PRÉSENTATION Disques de 6,5 mm fabriqués à partir de papier absorbant de qualité supérieure, imprégnés d’agents antimicrobiens et d’inhibiteurs à des concentrations précises. Les disques sont clairement identifiés par un sigle de 4 lettres imprimé de chaque côté du disque. CHARGE DU DISQUE SYMBOLE CONDITIONNEMENT CODE PRODUIT Ceftazidime + Clavulanic Acid 30 / 10 µg CCAZ 1x50 disques 68446 Cefotaxime + Clavulanic Acid 30 / 10 µg CCTX 1x50 disques 68456 Cefepime + Clavulanic Acid 30 / 10 µg CFEP 1x50 disques 68466 4- CONSERVATION La date de péremption s’applique uniquement aux disques contenus dans les cartouches intactes conservées conformément aux instructions du fabricant. La date de péremption et le numéro de lot figurent sur chaque conditionnement (cartouche et container). • Les cartouches de disques doivent être conservées dans leur container entre +2 et +8 °C au sec. • Laisser les containers à température ambiante avant de les ouvrir (maximum une heure) ; remettre les cartouches une fois la pose des disques terminée entre +2 et +8°C au sec. • Ne pas utiliser les disques dont la date de péremption est dépassée. • Ne pas utiliser les cartouches de disques laissée à température ambiante plus de 8 heures, sinon en contrôler le niveau acceptable de performance avant de continuer à l’utiliser. • Si les cartouches sont conservées dans le distributeur après dépôt, il est nécessaire de conserver celui-ci à +2- +8°C au sec avec des dessicants à l’intérieur. La stabilité des disques dans les cartouches ouvertes placées dans des distributeurs (conservées suivant les recommandations avec dessicants) a été validée en conditions de routine. Elle est indiquée en semaine a l’intérieur du pictogramme suivant : 4 wks 1 5- MATÉRIEL NÉCESSAIRE NON FOURNI • distributeur de disques : 6 disques ref # 50271 8 disques ref # 50270 12-16 disques ref # 50295 • milieux de cultures (Mueller-Hinton) • réactifs • souches bactériennes pour le contrôle qualité • témoin d’opacité équivalent au standard Mac Farland 0,5 • matériel de laboratoire nécessaire pour la réalisation des antibiogrammes par la méthode de diffusion en milieu gélosé. 6- PRÉCAUTIONS D’UTILISATION Suivre les instructions d’utilisation des recommandations en vigueur, CLSI/NCCLS, CASFM. Observer à tout moment les techniques et précautions en vigueur en matière de protection contre les dangers microbiologiques. Après usage, stériliser les cultures et tout le matériel contaminé. 7- MODE OPÉRATOIRE Les disques ne doivent pas être utilisés pour un test directement sur échantillons biologiques. Se référer aux recommandations en vigueur du CLSI/NCCLS, CASFM qui précisent : la façon de préparer l’inoculum (culture pure et fraîche), l’ensemencement des boîtes de Pétri, la température et le délai d’incubation. Se référer aux instructions recommandées par le CLSI/NCCLS et le CASFM pour toutes les étapes aboutissant à la réalisation de l’antibiogramme. A la surface du milieu adéquat, préalablement ensemencé déposer les disques imprégnés d’une concentration déterminée de C3G+AC (CCTX 30µg/10µg, CCAZ 30µg/10µg, CFEP 30µg/10µg), ainsi que C3G seules (CTX 30 µg, CAZ 30 µg, FEP 30 µg). Il est recommandé dans le même temps d’appliquer les bonnes pratiques de laboratoire. 8- INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS • Mesurer précisément les diamètres des zones d’inhibition observées pour chacun des disques déposés. - Ceftazidime + Clavulanic Acid/Ceftazidime - Cefotaxime + Clavulanic Acid/Cefotaxime - Cefepime + Clavulanic Acid/Cefepime • La souche bactérienne est interprétée comme ayant un phénotype de résistance BLSE si on observe une restauration de l’activité de la C3G en présence de l’acide clavulanique. • Une souche sera rendu BLSE positive si au moins une des différences de diamètre entre les (C3G+AC) – (C3G) est supérieure ou égale à 5mm (3)(4). 9- PERFORMANCES / CONTRÔLE QUALITÉ Les performances des disques antibiotiques sont contrôlées à l’aide des souches suivantes : • Klebsiella pneumoniae ATCC® 700603 ≥ 3 mm - CCAZ-CAZ ≥ 5 mm ≥ 2 mm - CCTX-CTX - CFEP-FEP • Escherichia coli ATCC® 25922 ≤ 2 mm - CCAZ-CAZ ≤ 2 mm ≤ 2 mm - CCTX-CTX - CFEP-FEP : Norme CLSI/NCCLS : Norme Interne 10-CONTRÔLE QUALITÉ DU FABRICANT Tous les produits fabriqués et commercialisés par la société Bio-Rad sont placés sous un système d'assurance qualité de la réception des matières premières jusqu'à la commercialisation des produits finis. Chaque lot de produit fini fait l'objet d'un contrôle de qualité et n'est commercialisé que s'il est conforme aux critères d'acceptation. La documentation relative à la production et au contrôle de chaque lot est conservée par le fabricant. 2 11-LIMITES D’UTILISATION • La détection d’un phénotype de résistance tel qu’une BLSE est dépendante de la lecture des diamètres des zones d’inhibition : à un millimètre près, la différence entre les diamètres pour les deux disques testés peut faire conclure ou non à la présence d’une BLSE. La lecture à un millimètre près correspond à une marge d’erreur courante en laboratoire. • L’interprétation finale, comme toute interprétation biologique, ne peut être prise sur le résultat d’un seul test mais par un ensemble de données cliniques et de résultats pour d’autres molécules testées pour l’antibiogramme. • Les performances du test dépendent non seulement de l’activité des disques, mais également de facteurs tels que l’utilisation d’un inoculum standardisé, de souches de contrôles appropriés, de milieux de culture adaptés pré testés et d’une température de stockage adéquate. 12-RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1)Bradford, P. Extended-spectrum beta-lactamases in the 21st century: characterization, epidemiology, and detection of this important resistance threat. Clin Microbiol Rev 2001;14:933-51. 2)Livermore D. Beta-lactamases in laboratory and clinical resistance. Clin Microbiol Rev 1995;8:557-84. 3)Bert F and al. Comparison of disks of cefotaxime, ceftazidime and cefepime combined with Clavulanic Acid for the detection of Extended-Spectrum Beta-lactamases. 24th RICAI 2004; 556/91P 4)CLSI/NCCLS: Clinical and laboratory Standards Institute/ National Committee for Clinical Laboratory Standards 5)CA-SFM: Comité de l’Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33 05/2005 3 DISCOS ANTIBIÓTICOS PARA LA DETECCIÓN DE LA BETA-LACTAMASA DE ESPECTRO AMPLIADO (BLSE) CARTUCHO DE 50 DISCOS TEST DE CONFIRMACIÓN PARA LA DETECCIÓN DE LAS BLSE IVD 1- VALOR CLÍNICO La detección de las Bêta-lactamasas de amplio espectro (BLSE) es dificil por la gran diversidad de enzimas plasmídicas hidrolizantes e inactivantes de numerosas Bêta-lactamasas. Estas BLSE se reparten cada vez más entre numerosas especies bacterianas. La detección de este fenotipo tiene dos objetivos: adaptar la prescripción terapéutica y controlar la difusión de este mecanismo de resistencia (1)(2). 2- PRINCIPIO La técnica consiste en comparar la actividad in vitro de los discos de cefalosporinas de tercera generación (C3G) y de estas mismas C3G asociadas al ácido clavulánico (C3G+AC). La interpretación se efectuará según las recomendaciones del CLSI/NCCLS y/o del proveedor (3) para la reserva de BLSE en las enterobacterias, principalmente las cepas hyperproductoras de cefalosporina. 3- PRESENTACIÓN Los discos de Bio-Rad son discos de 6,5 mm fabricados en papel absorbente de calidad superior e impregnados con concentraciones precisas de los agentes antimicrobianos and AC. Los discos están claramente identificados por medio de un código que comprende 4 letras, impreso en cada cara del disco. CONTENIDO DEL DISCO SÍMBOLO TAMAÑO DEL ENVASE N° REFERENCIA Ceftazidime + Clavulanic Acid 30 / 10 µg CCAZ 1x50 discos 68446 Cefotaxime + Clavulanic Acid 30 / 10 µg CCTX 1x50 discos 68456 Cefepime + Clavulanic Acid 30 / 10 µg CFEP 1x50 discos 68466 4- CONSERVACIÓN La fecha de caducidad se aplica exclusivamente a los discos contenidos en cartuchos intactos almacenados de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La fecha de caducidad y el número de lote se indican en cada envase (cartucho y contenedor). Los cartuchos de discos deben conservarse en sus contenedores a una temperatura de entre +2° C y +8° C en un lugar seco. • Debe permitirse que los contenedores se adapten a la temperatura ambiente (+18-30°C) antes de abrirlos. Tras aplicar los discos, guarde los cartuchos no usados nuevamente a una temperatura de entre +2° C y +8° C. • No utilice los discos una vez transcurrida la fecha de caducidad. No utilice ningún cartucho de discos que haya permanecido a temperatura ambiente (+18-30°C) durante más de 8 horas sin