PRT-712.02-047 V2 Lactobac y Strept yogurt

PROCEDIMIENTO
RECUENTO DE LACTOBACILLUS
BULGARICUS Y STREPTOCOCCUS
THERMOPHILUS EN YOGURT.
APHA 17 Edición, modificado
Sección Microbiología
de Alimentos
1.
PRT-712.02-047
Fecha emisión:
Marzo 1999
Revisión: 2
Fecha revisión:
02-07-2010
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OBJETIVO
Conocer el número de Lactobacillus bulgaricus y Streptococcus thermophilus (microorganismos
característicos del yogurt) presentes en una muestra de yogurt.
2.
CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE
Se aplicará a las muestras de yogurt o en otros alimentos que se requiera su investigación.
3.
FUNDAMENTO
El método consiste en sembrar un volumen dado de una muestra representativa y homogénea del
alimento a analizar y/o diluciones de la misma en placas Petri, utilizando medios de cultivo
selectivo y en condiciones de tiempo, temperatura y exigencias de oxígeno apropiados para
cada microorganismo:
a) Medio MRS acidificado, seguido de una incubación anaeróbica a 37ºC ± 1º C por 72
horas para el conteo de Lactobacillus delbrueeckii subsp bulgaricus.
b) Medio M17 completo seguido por un incubación a 37º C ± 1ºC por 48 horas para el
conteo de Streptococcus thermophilus.
Después del período de incubación, se cuentan las colonias características y se confirma
mediante pruebas apropiadas y examen microscópico. El número de microorganismos
característicos por gramo de muestra es calculado a partir del número de colonias obtenidas en
placas cuyos niveles de dilución muestren un resultado significativo.
El Reglamento Sanitario vigente en el artículo 220 estipula que los microorganismos lácticos
presentes en el producto final deberán ser viables y en cantidad superior a 106 ufc/g.
4.
REFERENCIAS
4.1
“Standard Methods for the Examination of Dairy Products”, APHA 17 Edición, capítulo
9.080.
4.2
ISO/DIS 7889 Yogurt-Enumeration of characteristic microorganisms-Colony count
technique a 37 ºC . International Organization for Standardization. 1985.
4.3
Norma cubana: NC ISO7889:2009 “Yogurt _ Enumeración de los microorganismos
característicos- técnica del conteo de colonias a 37ºC” (ISO 7889:2003, IDT)
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5.
TERMINOLOGÍA
5.1
Atmósfera anaeróbica: al emplear el sobre de Anaerogen se reduce el nivel de oxígeno de
la jarra por debajo de 1% en 30 minutos. El nivel resultante de dióxido de carbono oscilará
entre 9 y 13 %.
5.2
AnaeroGen: Sistema generador de atmósfera anaeróbica que contiene como componente
activo ácido ascórbico. La reacción del ácido ascórbico con el oxígeno es exotérmica y
alcanza una temperatura de 65 º C.
5.3
Indicador anaeróbico: Es una tira de algodón impregnada en una solución indicadora redox
y que permite controlar visualmente que las condiciones anaeróbicas han sido alcanzadas y
mantenidas. La condición anaeróbica se visualiza por el cambio de color del rojo al blanco.
5.4
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus: Microorganismo termófilo, que forma
colonias lenticulares y frecuentemente aguzadas de diámetro desde 1 mm a 3 mm en el
medio MRS acidificado. Al microscopio estos microorganismos aparecen como bacilos,
generalmente cortos, en ocasiones alargados. No forman esporas, son Gram positivos, no
móviles y catalasa negativos.
5.5
Streptococcus thermophilus: Microorganismos termófilos que forman colonias lenticulares
de diámetro desde 1 mm a 2 mm en medio M-17, bajo las condiciones especificadas en
este procedimiento. Al microscopio, estos microorganismos aparecen como células ovoides
o esféricas (de diámetro 0,7 µm a 0,9 µm), en pares o en cadenas largas. Son Gram
positivos y catalasa negativos.
6.
MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS
6.1
EQUIPOS
6.1.1
Contador de colonia
6.1.2
Incubadora regulada a 37º C ± 1
6.1.3
Baño de agua termorregulado a 50ºC
6.1.4
Equipo de incubación en atmósfera de CO2 : (jarra 3,5 L= Oxoid HP 11)
(jarra 2,2 l= Oxoid)
6.1.5
Stomacher 400
6.1.6
Baño de agua regulado a 47ºC ± 2ºC.
6.1.7
pHmetro
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MATERIALES
6.2.1
Placas de Petri de 100 mm de diámetro.
6.2.2
Pipetas graduadas de 1 ml y 10 ml estériles.
6.2.3
Frascos Schott de 250 mL con tapa rosca para envasar los medios de cultivo.
6.2.4
Láminas portaobjetos.
6.2.5
Sobre generador de atmósfera anaeróbica (AnaeroGen):
para jarra 3,5 L utilizar Oxoid AN35 (envase c/ 10 bolsitas)
para jarra 2,5 L utilizar Oxoid AN25 (envase c/ 10 bolsitas)
6.2.6
Indicador de anaerobiosis (Oxoid BR55)
6.2.7
Espátulas estériles
6.3
MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS
6.3.1
Agua peptonada 0,1 % en frascos tapa rosca con 90 mL
6.3.2
Agua peptonada 0,1 % en tubos graduados con 9 mL.
6.3.3
Agar M 17 con B-glicerofosfato de sodio.
6.3.4
Agar MRS.
6.3.5
Leche descremada reconstituida al 0,1% (para blancos de dilución).
6.3.6
Reactivos Tinción de Gram.
6.3.7
Solución de lactosa al 10%.
6.3.8
Acido acético para reducir pH a 5.4 ± 0,1 en agar MRS después de la esterilización.
7.
DESARROLLO
Para requerimientos generales, ver ISO 8261/ IDF 122.
7.1
7.1.1
Yogures no afrutados:
Mezclar cuidadosamente el contenido del recipiente de la muestra usando una
espátula.
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Pesar 10 g ± 0,1 g de la muestra de ensayo en un recipiente disponible (utilizar un
tubo de centrífuga de fondo redondo de cristal resistente de 200 mL o la concavidad
del mezclador rotatorio o el recipiente plástico del mezclador peristáltico).
Yogures afrutados
7.2.1
Mezclar el contenido completo del recipiente de la muestra por 1 minuto usando el
mezclador.
7.2.2
Pesar 10 g ± 0,1 g de la muestra de ensayo en un recipiente disponible como se
describe en 7.1.2.
7.3
Examen microscópico
7.3.1
7.4
Realizar un examen microscópico preliminar, observando varios campos de un frotis
de la muestra previamente teñida de azul de metileno, para estimar la densidad de los
dos tipos de bacterias, cocos y bacilos y seleccionar el rango de dilución apropiado
que será empleado para el conteo de cada tipo.
Preparación dilución primaria
7.4.1
Tomar 10 mL o g de muestra de yogurt y colocar en un tubo con tapa rosca con 10 mL
de buffer fosfato pH 7. Se tiene la dilución 1/2.
7.4.2
Preparar diluciones decimales utilizando agua peptonada 0,1 % y pipetas de 1 mL.
7.4.3
Tomar 2 mL de la dilución 1/2 y colocar en un tubo con 8 mL de agua peptonada 0,1
%. Se tiene la dilución 10-1.
7.4.4
Tomar 1 mL de la dilución 10-1 y colocar en un tubo con 9 mL de agua peptonada 0,1
%. Se tiene la dilución 10-2
7.4.5
Repetir el punto 7.4 4. hasta realizar la dilución 10-7.
7.4.6
Otra manera de preparar diluciones es a los 10 g preparados en 7.1 y 7.2 agregar el
diluyente a estas porciones hasta una masa de porción de ensayo 50 g.