verificar que mantiene un nivel de comportamiento aceptable antes de seguir utilizando el cartucho (5). • Si las zonas de inhibiciones obtenidas con los discos de prueba y las cepas bacterianas de control no cumplen las especificaciones, deberá verificarse el procedimiento; este error puede deberse al disco, el inóculo, la inoculación, el medio u otros factores. • Si el cartucho permanece en el distribuidor tras la distribución, es necesario conservarlo a una temperatura de entre +2º y +8° C en un lugar seco con desecantes dentro. La estabilidad de los discos una vez abiertos los cartuchos en el punto de distribución (conservados con desecante siguiendo las recomendaciones especificadas) ha sido validada en condiciones de rutina. En los que la estabilidad se indica en semanas en el interior del símbolo : 4 wks 1 5- MATERIAL NECESARIO PERO NO SUMINISTRADO • Dispensador de discos: 6 discos ref # 50271 8 discos ref # 50270 12-16 discos ref # 50295 • Medio de cultivo (Mueller-Hinton) • Reactivos • Cepas bacterianas para el control de calidad • Control de opacidad equivalente al patrón de 0,5 de la escala de Mac Farland • Equipo de laboratorio necesario para la comprobación de la susceptibilidad a los antibióticos mediante el método de difusión en agar. 6- PRECAUCIONES Siga las instrucciones de las directrices actuales (CLSI/NCCLS, CA-SFM). Respete siempre las técnicas y precauciones actuales relativos a la protección contra peligros microbiológicos. Después de su empleo, esterilice los cultivos y todo el material contaminado. 7- PROCEDIMIENTO Muestras: No deben utilizarse los discos para pruebas realizadas directamente sobre muestras biológicas. Remítase a las directrices actuales (CLSI/NCCLS_, CA-SFM_) que definen la preparación del inóculo (cultivo fresco y puro), técnicas normalizadas para la preparación del inóculo, la inoculación de placas de Petri, la temperatura de incubación y el tiempo de incubación. Consúltense las instrucciones recomendadas por el CLSI/NCCLS y el CASFM para todas las etapas cuya finalidad sea la realización del antibiograma. Depositar en la superficie del medio adecuado, previamente sembrada, los discos impregnados con una concentración determinada de C3G+CA (CCAZ 30µg/10µg, CCTX 30µg/10µg, CFEP 30µg/10µg), así como C3G solas (CAZ 30 µg, CTX 30 µg, FEP30 µg). Deben seguirse en todo momento las buenas prácticas de laboratorio. 8- INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS • Mida con precisión los diámetros de las zonas de inhibición observadas. - Ceftazidime + Clavulanic Acid/Ceftazidime - Cefotaxime + Clavulanic Acid/Cefotaxime - Cefepime + Clavulanic Acid/Cefepime • La cepa bacteriana se interpreta como si de un fenotipo de resistencia BLSE se tratara, si se observa una restauración de la actividad de la C3G en presencia de AC. • Una cepa se reproducirá BLSE positiva si al menos una de las diferencias de diámetro entre las (C3G+AC) – (C3G) es superior o igual a 5 mm (3)(4). 9- COMPORTAMIENTO / CONTROL DE CALIDAD Los comportamientos de los discos de antibióticos son sistemáticamente controlados utilizando las siguientes cepas: • Klebsiella pneumoniae ATCC® 700603 ≥ 3 mm - CCAZ-CAZ ≥ 5 mm ≥ 2 mm - CCTX-CTX - CFEP-FEP • Escherichia coli ATCC® 25922 ≤ 2 mm - CCAZ-CAZ ≤ 2 mm ≤ 2 mm - CCTX-CTX - CFEP-FEP : Estándar CLSI/NCCLS : Estándar Interna 10-CONTROL DE CALIDAD DEL FABRICANTE Todos los reactivos fabricados y comercializados se someten a un completo sistema de calidad que se inicia en el momento de la recepción de las materias primas y se extiende hasta la comercialización final del producto. Cada lote se somete a un control de calidad y únicamente se autoriza su introducción en el mercado cuando cumple los criterios de aceptación. La empresa mantiene los registros relativos a la producción y el control de cada lote. 2 11-LIMITACIONES DEL EMPLEO • La detección de un fenotipo de resistencia del tipo de una BLSE depende de la lectura de los diámetros de zonas de inhibición: aproximadamente a un milímetro, la diferencia entre los diámetros para los dos discos probados puede manifestar o no la presencia de una BLSE. La lectura aproximada a un milímetro corresponde a un margen de error normal en el laboratorio. • La interpretación final, al igual que ocurre con todas las interpretaciones de laboratorio, no puede basarse en los resultados de una única prueba, sino en una visión general de los datos clínicos y otros resultados de antibióticos. • Los comportamientos de la prueba dependen no sólo de la actividad de los discos, sino también de factores como el uso de un inóculo adecuado y cepas de control apropiadas, medios de cultivo adecuados y previamente comprobados, y de una conservación correcta. 12-REFERENCIAS 1)Bradford, P. Extended-spectrum beta-lactamases in the 21st century: characterization, epidemiology, and detection of this important resistance threat. Clin Microbiol Rev 2001;14:933-51. 2)Livermore D. Beta-lactamases in laboratory and clinical resistance. Clin Microbiol Rev 1995;8:557-84. 3)Bert F and al. Comparison of disks of cefotaxime, ceftazidime and cefepime combined with Clavulanic Acid for the detection of Extended-Spectrum Beta-lactamases. 24th RICAI 2004; 556/91P 4)CLSI/NCCLS: Clinical and laboratory Standards Institute/ National Committee for Clinical Laboratory Standards 5)CA-SFM: Comité de l’Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33 05/2005 3 ANTIBIOTIKATESTBLÄTTCHEN FÜR DEN NACHWEIS VON BREITSPEKTRUM-BETALAKTAMASEN (EXTENDED SPECTRUM BETA-LACTAMASE, ESBL) KARTUSCHE MIT 50 TESTBLÄTTCHEN BESTÄTIGUNGSTEST FÜR DEN NACHWEIS VON ESBL IVD 1- KLINISCHE BEDEUTUNG Der Nachweis von Breitspektrum-Betalaktamasen (extended spectrum Beta-lactamases, ESBL) ist wegen der großen Vielfalt an plasmidkodierten Enzymen, die zahlreiche Betalaktame hydrolysieren und inaktivieren, nicht einfach. Die Verbreitung dieser ESBL unter zahlreichen Bakterienspezies nimmt immer weiter zu. Der Nachweis dieses Phänotyps ist daher in doppelter Hinsicht wichtig : zur Sicherung des klinischen Therapieerfolges sowie als eine Kontrollmöglichkeit , mit der die weitere Ausbreitung dieses Resistenzmechanismus eingedämmt werden soll (1) (2). 2- TESTPRINZIP Bei dieser Technik wird die in-vitro-Aktivität von Testblättchen mit Cephalosporinen der 3. Generation (3GC) mit der Aktivität dieser 3GC-Testblättchen in Kombination mit Clavulansäure (3GC + CA) verglichen. Die Auswertung hinsichtlich des Nachweises von ESBL bei Enterobacteriaceae und insbesondere bei Stämmen, die große Mengen an Cephalosporinase produzieren, beruht auf den Empfehlungen von CLSI/NCCLS bzw. des Herstellers (3). 3- INHALT DER TESTPACKUNG Die Testblättchen mit einem Durchmesser von 6,5 mm werden aus hochwertigem Filterpapier hergestellt und sind jeweils mit genau definierten Konzentrationen an Antibiotika bzw. Inhibitor imprägniert . Sie sind durch den beidseitig aufgedruckten Code (Symbol) leicht zu identifizieren. KONZENTRATION DER TESTBLÄTTCHEN SYMBOL PACKUNGSEINHEIT Art.Nr. Ceftazidime + Clavulanic Acid 30 / 10 µg CCAZ 1x50 Testblättchen 68446 Cefotaxime + Clavulanic Acid 30 / 10 µg CCTX 1x50 Testblättchen 68456 Cefepime + Clavulanic Acid 30 / 10 µg CFEP 1x50 Testblättchen 68466 4- LAGERUNG Das Verfallsdatum gilt ausschließlich für Testblättchen in ungeöffneten Kartuschen, die gemäß den Anweisungen des Herstellers aufbewahrt werden. Das Verfallsdatum und die Charge sind auf jeder Verpackung (Kartusche und Packung) angegeben. • Die Kartuschen müssen in ihren Verpackungen an einem trockenen Ort bei einer Temperatur zwischen +2°C und +8°C aufbewahrt werden. • Die Packung muss vor dem Öffnen Raumtemperatur (18-30°C) erreicht haben. Nach Verwendung der Testblättchen müssen die Kartuschen wieder bei +2°C und +8°C gelagert werden. • Die Testblättchen nach Ablauf des Verfallsdatums nicht mehr verwenden. Verwenden Sie Kartuschen, die länger als 8 Stunden bei Raumtemperatur (18-30°C) aufbewahrt wurden erst, nachdem Sie überprüft haben, ob die Werte noch innerhalb des akzeptablen Bereiches liegen. (5) • Entsprechen die mit den Testblättchen und Kontroll-Bakterienstämmen erzielten Hemmhöfe nicht den Spezifikationen, muss der Testablauf überprüft werden; Fehler können auf das Testblättchen, das Inokulum, die Beimpfung des Mediums oder auf andere Faktoren zurückzuführen sein. • Werden die die Kartuschen im Stempel (Dispenser) aufbewahrt, sollte dieser mit einem Tockenmittel bei +2-8°C und an einem trockenen Ort gelagert werden. 1 Die Haltbarkeit von Testblättchen, die in den Kartuschen in einem Dispenser gelagert werden (gemäss Empfehlung mit einem Trockenmittel) wurde unter Routinebedingungen geprüft. Der hierbei ermittelte Zeitraum (in Wochen) wird jeweils auf der Verpackung angegeben und kann aus dem dargestellten Piktogram abgelesen werden: 4 wks 5- BENÖTIGTE, JEDOCH NICHT MITGELIEFERTE MATERIALIEN • Dispenser (Stempel) für die Testblättchen : Art.- Nr. 50271 6 Testblättchen Art.- Nr. 50270 8 Testblättchen Art.-Nr. 50295 12-16 Testblättchen • Kulturmedium (Mueller-Hinton) • Reagenzien • Bakterienstämme für die Qualitätskontrolle • Trübungsstandard ,entsprechend einem Mac Farland 0,5-Standard • Laborausstattung zum Anlegen eines Antibiogramms im Agardiffusionstest 6- VORSICHTSMASSNAHMEN Beachten Sie die aktuellen Richtlinien (z.B. CLSI/NCCLSO, CA-SFMO). Beachten Sie stets die aktuellen Massgaben und Vorsichtsmaßnahmen zum Schutz vor mikrobiologischen Gefahren. Nach der Verwendung die Kulturen und alle kontaminierten Materialien autoklavieren. 7- TESTDURCHFÜHRUNG Die Testblättchen sind nicht zur direkten Untersuchung von klinischen Probenmaterialien geeignet. Für die standardisierte Herstellung des Inokulums (aus einer frischen Reinkultur), die Beimpfung des Nährbodens, sowie für Inkubationstemperatur und – dauer, beachten Sie bitte die jeweiligen, aktuellen Empfehlungen (z.B. CLSI/NCCLS, CA-SFM). Beachten Sie auch bei der weiteren Durchführung des Antibiogramms die jeweiligen Richtlinien,( z.B. CLSI/NCCLS- , CASFM). Verteilen Sie anschliessend die , mit der Kombination aus einem Cephalosporin der 3. Generation und der Clavulansäure imprägnierten Testblättchen (CCAZ, 30 µg/10 µg, CCTX 30 µg/10 µg, CFEP 30 µg/10 µg) sowie jeweils ein Testblättchen das nur mit dem entsprechenden Cephalosporin beladen ist (CAZ 30 µg, CTX 30 µg, FEP 30 µg) auf einem geeigneten und zuvor mit dem Teststamm beimpften Nährboden. Es sollten stets die GLP-Richtlinien beachtet werden. 8- INTERPRETATION DER ERGEBNISSE • Die Durchmesser der Hemmhöfe für jedes Testblättchen genau ausmessen, d.h. für : - Ceftazidime + Clavulanic Acid/Ceftazidime - Cefotaxime + Clavulanic Acid/Cefotaxime - Cefepime + Clavulanic Acid/Cefepime • Der Bakterienstamm gilt als ein ESBL-Resistenzphänotyp, wenn die Aktivität eines Cephalosporins der 3. Generationin in Gegenwart der Clavulansäure nachweislich wieder hergestellt ist. • Ein Stamm ist ESBL-positiv, wenn zumindest einer der Durchmesser zwischen (3GC+CA) und (3GC) mindestens 5 mm größer (3)(4) ist. 9- TESTEIGENSCHAFTEN / QUALITÄTSKONTROLLE Die Testeigenschaften der Antibiotika -Testblättchen werden mittels folgender Teststämme systematisch kontrolliert: • Klebsiella pneumoniae ATCC® 700603 ≥ 3 mm - CCAZ-CAZ ≥ 5 mm ≥ 2 mm - CCTX-CTX - CFEP-FEP • Escherichia coli ATCC® 25922 ≤ 2 mm - CCAZ-CAZ ≤ 2 mm ≤ 2 mm - CCTX-CTX - CFEP-FEP : Standard CLSI/NCCLS : Standard Intern 2 10-QUALITÄTSKONTROLLE DES HERSTELLERS Alle hergestellten oder im Handel erhältlichen Reagenzien unterliegen einem umfassenden Qualitätssystem , das vom Eingang der Rohmaterialien bis zur Vermarktung des Produktes reicht. Jede Charge unterliegt einer Qualitätskontrolle und wird nur für den Markt freigegeben, wenn die Akzeptanzkriterien erfüllt sind. Die Produkt- und Kontrolldokumentation zu jeder einzelnen Charge wird in der Firma aufbewahrt. 11-GRENZEN DES VERFAHRENS • Der Nachweis eines resistenten Phänotyps wie ESBL erfolgt durch Ausmessen der Hemmhofdurchmesser. Eine Abweichung der für die 2 Testblättchen bestimmten Hemmhofdurchmesser um 1 Millimeter kann bereits zu einer anderen Schlussfolgerung in Bezug auf das Vorliegen eines ESBL – Stammes führen. Eine solche Abweichung gilt als eine akzeptable Fehlerbreite unter Laborbedingungen. • Die endgültige Interpretation kann, wie bei allen Laborinterpretationen, nicht nur auf Basis der Ergebnisse eines einzelnen Tests erfolgen, sondern muss ggf. auch klinische Daten und die Ergebnisse anderer Antibiotika mit dem jeweiligen Teststamm berücksichtigen. • Die Leistung des Tests hängt nicht nur von der Aktivität der Testblättchen ab, sondern auch von Faktoren wie der Verwendung eines geeigneten Inokulums und geeigneter Kontrollstämme sowie geeigneter und zuvor validierter Kulturmedien und einer einer adäquaten Lagerung ab. 12-LITERATUR 1)Bradford, P. Extended-spectrum beta-lactamases in the 21st century: characterization, epidemiology, and detection of this important resistance threat. Clin Microbiol Rev 2001;14:933-51. 2)Livermore D. Beta-lactamases in laboratory and clinical resistance. Clin Microbiol Rev 1995;8:557-84. 3)Bert F and al. Comparison of disks of cefotaxime, ceftazidime and cefepime combined with Clavulanic Acid for the detection of Extended-Spectrum Beta-lactamases. 24th RICAI 2004; 556/91P 4)CLSI/NCCLS: Clinical and laboratory Standards Institute/ National Committee for Clinical Laboratory Standards 5)CA-SFM: Comité de l’Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33 05/2005 3 DISCHI ANTIBIOTICI PER LA RIVELAZIONE DI BETA-LATTAMASI A SPETTRO ESTESO (BLSE) CARTUCCIA DA 50 DISCHI TEST DI CONFERMA PER LA RIVELAZIONE DI BLSE IVD 1- INTERESSE CLINICO La rivelazione di Beta-lattamasi a spettro esteso (BLSE) è difficile a causa della notevole diversità di enzimi plasmidici in grado di idrolizzare e inattivare numerose Beta-lattamine. Dette BLSE sono sempre più diffuse in numerose specie batteriche. La rivelazione del fenotipo si propone un duplice obiettivo: adattamento della prescrizione terapeutica e controllo della diffusione di questo meccanismo di resistenza (1) (2). 2- PRINCIPIO La tecnica consiste nel mettere a confronto l'attività in vitro di dischi di cefalosporine di terza generazione (C3G) con queste stesse C3G associate ad acido clavulanico (C3G + AC). L'interpretazione verrà effettuata in base alle raccomandazioni del CLSI/NCCLS e/o del fornitore (3) per la ricerca di BLSE presenti negli enterobatteri, in particolare nei ceppi iperproduttori di cefalosporinasi. 3- PRESENTAZIONE Si tratta di dischi da 6,5 mm prodotti a partire da carta assorbente di qualità superiore impregnati di agenti antimicrobici in precise concentrazioni e acido clavulanico. I dischi sono chiaramente identificati da una sigla, formata 4 lettere, stampata su ciascun lato del disco. CARICA DEL DISCO SIMBOLO CONFEZIONE CODICE PRODOTTO Ceftazidime + Clavulanic Acid 30 / 10 µg CCAZ 1x50 diski 68446 Cefotaxime + Clavulanic Acid 30 / 10 µg CCTX 1x50 diski 68456 Cefepime + Clavulanic Acid 30 / 10 µg CFEP 1x50 diski 68466 4- CONSERVAZIONE La data di scadenza si riferisce esclusivamente ai dischi contenuti nelle cartucce intatte conservate attenendosi alle istruzioni del produttore. La data di scadenza e il numero di lotto sono indicati su ogni confezione (cartuccia e contenitore). • Le cartucce contenenti i dischi devono essere conservate nel loro contenitore ad una temperatura compresa tra + 2 e + 8 °C in luogo asciutto. • Portare i contenitori a temperatura ambiente (18-30°C) prima di aprirli, una volta completato il posizionamento dei dischi, riportare le cartucce inutilizzate a +2 - +8°C. • Non utilizzare i dischi dopo la data di scadenza. Non utilizzare cartucce di dischi rimaste a temperatura ambiente (18-30°C) per oltre 8 ore, o altrimenti controllare il livello di performance accettabile prima di continuare a utilizzarle(5). • Se le cartucce vengono conservate nel distributore una volta depositati i dischi è necessario conservare il distributore stesso a + 2-8°C in luogo asciutto con essiccante all’interno. • La stabilità dei dischetti nella cartuccia aperta e posta nel distributore (conservato con essicante secondo le raccomandazioni) è stata validata in condizioni di routine. La validità , in settimane, dei dischi è indicata all’interno del simbolo : 4 wks 1 5- MATERIALE NECESSARIO, MA NON FORNITO • Distributore di dischi : 6 dischi Cod 50271 8 dischi Cod 50270 12-16 dischi Cod 50295 • Mezzi i di coltura (Mueller-Hinton) • Reagenti • Ceppi batterici per il controllo di qualità • Indicatore di opacità equivalente allo standard Mac Farland 0.5 • Materiale di laboratorio necessario per eseguire gli antibiogrammi mediante tecnica di diffusione in mezzo Agar. 6- PRECAUZIONI PER L’USO Seguire le istruzioni di utilizzo indicate nelle raccomandazioni in vigore (CLSI/NCCLS, CA-SFM). Rispettare per ciascuna fase le tecniche e le precauzioni in vigore in materia di protezione contro i pericoli microbiologici. Dopo l’uso, sterilizzare le colture e tutto il materiale contaminato. 