7.4.7
Mezclar por 1 minuto con el mezclador.
7.4.8
Diluir a 100 g con el diluyente para obtener una dilución 10-1.
7.4.9
Hacer diluciones decimales tomando 1 ml de dil -1 a 9 mL de agua peptonada.
7.4.10
Repetir 7.4.9 hasta dil -7 si es necesario.
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Controles
7.5.1
Realizar control de ambiente con placas con agar Plate Count.
7.5.2
Realizar control de esterilidad al agar MRS, al agar M 17 con B-glicerofosfato de
sodio y al agua peptonada 0,1 %.
7.6
Inoculación e incubación
7.6.1
Marcar placas de Petri en duplicado de la dilución 10-4, 10-5, para Lactobacillus
bulgaricus.
7.6.2
Marcar placas de Petri en duplicado de la dilución 10-4, 10-5, para Streptococcus
thermophilus.
7.6.3
Sembrar por duplicado en placas de Petri 1 ml de cada una de las diluciones
seleccionadas.
7.6.4
Vertir 15 ml de medio Agar MRS acidificado previamente fundido y temperado a 47º
C ± 2ºC en las placas marcadas para Lactobacillus bulgaricus.
7.6.5
Verter 15 ml de medio M 17 con B-glicerofosfato de sodio previamente fundido y
temperado a 47º C ± 2ºC en las placas marcadas para Streptococcus thermophilus.
7.6.6
Mezclar cuidadosamente el inóculo con el medio por rotación y dejar solidificar
sobre una superficie plana y fría.
7.6.7
Incubar las placas bajo las siguientes condiciones según el medio de cultivo:
7.6.7.1
Las placas con agar M 17 con B-glicerofosfato de sodio en posición invertida e
incubarlas a 37 ºC ± 1ºC por 48 h en aerobiosis.
7.6.7.2
Colocar no más de 6 placas por pila. Las pilas de placas deberán ser separadas unas de
otras, de las paredes y del techo de la incubadora.
7.6.7.3
Las placas con Agar MRS en posición invertida en el portaplacas de la jarra
incubarlas a 37ºC ± 1ºC por 72 h en atmósfera de aproximadamente 10-20% de
dióxido de carbono (CO2).
7.6.7.4
Colocar el porta placas dentro de la jarra.
7.6.7.5
Colocar no más de 6 placas por pila. Las pilas de placas deberán ser separadas unas de
otras, de las paredes y de la tapa de la jarra.
7.6.7.6
Poner el indicador de anaerobiosis en la pared de la jarra.
7.6.7.7
Abrir el sobre de aluminio y extraer la bolsa de AnaeroGen.
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Nota: la bolsita de AnaeroGen se calienta cuando es expuesta al aire.
7.6.7.8
Colocar la tapa de la jarra inmediatamente.
Nota: El tiempo que transcurre entre que se abre el sobre de aluminio y que se cierra
la jarra no debe ser mayor de 1 minuto. Una exposición mas prolongada hace
disminuir la reactividad y puede dar lugar a que no se obtenga totalmente las
condiciones anaeróbicas de la jarra.
7.6.8
Finalizado el período de incubación retirar las placas de la jarra.
7.6.9
Antes de abrir la jarra verificar que el indicador de anaerobiosis halla virado a color
blanco.
Nota: Si las placas son revisadas y requieren reincubación debe utilizarse un nuevo
sobre de AnaeroGen siguiendo el proceso desde el punto.
7.6.10
Dejar por lo menos 20 a 30 minutos que la bolsita de AnaeroGen alcance la
temperatura ambiente antes de eliminarla en los contenedores.
7.6.11
Eliminar la bolsita de AnaeroGen en bolsa compactadora, para enviarla como basura
de riesgo a la Unidad de Ingeniería (el ISP la elimina en bolsa roja).