7- PROCEDURA Campioni: i dischi non devono essere utilizzati per test eseguiti direttamente su campioni biologici. Fare riferimento alle raccomandazioni in vigore (CLSI/NCCLS_, CA-SFM_) nelle quali sono precisati i metodi di preparazione dell’inoculo a partire da una coltura pura e nuova, la semina sulle piastre di Petri, , la temperatura e la durata dell’incubazione. Fare riferimento alle istruzioni raccomandate dal CLSI/NCCLS e dal CASFM per tutte le fasi da seguire per effettuare l’antibiogramma. Sulla superficie del terreno di coltura idoneo, precedentemente inseminato, disporre i dischi impregnati con una determinata concentrazione di C3G + CA (CCAZ 30 µg / 10 µg, CCTX 30 µg / 10 µg, CFEP 30 µg / 10 µg) e di sole C3G (CAZ 30 µg, CTX 30 µg, FEP 30 µg). Si consiglia di applicare nel contempo le buone pratiche di laboratorio. 8- INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI • Misurare con precisione il diametro delle zone di inibizione osservate : - Ceftazidime + Clavulanic Acid/Ceftazidime - Cefotaxime + Clavulanic Acid/Cefotaxime - Cefepime + Clavulanic Acid/Cefepime • Il ceppo batterico viene interpretato come avente un fenotipo di resistenza alle BLSE se si osserva un ripristino dell'attività della C3G in presenza di AC. • Un ceppo è BLSE positivo se almeno una delle differenze di diametro tra (C3G + AC) e (C3G) è superiore o uguale a 5 mm (3) (4). 9- PERFORMANCE/CONTROLLO QUALITÀ Le prestazioni dei dischi antibiotici sono controllate sistematicamente servendosi dei seguenti ceppi : • Klebsiella pneumoniae ATCC® 700603 ≥ 3 mm - CCAZ-CAZ ≥ 5 mm ≥ 2 mm - CCTX-CTX - CFEP-FEP • Escherichia coli ATCC® 25922 ≤ 2 mm - CCAZ-CAZ ≤ 2 mm ≤ 2 mm - CCTX-CTX - CFEP-FEP : Norma CLSI/NCCLS : Norma interna 10-CONTROLLO QUALITÀ DEL PRODUTTORE Tutti i prodotti fabbricati e commercializzati dalla società Bio-Rad sono sottoposti ad un sistema di assicurazione di qualità dal ricevimento delle materie prime fino alla commercializzazione dei prodotti finiti. Ciascun lotto di prodotto finito è soggetto a un controllo di qualità e viene messo in commercio soltanto se risulta conforme ai criteri di approvazione. La documentazione relativa alla produzione e al controllo di ciascun lotto è conservata presso il produttore. 2 11-LIMITI DI UTILIZZO • La rivelazione di un fenotipo di resistenza del tipo BLSE dipende dalla lettura dei diametri delle zone di inibizione: con la approssimazione ad un millimetro, la differenza tra i diametri per i due dischi testati può rilevare la presenza o meno di una BLSE. La lettura approssimata a un millimetro corrisponde a un margine normale di errore nei laboratori. • L’interpretazione finale, come per tutte le interpretazioni in campo biologico, non può essere stabilita in base al risultato di un solo test, bensì in base ad un insieme di dati clinici e di risultati di altri test di sensibilità. • Le performance del test non dipendono solo dall’attività dei dischi, ma anche da fattori quali l’utilizzo di un inoculo adeguato, di ceppi di controllo appropriati, di mezzi di coltura idonei precedentemente testati e di una temperatura di stoccaggio adeguata. 12-BIBLIOGRAFIA 1)Bradford, P. Extended-spectrum beta-lactamases in the 21st century: characterization, epidemiology, and detection of this important resistance threat. Clin Microbiol Rev 2001;14:933-51. 2)Livermore D. Beta-lactamases in laboratory and clinical resistance. Clin Microbiol Rev 1995;8:557-84. 3)Bert F and al. Comparison of disks of cefotaxime, ceftazidime and cefepime combined with Clavulanic Acid for the detection of Extended-Spectrum Beta-lactamases. 24th RICAI 2004; 556/91P 4)CLSI/NCCLS: Clinical and laboratory Standards Institute/ National Committee for Clinical Laboratory Standards 5)CA-SFM: Comité de l’Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33 05/2005 3 DISCOS ANTIBIÓTICOS PARA DETECÇÃO DE BETA-LACTAMASES DE LARGO ESPECTRO (BLSE) EMBALAGEM DE 50 DISCOS TESTE DE CONFIRMAÇÃO PARA DETECÇÃO DE BLSE IVD 1- INTERESSE CLÍNICO A detecção das Beta-lactamases de Largo Espectro ("BLSE") tornou-se difícil devido à grande diversidade de enzimas plasmídicas que hidrolizam e inactivam inúmeras beta-lactaminas. Estas BLSE estão cada vez mais disseminadas em muitas espécies bacterianas. A detecção deste fenotipo tem dois objectivos: adaptar a prescrição terapêutica e controlar a difusão deste mecanismo de resistência (1)(2). 2- PRINCÍPIO A técnica consiste em comparar a actividade in vitro de discos de cefalosporinas de terceira geração (C3G) e destas mesmas C3G associadas ao ácido clavulânico (C3G+AC). A interpretação é feita segundo as recomendações do CLSI/NCCLS e/ou do fornecedor (3) para detecção de BLSE nas enterobactérias, nomeadamente as estirpes hiperprodutoras de cefalosporinase. 3- PRESENTAÇÃO Os dispositivos em causa são discos de 6,5 mm fabricados a partir de papel absorvente de qualidade superior, impregnados de agentes antimicrobianos a concentrações específicas e ácido clavulânico. Os discos estão claramente identificados por meio de uma sigla de 4 letras, impressa de cada lado do disco. CONTEÚDO DO DISCO SÍMBOLO EMBALAGEM Nº REF. DO PRODUTO Ceftazidime + Clavulanic Acid 30 / 10 µg CCAZ 1x50 disks 68446 Cefotaxime + Clavulanic Acid 30 / 10 µg CCTX 1x50 disks 68456 Cefepime + Clavulanic Acid 30 / 10 µg CFEP 1x50 disks 68466 4- CONSERVAÇÃO A indicação do prazo de validade aplica-se unicamente aos discos contidos em cartuchos intactos, conservados em conformidade com as instruções do fabricante. O prazo de validade e o número de lote estão indicados em cada um dos recipientes (cartucho e embalagem exterior). • Os cartuchos de discos devem ser conservados na respectiva embalagem, a uma temperatura entre + 2 - 8 °C, em local seco. • Aguardar que as embalagens equilibrem à temperatura ambiente (18-30°C) antes de os abrir; os cartuchos não utilizados deverão ser guardados de novo à temperatura entre + 2 - 8 °C, uma vez terminada a colocação dos discos. • Não utilizar os discos após o termo do prazo de validade. Não utilizar qualquer cartucho mantido à temperatura ambiente (18-30°C) por mais de 8 horas, sem controlar previamente se o desempenho é aceitável (5). • Se os cartuchos forem conservados no distribuidor após colocação, este deve ser conservado entre + 2-8°C, a seco com exsicadores no interior. A estabilidade dos discos depois dos kits abertos e colocados no distribuidor (preservados de acordo com as recomendações e com exsicadores) foi validada em condições de rotina durante 6 semanas, a estabilidade está indicada em semanas no interior do pictograma: 4 wks 1 5- MATERIAL NECESSÁRIO MAS NÃO FORNECIDO • Distribuidor de discos : 6 discos ref. nº 50271 8 discos ref. nº 50270 12-16 discos ref. nº 50295 • meio de cultura (Mueller-Hinton) • reagentes • estirpes bacterianas para controlo da qualidade • controlo de opacidade equivalente à norma Mac Farland 0.5 • material de laboratório necessário para realização de antibiogramas pelo método de difusão em meio de gelose. 6- PRECAUÇÕES DE UTILIZAÇÃO Seguir as instruções de utilização das recomendações em vigor (CLSI/NCCLS, CA-SFM). Observar permanentemente as técnicas e precauções em vigor em matéria de protecção contra riscos microbiológicos. Após utilização, esterilizar as culturas e todo o material contaminado. 7- MODO DE FUNCIONAMENTO Amostras: os discos não devem ser utilizados para teste directo em amostras biológicas. Consultar as recomendações em vigor (CLSI/NCCLS, CA-SFM) que especificam a forma de preparação do inoculado a partir de uma cultura pura e recente, a inoculação das caixas de Pétri, a temperatura e o período de incubação. Consultar as instruções recomendadas pelo CLSI/NCCLS e o CASFM para todas as etapas de realização do antibiograma. À superfície do meio adequado, previamente inoculado, depositar os discos impregnados de uma concentração determinada de C3G+CA (CCAZ 30µg/10µg, CCTX 30µg/10µg, CFEP 30µg/10µg), bem como as C3G em isolado (CAZ 30µg, CTX 30 µg, FEP30 µg). Recomenda-se igualmente o cumprimento das boas práticas de laboratório. 8- INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS • Medir com precisão os diâmetros das zonas de inibição observadas. - Ceftazidime + Clavulanic Acid/Ceftazidime - Cefotaxime + Clavulanic Acid/Cefotaxime - Cefepime + Clavulanic Acid/Cefepime • A estirpe bacteriana é interpretada como apresentando um fenotipo de resistência BLSE se se observar um restabelecimento da actividade da C3G em presença de AC. • Uma estirpe torna-se BLSE positiva se pelo menos uma das diferenças de diâmetro entre (C3G+AC) – (C3G) for superior ou igual a 5mm (3)(4). 9- DESEMPENHOS/CONTROLO DA QUALIDADE Os desempenhos dos discos antibióticos são controlados de forma sistemática por meio das estirpes seguintes: • Klebsiella pneumoniae ATCC® 700603 ≥ 3 mm - CCAZ-CAZ ≥ 5 mm ≥ 2 mm - CCTX-CTX - CFEP-FEP • Escherichia coli ATCC® 25922 ≤ 2 mm - CCAZ-CAZ ≤ 2 mm ≤ 2 mm - CCTX-CTX - CFEP-FEP : Norma CLSI/NCCLS : Norma Interna 10-CONTROLO DE QUALIDADE DO FABRICANTE Todos os produtos fabricados e comercializados pela empresa Bio-Rad são submetidos a um sistema de garantia da qualidade, desde a recepção das matérias primas até à comercialização do produto final. Cada lote de produto final é objecto de um controlo da qualidade, sendo comercializado apenas quando em total conformidade com os critérios de aceitação. A documentação relativa à produção e controlo de cada lote é arquivada pelo fabricante. 2 11-LIMITES DE UTILIZAÇÃO • A detecção de um fenotipo de resistência, tal como uma BLSE , depende da leitura dos diâmetros das zonas de inibição: a cerca de um milímetro, a diferença entre os diâmetros para os dois discos testados pode levar a concluir ou não da presença de uma BLSE. A leitura a cerca de um milímetro corresponde a uma margem de erro corrente em laboratório. • A interpretação final, tal como acontece com qualquer interpretação biológica, não pode ser traçada a partir do resultado de um único teste, mas antes de um conjunto de dados clínicos e de resultados de ANTIBIÓTICOS. • Os desempenhos do teste dependem não só da actividade dos discos, como também de factores tais como a utilização de um inoculado, de estirpes de controlo apropriadas, de meios de cultura adaptados, previamente testados, e de uma temperatura de armazenamento adequada. 12-REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1)Bradford, P. Extended-spectrum beta-lactamases in the 21st century: characterization, epidemiology, and detection of this important resistance threat. Clin Microbiol Rev 2001;14:933-51. 2)Livermore D. Beta-lactamases in laboratory and clinical resistance. Clin Microbiol Rev 1995;8:557-84. 3)Bert F and al. Comparison of disks of cefotaxime, ceftazidime and cefepime combined with Clavulanic Acid for the detection of Extended-Spectrum Beta-lactamases. 24th RICAI 2004; 556/91P 4)CLSI/NCCLS: Clinical and laboratory Standards Institute/ National Committee for Clinical Laboratory Standards 5)CA-SFM: Comité de l’Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33 05/2005 3 ANTIBIOTIKALAPPAR FÖR DETEKTION AV BETA-LAKTAMASER MED UTÖKAT SPEKTRUM (ESBL) HYLSA MED 50 LAPPAR KONFIRMERANDE TEST FÖR DETEKTION AV ESBL IVD 1- KLINISK BETYDELSE Detektion av beta-laktamaser med utökat spektrum (ESBL) är komplicerat på grund av den stora mångfalden av plasmidenzymer som hydrolyserar och inaktiverar många beta-laktamaser. ESBL blir allt mer vanligt förekommande hos ett flertal bakteriearter. Detektion av den här fenotypen är användbar på två sätt: lämplig behandling kan bestämmas och diffusionen hos resistansmekanismen kan kontrolleras (1) (2). 2- PRINCIP Tekniken består i att jämföra in vitro-aktiviteten hos tredje generationens cefalosporinlappar (3GC) med samma 3GC i kombination med klavulansyra (3GC + CA). Utvärderingen baseras på rekommendationerna från CLSI/NCCLS och/eller leverantören (3) avseende ESBL-detektion i enterobacteriaceae, och i synnerhet i stammar som producerar stora mängder cefalosporinas. 3- INNEHÅLL Bio-Rads lappar är 6,5 mm i diameter, tillverkade av absorberande papper av högsta kvalitet och impregnerade med antibiotika i exakt definierade koncentrationer och med klavulansyra. Lapparna identifieras via en kod bestående av fyra bokstäver som är tryckt på båda sidor av lappen. INNEHÅLL SYMBOL FÖRPACKNING ORDERNR Ceftazidime + Clavulanic Acid 30 / 10 µg CCAZ 1x50 lappar 68446 Cefotaxime + Clavulanic Acid 30 / 10 µg CCTX 1x50 lappar 68456 Cefepime + Clavulanic Acid 30 / 10 µg CFEP 1x50 lappar 68466 4- FÖRVARING Angivet utgångsdatum gäller endast lappar i intakta hylsor som förvaras enligt tillverkarens anvisningar. Utgångsdatum och partinummer anges på varje förpackning (hylsa och behållare). • Hylsor med lappar ska förvaras i sina behållare i +2-8° C på torr plats. • Behållare ska anta rumstemperatur (18-30° C) innan de öppnas. Efter användning ska oanvända hylsor åter förvaras i +2–8° C. • Använd inte lappar efter sista förbrukningsdatum. Använd inte hylsor med lappar som har lämnats i rumstemperatur (18-30° C) i mer än åtta timmar utan att först kontrollera deras funktion (5). • Om hylsan lämnas kvar i dispensern efter användning ska den förvaras i +2-8° C på torr plats med torkmedel inuti. Lapparnas stabilitet, i öppnade hylsor, placerade i dispensers (som enligt rekommendationer förvaras med torkmedel), validerades under normala användningsförhållanden. Stabiliteten anges i veckor inuti symbolen: 4 wks 1 5- NÖDVÄNDIGT MATERIAL SOM EJ INGÅR • lappdispenser: 6 lappar ref nr 50271 8 lappar ref nr 50270 12-16 lappar ref nr 50295 • odlingsmedium (Mueller-Hinton) • reagens • bakteriestammar för kvalitetskontroll • opacitetskontroll motsvarande McFarland-standard 0,5 • laboratorieutrustning som krävs för bestämning av antibiotikaresistens med agardiffusionsmetoden. 6- FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER Följ aktuella riktlinjer (CLSI/NCCLS, CA-SFM). Undvik mikrobiologiska risker genom att observera rådande tekniker och angivna försiktighetsåtgärder. Sterilisera odlingarna och allt kontaminerat material efter användning. 7- FÖRFARANDE Prov: Lapparna får inte användas för tester som utförs direkt på biologiska prov. Se aktuella riktlinjer (CLSI/NCCLS, CA-SFM) för anvisningar om preparation av inokulat från en färsk renkultur, inokulering av petriskålar, inkuberingstemperatur och inkuberingstid. Genomför antibiogrammet genom att följa de instruktioner som anges av CLSI/NCCLS och CASFM. Placera lapparna, som är impregnerade med en förutbestämd koncentration 3GC+CA (CCAZ, 30 µg/10 µg, CCTX 30 µg/10 µg, CFEP 30 µg/10 µg), samt de lappar med endast 3GC (CAZ 30 µg, CTX 30 µg, FEP 30 µg) på ytan av ett lämpligt inokulerat medium. God laboratoriesed (GLP) bör alltid tillämpas. 8- UTVÄRDERING AV RESULTAT • Gör en exakt mätning av diametrarna på de inhibitionszoner som observeras - Ceftazidim + klavunalsyra/ceftazidim - Cefotaxim + klavunalsyra/cefotaxim - Cefepim + klavunalsyra/cefepim • Bakteriestammen antas ha en ESBL-fenotyp för resistens om 3GC-aktiviteten återställs vid förekomst av CA. • En stam är ESBL-positiv om minst en av skillnaderna i diameter mellan (3GC+CA) och (3GC) är större än eller lika med 5 mm (3)(4). 9- FUNKTIONS-/KVALITETSKONTROLL Antibiotikalapparnas funktion kontrolleras systematiskt med hjälp av nedanstående stammar: • Klebsiella pneumoniae ATCC® 700603 ≥ 3 mm - CCAZ-CAZ ≥ 5 mm ≥ 2 mm - CCTX-CTX - CFEP-FEP • Escherichia coli ATCC® 25922 ≤ 2 mm - CCAZ-CAZ ≤ 2 mm ≤ 2 mm - CCTX-CTX - CFEP-FEP : Standard CLSI/NCCLS : Standard Intern 10-TILLVERKARENS KVALITETSKONTROLL Alla reagenser tillverkas och marknadsförs i enlighet med ett fullständigt kvalitetssystem, från mottagande av råmaterial till slutlig marknadsföring av produkt. Varje parti genomgår en kvalitetskontroll och släpps endast ut på marknaden om det överensstämmer med acceptanskriterierna. Handlingar som hör samman med produktion och kontroll av varje enskilt parti sparas inom vårt företag. 2 11-BEGRÄNSNINGAR • En resistent fenotyp, t.ex. en ESBL, detekteras genom att diametrarna i hämningszonerna mäts: skillnaden mellan diametrarna hos de två lappar som testats avgör om en ESBL förekommer eller inte. Mått som tas med millimeternoggrannhet ger en acceptabel felmarginal under gällande laboratorievillkor. • Vid utvärdering i laboratorier kan inte slutgiltig tolkning baseras på resultatet från ett enda test utan ska göras genom att väga samman kliniska data och resultat från andra antibiotikatester. • Testresultatet är inte enbart beroende av lapparnas funktion. Även andra faktorer har betydelse, t.ex. att ett lämpligt inokulat och lämpliga kontrollstammar används, liksom lämpliga, väl utprovade odlingsmedium samt adekvat förvaring. 12-REFERENSER 1)Bradford, P. Extended-spectrum beta-lactamases in the 21st century: characterization, epidemiology, and detection of this important resistance threat. Clin Microbiol Rev 2001;14:933-51. 2)Livermore D. Beta-lactamases in laboratory and clinical resistance. Clin Microbiol Rev 1995;8:557-84. 3)Bert F and al. Comparison of disks of cefotaxime, ceftazidime and cefepime combined with Clavulanic Acid for the detection of Extended-Spectrum Beta-lactamases. 