7.7
Conteo de colonias
7.7.1
Seleccionar las placas que contengan entre 25 a 250 ufc. y contar las colonias
características:
7.7.1.1
En el agar M 17 con B-glicerofosfato de sodio, las colonias de Streptococcus
thermophilus son blanquecinas de 1-2 mm de diámetro, de bordes lisos, redondas o
lenticulares.
7.7.1.2
En el agar MRS las colonias de Lactobacillus bulgaricus son blanquecinas de 2-3 mm
de diámetro, de bordes lisos o rugosos, redondas o lenticulares o en forma de estrella,
convexas, suaves y opacas sin pigmento.
7.7.2
Examinar las placas bajo condiciones de luz adecuadas, para facilitar el conteo puede
emplearse el contador de colonias. No cometer errores al contar restos de partículas
disueltas o precipitadas de la muestra como colonias. Examinar las colonias dudosas
cuidadosamente, empleando una lupa de mayor aumento requerido para distinguir las
colonias de partículas extrañas.
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Confirmación
7.8.1
Seleccionar las colonias de las placas usadas para el conteo tal que el número tomado
de las mismas sea igual a la raíz cuadrada del conteo total de colonias.
7.8.2
Confirmar por coloración de Gram (IT-712.00-066) si es necesario las características
morfológicas de los microorganismos investigados.
7.8.3
Las colonias provenientes del agar MRS son bacilos Gram positivos, no formadores
de esporas, generalmente largos y delgados, en cadenas o filamentos algunos
presentan granulaciones internas y catalasa negativos.
7.8.4
Las colonias provenientes del agar M17 son cocos Gram positivos en cadenas o en
pares, catalasa negativos.
7.8.5
La identificación de cepas dudosas puede ser realizada acorde a la ISO 9232/IDF 146
7.8.6
Anotar los resultados en el registro RG-712.00-042.
7.9
Cálculo y Expresión de los resultados
7.9.1
Calcular el recuento el número de microorganismos característicos en la muestra de
ensayo usando la siguiente ecuación cuando se obtengan dos diluciones consecutivas
dentro de placas normales:
ΣC
N=
[ ( 1 x n1 ) + ( 0.1 x n2 ) ] x d
donde:
N = número de colonias por ml o g de producto
Σ C = suma de todas las colonias contadas en todas las placas
n1 = número de placas contadas de la menor dilución.
n2 = número de placas contadas de la dilución consecutiva.
d
7.9.2
= dilución de la cuál fue obtenido el primer recuento
Cuando no se pueda aplicar la fórmula y se obtenga promedio, el número de unidades
formadoras de colonias, obtenido en las placas correspondientes a la dilución
seleccionada, se multiplica por el factor de dilución correspondiente, se promedian los
resultados y el valor final se expresa en ufc por gramo o por ml según corresponda.
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7.9.3
Los resultados para cada microorganismo presente en la muestra se expresan en
unidades formadoras de colonias por gramo o por ml (ufc/g o ufc/ml).
7.9.4
Si hay sólo recuentos menores a 10, reportar el número de microorganismos por
gramo como:
Menor que 10 x 1/d (siendo d el valor correspondiente a la dilución más baja)
7.9.5
Si hay sólo recuentos que exceden los 250 ufc, hacer un recuento estimada de las
placas que tengan un recuento más cercano a 250 ufc y multiplicar por el recíproco del
valor correspondiente a la dilución más alta. Registrar como recuento estimado.
7.9.6
Los resultados deberán ser expresados como número de 1,0 a 9,9 multiplicado por la
potencia de 10 apropiada.
7.9.7
El número total de microorganismos característicos, N, por gramo de muestra es igual
a:
N = NL + NS
Donde :
NL = es el valor numérico del Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus por gramo.
NS = es el valor numérico de Streptococcus thermophilus por gramo.
8.
8.1
REGISTROS
Registro de resultados análisis recuento de lactobacillus bulgaricus y Streptococcus
thermophilus en muestras de yogurt.
9.
ANEXOS
No Aplica