24th RICAI 2004; 556/91P 4)CLSI/NCCLS: Clinical and laboratory Standards Institute/ National Committee for Clinical Laboratory Standards 5)CA-SFM: Comité de l’Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33 05/2005 3 ANTIBIOTISKE PLADER TIL KONSTATERING AF BETA-LACTAMASE MED UDVIDET SPEKTRUM (ESBL) ÆSKE MED 50 PLADER BEKRÆFTELSESTEST TIL KONSTATERING AF ESBL IVD 1- KLINISK VÆRDI Konstateringen af beta-lactamase med udvidet spektrum (ESBL) kompliceres af mangfoldigheden af plasmidbårne enzymer, som hydrolyserer og inaktiverer adskillige beta-lactamer. Disse beta-lactamaser bliver mere og mere udbredt i adskillige bakteriearter. Der er to fordele forbundet med konstatering af denne fænotype: At give mulighed for at finde den rette behandling og at kontrollere spredningen af denne resistensmekanisme (1) (2). 2- PRINCIP Teknikken går ud på at sammenligne in vitro-aktiviteten i plader med 3. generations cephalosporiner (3GC) og disse 3GC’er sammen med clavulaninsyre (3GC + CA). Fortolkningen vil blive baseret på anbefalinger fra CLSI/NCCLS og/eller leverandøren (3) vedrørende konstatering af ESBL i enterobakterier og specielt i stammer, som producerer store mængder af cephalosporiner. 3- PRÆSENTATION De 6,5 mm store Bio-Rad-plader er fremstillet af absorberende papir af meget høj kvalitet, som er imprægneret med præcise koncentrationer af antimikrobielle stoffer og inhibitor. Pladerne er tydeligt identificeret med en kode, bestående af 4 bogstaver, der er trykt på begge sider. PLADERNES INDHOLD SYMBOL PAKKE-STØRRELSE ORDRE-NUMMER Ceftazidime + Clavulanic Acid 30 / 10 µg CCAZ 1x50 plader 68446 Cefotaxime + Clavulanic Acid 30 / 10 µg CCTX 1x50 plader 68456 Cefepime + Clavulanic Acid 30 / 10 µg CFEP 1x50 plader 68466 4- OPBEVARING Udløbsdatoen gælder udelukkende for plader i ubrudte æsker, som er opbevaret ifølge producentens anvisninger. Udløbsdato og batchnummer er angivet på hver pakning (æske og beholder). • Opbevar æskerne med plader i deres beholdere ved +2-8°C på et tørt sted. • Lad beholderne stabilisere sig ved stuetemperatur (+18-30°C), før de åbnes. Ubrugte æsker skal opbevares ved +2-8°C. • Brug ikke pladerne efter udløbsdatoen. Benyt ikke æsker med plader, der har stået ved stuetemperatur (+18-30°C) i mere end 8 timer, uden først at kontrollere, om pladernes ydeevne er acceptabel (5). • Hvis æsken med plader forbliver i dispenseren efter brug, skal dispenseren opbevares ved +2-8°C på et tørt sted med tørremiddel. Stabiliteten af pladerne efter åbning af æske og placeret i en dispenser (opbevaring med tørremiddel i henhold til anbefalinger) er blevet kontrolleret under rutineforhold. Denne stabilitet vises i uger inde i symbolet: 4 wks 1 5- KRÆVET MATERIALE, DER IKKE MEDFØLGER • Pladedispenser: 6 plader ref. nr. 50271 8 plader ref. nr. 50270 12-16 plader ref. nr. 50295 • Medier (Mueller-Hinton) • Reagenser • Bakteriestammer til kvalitetskontrol • Kontrol af uklarhed svarende til MacFarland 0,5 standard • Laboratorieudstyr, der kræves for at udføre en følsomhedstest overfor antibiotika ved hjælp af agar-diffusionsmetoden. 6- FORHOLDSREGLER Følg instruktionerne i de gældende retningslinjer (CLSI/NCCLS, CA-SFM). Overhold altid de gældende fremgangsmåder og forholdsregler til beskyttelse mod mikrobiologiske farer. Steriliser kulturerne og alt kontamineret materiale efter brug. 7- PROCEDURE Prøver: Pladerne må ikke anvendes til tests, der udføres direkte på biologiske prøver. Læs de gældende retningslinjer (CLSI/NCCLS, CA-SFM), der definerer klargøring af inokulum (ren, frisk kultur), inokulering af petriskåle, inkubationstemperatur og -tid. Følg instruktionerne fra CLSI/NCCLS og CASFM til udførelse af antibiogrammet. Anbring pladerne, som er imprægneret med en forudbestemt koncentration af 3GC+CA (CCAZ, 30µg/10µg, CCTX 30µg/10µg og CFEP 30µg/10µg), og pladerne, som udelukkende er imprægneret med 3GC (CAZ 30µg, CTX 30µg og FEP 30µg), på overfladen af et egnet, inokuleret medie. Der skal til enhver tid anvendes god laboratoriepraksis. 8- FORTOLKNING AF RESULTATERNE • Mål de observerede hæmningszoners diametre præcist - Ceftazidim + Clavulaninsyre/Ceftazidim - Cefotaxim + Clavulaninsyre/Cefotaxim - Cefepim + Clavulaninsyre/Cefepim • Fortolkningen af bakteriestammen viser, at den har en resistent ESBL-fænotype, hvis 3GC-aktiviteten gendannes ved forekomsten af clavulaninsyre. • En stamme er ESBL-positiv, hvis mindst én af differencerne i diameter mellem (3GC+CA) og (3GC) er større end eller lig med 5 mm (3)(4). 9- YDEEVNE/KVALITETSKONTROL De antibiotiske pladers ydeevne kontrolleres systematisk ved hjælp af følgende stammer: • Klebsiella pneumoniae ATCC® 700603 ≥ 3 mm - CCAZ-CAZ ≥ 5 mm ≥ 2 mm - CCTX-CTX - CFEP-FEP • Escherichia coli ATCC® 25922 ≤ 2 mm - CCAZ-CAZ ≤ 2 mm ≤ 2 mm - CCTX-CTX - CFEP-FEP : Standard CLSI/NCCLS : Standard Intern 10-PRODUCENTENS KVALITETSKONTROL Alle producerede og kommercialiserede reagenser er underlagt et komplet kvalitetssikringssystem lige fra modtagelsen af råmaterialet til den endelige markedsføring af produktet. Hvert batch sendes til kvalitetskontrol og markedsføres kun, hvis de opfylder de foruddefinerede kvalitetskriterier. Dokumentation vedrørende produktion og kontrol af hvert batch opbevares inden for virksomheden. 2 11-TESTENS BEGRÆNSNINGER • En resistent fænotype, som f.eks. en ESBL, konstateres ved at måle diametrene i hæmningszonerne: Til den nærmeste millimeter, diameterdifferencen mellem de to testede plader bestemmer, om ESBL er til stede eller ej. Målinger til den nærmeste millimeter giver en acceptabel fejlmargen under laboratorieforhold. • Den endelige fortolkning kan som alle andre laboratoriefortolkninger ikke baseres på resultaterne af en enkelt test, men på en samlet oversigt over de kliniske data og de antibiotiske testresultater. • Testens ydeevne afhænger ikke kun af aktiviteten på pladerne, men også af faktorer som f.eks. brugen af det rette inokulum og egnede kontrolstammer, korrekt og tidligere testede kulturmedier og en korrekt opbevaring. 12-REFERENCER 1)Bradford, P. Extended-spectrum beta-lactamases in the 21st century: characterization, epidemiology, and detection of this important resistance threat. Clin Microbiol Rev 2001;14:933-51. 2)Livermore D. Beta-lactamases in laboratory and clinical resistance. Clin Microbiol Rev 1995;8:557-84. 3)Bert F and al. Comparison of disks of cefotaxime, ceftazidime and cefepime combined with Clavulanic Acid for the detection of Extended-Spectrum Beta-lactamases. 24th RICAI 2004; 556/91P 4)CLSI/NCCLS: Clinical and laboratory Standards Institute/ National Committee for Clinical Laboratory Standards 5)CA-SFM: Comité de l’Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33 05/2005 3 ANTIBIOTICKÉ DISKY K DETEKCI ŠIROKOSPEKTRÝCH BETA-LAKTAMÁZ (ESBL) ZÁSOBNÍK PRO 50 DISKŮ KONFIRMAČNÍ TEST PRO DETEKCI ESBL 1- KLINICKÝ VÝZNAM Detekce širokospektrých Beta-laktamáz (ESBL) je komplikovaná kvůli veliké rozmanitosti plazmidových enzymů, které hydrolyzují a inaktivují početnou skupinu Beta-laktamáz. Tyto ESBL se stávají více a více rozšířenější v mnoha druzích bakterií. Užitečnost detekování tohoto fenotypu je dvojnásobná: umožnit vhodnou léčbu a kontrolovat difusi tohoto mechanismu rezistence (1) (2). 2- PRINCIP Tato technika zahrnuje srovnání in vitro aktivity disků třetí generace cefalosporinů (3GC) a ty stejné 3GC v kombinaci s klavulánovou kyselinou (3GC + CA). Interpretace je založena na doporučeních CLSI/NCCLS a/nebo dodavatele (3) s ohledem na detekci ESBL u Enterobacteriaceae a převážně u kmenů s produkcí velkého množství cefalosporinázy. 3- SLOŽENÍ Bio-Rad disky jsou 6,5 mm disky vyrobené z vysoce kvalitního savého papíru napuštěného přesnými koncentracemi antimikrobiálních činidel a inhibitoru. Disky jsou zřetelně označené kódem, složeným ze 4 písmen, vytištěných na každé straně disku. OBSAH DISKU SYMBOL VELIKOST BALENÍ OBJEDNACÍ Č. Ceftazidim + klavulánová kyselina 30 / 10 µg CCAZ 1 x 50 disků 68446 Cefotaxim + klavulánová kyselina 30 / 10 µg CCTX 1 x 50 disků 68456 Cefepim + klavulánová kyselina 30 / 10 µg CFEP 1x 50 disků 68466 4- UCHOVÁVÁNÍ Datum exspirace se vztahuje výhradně na disky v neporušených zásobnících uchovávaných v souladu s instrukcemi výrobce. Datum exspirace a číslo šarže jsou uvedeny na každém obalu (kazeta a obal). • Zásobníky s disky musí být uchovávány ve svých obalech při teplotě mezi +2 °C a +8 °C na suchém místě. • Před otevřením musí být zásobníky temperovány na laboratorní teplotu (18-30 °C). Po aplikaci disků, vraťte nepoužité zásobníky do teploty mezi +2 °C a +8 °C. • Nepoužívejte disky po uplynutí doby exspirace. Nepoužívejte zásobníky disků ponechané při laboratorní teplotě (18-30 °C) déle jak 8 hodin bez ověření přijatelné míry účinnosti před dalším použitím tohoto zásobníku (5). • Pokud jsou zásobníky po použití uchovávány v dispensoru, musí být uchovávány při +2-8 °C na suchém místě s adsorbentem vlhkosti umístěným uvnitř. Stabilita disků v otevřených zásobnících umístěných v dispensorech (dle doporučení uchovávaných s adsorbenty vlhkosti) byla validována za rutinních podmínek. Stabilita v týdnech je vyznačena uvnitř tohoto symbolu: 5- POTŘEBNÝ MATERIÁL, NENÍ SOUČÁSTÍ VÝROBKU • Zásobník disků: 6 disků 8 disků 12-16 disků • Kultivační média (Mueller-Hinton) • Reagencie katalogové č. 50271 katalogové č. 50270 katalogové č. 50295 • Bakteriální kmeny pro kontrolu kvality • Opacitní kontrola ekvivalentní ke standardu 0,5 MacFarland • Laboratorní vybavení nezbytné pro testování citlivosti k antibiotikům pomocí agarové difúzní metody 6- UPOZORNĚNÍ Dodržujte instrukce aktuálních směrnic (CLSI/NCCLS, CA-SFM). Dodržujte vždy aktuálně platné techniky a pokyny týkající se ochrany proti mikrobiologickým rizikům. Po použití sterilizujte kultury a veškerý kontaminovaný materiál. 7- POSTUP Vzorky: Disky nelze použít pro testy probíhající přímo na biologických vzorcích. Viz aktuální směrnice (CLSI/NCCLS, CA-SFM) definující přípravu inokula (čistá, čerstvá kultura), inokulaci Petriho misek, inkubační teplotu a inkubační čas.. Pro vytvoření antibiogramu postupujte podle instrukcí stanovených CLSI/NCCLS a CA-SFM. Disky, které jsou impregnované předem definovanou koncentrací 3GC+CA (CCAZ, 30 µg/10 µg, CCTX, 30 µg/10 µg, CFEP, 30 µg/10 µg) umístěte na povrch vhodného, naočkovaného média stejně jako disky impregnované jen 3GC (CAZ 30µg, CTX 30µg, FEP 30µg). Neustále dodržujte zásady správné laboratorní praxe. 8- INTERPRETACE VÝSLEDKŮ • Přesně změřte průměry pozorovaných inhibičních zón - Ceftazidime+ Clavulanic acid/Ceftazidime Cefotaxime + Clavulanic acid /Cefotaxime Cefepime + Clavulanic acid/Cefepime • Bakteriální kmen je interpretován jako vykazující ESBL rezistenční fenotyp, jestliže je aktivita 3GC obnovena v přítomnosti CA. • Kmen je ESBL pozitivní pokud je alespoň jeden z rozdílů průměru mezi (3GC+CA) a (3GC) větší nebo roven 5 mm (3)(4). 9- ÚČINNOST / KONTROLA KVALITY TESTU Účinnosti antibiotických disků jsou systematicky kontrolovány požitím následujících kmenů: • Klebsiella pneumoniae ATCC® 700603 - CCTX-CTX CCAZ-CAZ CFEP-FEP ≥ ≥ ≥ 3 mmc 5 mmc 2 mmd • Escherichia coli ATCC® 25922 - CCTX-CTX ≤ 2 mmc - CCAZ-CAZ ≤ 2 mmc - CFEP-FEP ≤ 2 mmd c : Standard CLSI/NCCLS d : Standard Internal 10- KONTROLA KVALITY PROVÁDĚNÁ VÝROBCEM Všechny vyráběné a komercionalizované reagencie jsou kontrolovány kompletním systémem kontroly kvality začínajícím od přijetí surovin až po komercionalizaci produktu. Každá šarže je podrobena kontrole kvality a je uvolněna na trh pouze tehdy, jestliže odpovídá stanoveným akceptačním kriteriím. Dokumentace týkající se výroby a kontroly každé jednotlivé šarže je uchovávána u výrobce. 11- LIMIT POUŽITELNOSTI • Rezistenční fenotyp jako je ESBL je detekován měřením průměrů inhibičních zón: k nejbližšímu milimetru, rozdílem mezi průměry dvou testovaných disků, který stanovuje, zda-li je nebo není přítomna ESBL. Měření zaokrouhlené na nejbližší milimetr poskytuje akceptovatelnou mez chyb v laboratorních podmínkách. • Výsledná interpretace, stejně jako veškeré laboratorní interpretace, nemůže být založena na výsledcích jednoho samotného testu, ale na přehledu klinických dat a jiných výsledcích testů antibiotik. • Účinnost testu nezávisí pouze na aktivitě disku, ale také na dalších faktorech jakými je používání vhodného inokula a kontrolních kmenů, vhodné a předem otestované kultivační médium a správné uchovávání. 12- LITERATURA 1) Bradford, P. Extended-spectrum beta-lactamases in the 21st century: characterization, epidemiology, and detection of this important resistance threat. Clin Microbiol Rev 2001;14:933-51. 2) Livermore D. Beta-lactamases in laboratory and clinical resistance. Clin Microbiol Rev 1995;8:557-84. 3) Bert F and al. Comparison of disks of cefotaxime, ceftazidime and cefepime combined with Clavulanic Acid for the detection of Extended-Spectrum Beta-lactamases. 24th RICAI 2004; 556/91P 4) CLSI/NCCLS: Clinical and laboratory Standards Institute/ National Committee for Clinical Laboratory Standards 5) CA-SFM: Comité de l’Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33 05/2005 ANTIBIOTICKÉ DISKY NA DETEKCIU ŠIROKOSPEKTRÁLNYCH BETA-LAKTAMÁZ (ESBL) ZÁSOBNÍK NA 50 DISKOV KONFIRMAČNÝ TEST NA DETEKCIU ESBL 1- KLINICKÝ VÝZNAM Detekcia širokospektrálnych Beta-laktamáz (ESBL) je komplikovaná kvôli veľkej rozmanitosti plazmidových enzýmov, ktoré hydrolyzujú a inaktivujú početnú skupinu Beta-laktamáz. Tieto ESBL sa stávajú viac a viac rozšírenejšími v mnohých druhoch baktérií. Užitočnosť detegovania tohto fenotypu je dvojnásobná: umožniť vhodnú liečbu a kontrolovať difúziu tohoto mechanizmu rezistencie (1) (2). 2- PRINCÍP Táto technika zahrňuje porovnanie in vitro aktivity diskov tretej generácie cefalosporínov (3GC) a tých istých 3GC v kombinácii s klavulánovou kyselinou (3GC + CA). Interpretácia je založená na doporučeniach CLSI/NCCLS a/alebo dodávateľa (3) s ohľadom na detekciu ESBL u Enterobacteriaceae a prevažne u kmeňov s produkciou veľkého množstva cefalosporinázy. 3- ZLOŽENIE Bio-Rad disky sú 6,5 mm disky vyrobené z vysoko kvalitného pijavého papiera napusteného antimikrobiálnymi činidlami a inhibítorom s presnými koncentráciami. Disky sú zreteľne označené kódom, zloženým zo 4 písmen, vytlačených na každej strane disku. OBSAH DISKU SYMBOL VEĽKOSŤ BALENIA OBJEDNÁVACIE Č. Ceftazidim + klavulánová kyselina 30 / 10 µg CCAZ 1 x 50 diskov 68446 Cefotaxim + klavulánová kyselina 30 / 10 µg CCTX 1 x 50 diskov 68456 Cefepim + klavulánová kyselina 30 / 10 µg CFEP 1x 50 diskov 68466 4- UCHOVÁVANIE Termín exspirácie sa vzťahuje výhradne na disky v neporušených zásobníkoch uchovávaných v súladu s inštrukciami výrobcu. Termín exspirácie a číslo šarže sú uvedené na každom obale (kazeta a obal). • Zásobníky s diskmi musia byť uchovávané vo svojich obaloch pri teplote medzi +2 °C a +8 °C na suchom mieste. • Pred otvorením musia byť zásobníky vytemperované na laboratórnu teplotu (18-30 °C). Po aplikácii diskov, vráťte nepoužité zásobníky do teploty medzi +2 °C a +8 °C. • Nepoužívajte disky po uplynutí termínu exspirácie. Nepoužívajte zásobníky diskov ponechané pri laboratórnej teplote (18-30 °C) dlhšie ako 8 hodín bez overenia prijateľnej miery účinnosti pred ďalším použitím tohto zásobníka (5). • Ak sú zásobníky po použití uchovávané v dispenzore, musia byť uchovávané pri +2-8 °C na suchom mieste s absorbentom vlhkosti umiestneným vnútri. Stabilita diskov v otvorených zásobníkoch umiestnených v dispenzoroch (podľa doporučení uchovávaných s absorbentmi vlhkosti) bola validovaná za rutinných podmienok. Stabilita v týždňoch je vyznačená vnútri tohto symbolu: 5- POTREBNÝ MATERIÁL, KTORY NIE JE SÚČASŤOU VÝROBKU • zásobník na disky: 6 diskov 8 diskov 12-16 diskov katalógové č. 50271 katalógové č. 50270 katalógové č. 50295 • • • • • kultivačné médium (Mueller-Hinton) reagencie bakteriálne kmene na kontrolu kvality opacitná kontrola ekvivalentná ku štandardu 0,5 Mac Farland laboratórne vybavenie nevyhnutné na testovanie citlivosti na antibiotiká pomocou agarovej difúznej metódy. 6- UPOZORNENIA Dodržujte inštrukcie podľa aktuálnych smerníc (CLSI/NCCLS, CA-SFM). Dodržujte vždy aktuálne platné techniky a pokyny týkajúce sa ochrany pred mikrobiologickými rizikami. Po použití sterilizujte kultúry a všetok kontaminovaný materiál. 7- POSTUP Vzorky: Disky nemožno použiť na testy prebiehajúce priamo na biologických vzorkách. Viď aktuálne smernice (CLSI/NCCLS, CASFM) definujúce prípravu inokula (čistá, čerstvá kultúra), inokuláciu Petriho misiek, inkubačnú teplotu a inkubačný čas.. Pri vytváraní antibiogramu postupujte podľa inštrukcií stanovených CLSI/NCCLS a CA-SFM. Disky, ktoré sú impregnované 3GC+CA (CCAZ, 30 µg/10 µg, CCTX, 30 µg/10 µg, CFEP, 30 µg/10 µg) s vopred definovanou koncentráciou umiestnite na povrch vhodného, naočkovaného média rovnako ako disky impregnované len 3GC (CAZ 30µg, CTX 30µg, FEP 30µg). Neustále dodržujte zásady Správnej laboratórnej praxe. 8- INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOV • Presne zmerajte priemery pozorovaných inhibičných zón - Ceftazidime+ klavulánnová kyselina/Ceftazidime Cefotaxime + klavulánnová kyselina /Cefotaxime Cefepime + klavulánnová kyselina /Cefepime • Bakteriálny kmeň je interpretovaný ako vykazujúci ESBL rezistentný fenotyp, ak je aktivita 3GC obnovená za prítomnosti CA. • Kmeň je ESBL pozitívny ak je aspoň jeden z rozdielov priemeru medzi (3GC+CA) a (3GC) väčší alebo rovný 5 mm (3)(4). 9- ÚČINNOSŤ / KONTROLA KVALITY TESTU Účinnosti antibiotických diskov sú systematicky kontrolované použitím nasledujúcich kmeňov: • Klebsiella pneumoniae ATCC® 700603 - CCTX-CTX CCAZ-CAZ CFEP-FEP ≥ ≥ ≥ 3 mmc 5 mmc 2 mmd • Escherichia coli ATCC® 25922 - CCTX-CTX ≤ 2 mmc - CCAZ-CAZ ≤ 2 mmc - CFEP-FEP ≤ 2 mmd c : Standard CLSI/NCCLS d : Standard Internal 10- KONTROLA KVALITY VYKONÁVANÁ VÝROBCOM Všetky vyrábané a komercializované reagencie sú kontrolované kompletným systémom kontroly kvality začínajúcim od prijatia surovín až po komercializáciu produktu. Každá šarža je podrobená kontrole kvality a je uvoľnená na trh len vtedy, keď odpovedá stanoveným akceptačným kritériám. Dokumentácia týkajúca sa výroby a kontroly každej jednotlivej šarže je uchovávaná našou spoločnosťou. 11- LIMIT POUŽITELNOSTI • Rezistentný fenotyp ako je ESBL je detegovaný meraním priemerov inhibičných zón: ku najbližšiemu milimetru, rozdielom medzi priemermi dvoch testovaných diskov, ktorý stanovuje, či je alebo nie je prítomná ESBL. Meranie zaokrúhlené na najbližší milimeter poskytuje akceptovateľnú hranicu chýb v laboratórnych podmienkach. • Výsledná interpretácia, rovnako ako všetky laboratórne interpretácie, nemôže byť založená na výsledkoch jedného samotného testu, ale na prehľade klinických dát a iných výsledkoch testov antibiotík. • Účinnosť testu nezávisí iba na aktivite disku, ale tiež na ďalších faktoroch akými je používanie vhodného inokula a kontrolných kmeňov, vhodné a vopred otestované kultivačné médium a správne uchovávanie. 12- LITERATÚRA 1) Bradford, P. Extended-spectrum beta-lactamases in the 21st century: characterization, epidemiology, and detection of this important resistance threat. Clin Microbiol Rev 2001;14:933-51. 2) Livermore D. Beta-lactamases in laboratory and clinical resistance. Clin Microbiol Rev 1995;8:557-84. 3) Bert F and al. Comparison of disks of cefotaxime, ceftazidime and cefepime combined with Clavulanic Acid for the detection of Extended-Spectrum Beta-lactamases. 24th RICAI 2004; 556/91P 4) CLSI/NCCLS: Clinical and laboratory Standards Institute/ National Committee for Clinical Laboratory Standards 5) CA-SFM: Comité de l’Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33 05/2005 KRĄŻKI ANTYBIOGRAMOWE DO WYKRYWANIA BETA-LAKTAMAZ O ROZSZERZONYM SPEKTRUM (ESBL) 50 KRĄŻKÓW W RURCE TEST POTWIERDZENIA DO WYKRYWANIA ESBL 1- ZNACZENIE KLINICZNE Wykrywanie beta-laktamaz o rozszerzonym spektrum (ESBL) komplikuje duża różnorodność enzymów plazmidowych, które hydrolizują i inaktywują liczne beta-laktamy. Enzymy te stale rozprzestrzeniają się wśród wielu gatunków bakterii. Wykrywanie tego rodzaju fenotypu oporności ma dwa cele: zastosowanie odpowiedniego leczenia oraz kontrola rozpowszechnienia tego mechanizmu oporności (1) (2). 2- ZASADA METODY Metoda polega na porównaniu in vitro aktywności krążków z cefalosporynami trzeciej generacji (3GC) oraz krążków zawierających tę samą cefalosporynę w połączeniu z kwasem klawulanowym (3GC + CA). Interpretacja opiera się na rekomendacjach CLSI/NCCLS i/lub dostawcy (3), dotyczących wykrywania ESBL u Enterobacteriaceae, w szczególności u szczepów wytwarzających duże ilości cefalosporynaz. 3- POSTAĆ TESTU Krążki produkowane przez Bio-Rad mają średnicę 6.5 mm i wykonane są z bibuły wysokiej jakości impregnowanej roztworami antybiotyków i inhibitora o dokładnie określonym stężeniu. Krążki z każdej strony są wyraźnie oznakowane 4 literowym symbolem. STĘŻENIE SYMBOL OPAKOWANIE NR KAT. Ceftazydym + kwas klawulanowy 30 / 10 µg CCAZ 1 x 50 krążków 68446 Cefotaksym + kwas klawulanowy 30 / 10 µg CCTX 1 x 50 krążków 68456 Cefepim + kwas klawulanowy 30 / 10 µg CFEP 1 x 50 krążków 68466 4- PRZECHOWYWANIE Podana data ważności odnosi się wyłącznie do krążków w nie otwieranym opakowaniu, przechowywanym zgodnie z zaleceniami producenta. Data ważności i numer serii znajdują się na etykiecie (na rurce z krążkami oraz na opakowaniu zewnętrznym). • Rurki z krążkami należy przechowywać w oryginalnym opakowaniu w temp. +2-8°C w suchym miejscu. • Przed otwarciem opakowanie z krążkami musi osiągnąć do temperaturę pokojową (18-30°C). Po wyjęciu potrzebnej liczby krążków, pozostałe schować do temp. +2-8°C. • Nie używać krążków po upływie terminu przydatności. W przypadku krążków, które były pozostawione w temperaturze pokojowej (18-30°C) ponad 8 godzin, należy zweryfikować ich aktywność przed dalszym użytkowaniem (5). • Krążki pozostające w dyspenserze powinny być przechowywane w temperaturze +2-8°C w suchym miejscu, z pochłaniaczem wilgoci wewnątrz pojemnika dyspensera. Stabilność krążków w otwartym opakowaniu lub w dyspenserze (przechowywanych zgodnie z zaleceniami z pochłaniaczem wilgoci) została potwierdzona w warunkach rutynowego użytkowania. Stabilność krążków, wyrażona w tygodniach, została przedstawiona wewnątrz symbolu: 1 5- INNE NIEZBĘDNE MATERIAŁY • dyspenser krążków na 6 krążków nr kat. # 50271 na 8 krążków nr kat. # 50270 na 12-16 krążków nr kat. # 50295 • podłoża mikrobiologiczne (Mueller-Hinton) • odczynniki • szczepy wzorcowe bakterii • wzorzec gęstości inokulum odpowiadający 0.5 w skali McFarlanda • sprzęt laboratoryjny do oznaczania wrażliwości na antybiotyki metodą dyfuzyjno-krążkową. 6- ZALECENIA DLA UŻYTKOWNIKA Należy postępować zgodnie z najnowszymi wytycznymi (CLSI/NCCLS, CA-SFM). Należy przestrzegać zasad bezpieczeństwa pracy z materiałem zakaźnym. Wykorzystane hodowle i wszystkie zanieczyszczone nimi materiały poddać sterylizacji. 7- PROCEDURA Próbki: Testu wrażliwości nie należy wykonywać na podłożach z bezpośrednio wysianym materiałem klinicznym. Sposób przygotowania stosowanego do testu inokulum bakterii (czysta, młoda hodowla), opis metody wysiania go na płytki Petriego, oraz temperaturę i czas inkubacji zawierają aktualne zalecenia CLSI/NCCLS i CA-SFM. Antybiogram należy wykonać zgodnie z instrukcjami CLSI/NCCLS i CA-SFM. Krążki nasycone 3GC+CA w określonym stężeniu (CCAZ 30µg/10 µg, CCTX 30µg/10 µg, CFEP 30µg/10 µg) oraz krążki z samą 3GC (CAZ 30µg, CTX 30µg, FEP 30µg) należy ułożyć na powierzchni odpowiedniego, zaszczepionego podłoża. Należy przestrzegać zasad dobrej praktyki laboratoryjnej. 8- INTERPRETACJA WYNIKÓW • Należy dokładnie zmierzyć średnice stref zahamowania wzrostu bakterii wokół krążków - Ceftazydym + kwas klawulanowy / ceftazydym - Cefotaksym + kwas klawulanowy / cefotaksym - Cefepim + kwas klawulanowy / cefepim • Szczep ma fenotyp oporności ESBL, jeżeli w obecności CA zostaje zachowana aktywność 3GC. • Aby szczep został uznany za dodatni pod względem ESBL, w przypadku co najmniej jednej cefalosporyny różnica wielkości strefy zahamowania wzrostu pomiędzy 3GC+CA i 3GC musi być równa lub większa od 5 mm (3) (4). 9- WŁAŚCIWOŚCI / KONTROLA JAKOŚCI Aktywność krążków należy systematycznie kontrolować przy pomocy następujących szczepów wzorcowych: • • ® Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 - CCTX-CTX ≥ 3 mmc - CCAZ-CAZ ≥ 5 mmc - CFEP-FEP ≥ 2 mmd ® Escherichia coli ATCC 25922 - CCTX-CTX ≤ 2 mmc - CCAZ-CAZ ≤ 2 mmc - CFEP-FEP ≤ : Standard CLSI/NCCLS d : Standard wewnętrzny 2 mmd c 10- KONTROLA JAKOŚCI PRODUCENTA Odczynniki zostały przygotowane zgodnie z systemem jakości, poczynając od materiałów wyjściowych, aż do ostatecznego produktu komercyjnego. 2 Odczynniki każdej serii podlegają oznaczeniu kontrolnemu i są dopuszczane do użytkowania, jeśli spełniają wymagane kryteria. Bio-Rad posiada protokoły produkcji i kontroli jakości każdej serii. 11- OGRANICZENIA METODY • Wykrycie fenotypu oporności takiego jak ESBL polega na pomiarze stref zahamowania wzrostu i często zależy od różnicy 1 milimetra w wielkości porównywanych stref zmierzonych dla dwóch krążków, co odpowiada marginesowi błędu laboratorium. • Ostateczna interpretacja, podobnie jak w przypadku innych testów laboratoryjnych, nie powinna opierać się na wyniku pojedynczego testu, lecz uwzględniać także dane kliniczne, oraz wyniki wrażliwości uzyskane dla innych antybiotyków. • Prawidłowe wykonanie testu wrażliwości zależy nie tylko od aktywności krążków, lecz i od szeregu innych czynników, jak stosowane inokulum, szczepy wzorcowe, podłoża, oraz sposób przechowywania krążków. 12- BIBLIOGRAFIA 1) Bradford, P. Extended-spectrum beta-lactamases in the 21st century: characterization, epidemiology, and detection of this important resistance threat. Clin Microbiol Rev 2001;14:933-51. 2) Livermore D. Beta-lactamases in laboratory and clinical resistance. Clin Microbiol Rev 1995;8:557-84. 3) Bert F and al. Comparison of disks of cefotaxime, ceftazidime and cefepime combined with Clavulanic Acid for the detection of Extended-Spectrum Beta-lactamases. 24th RICAI 2004; 556/91P. 4) CLSI/NCCLS: Clinical and laboratory Standards Institute / National Committee for Clinical Laboratory Standards 5) CA-SFM: Comité de l’Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33 05/2005 3