Tecnología del DNA recombinante

Tecnología del DNA
recombinante
Dra. Elena Alvarado León
Dpto. de Morfología Humana
DNA recombinante
DNA recombinante: asociación nueva entre
fragmentos de DNA que no se encuentran
juntos normalmente.
Propiedad básica del DNA :
El acoplamiento de cadenas por complementariedad.
La extraordinaria especificidad del reconocimiento
entre secuencias de bases complementarias
constituye un poderoso instrumento para la
identificación, aislamiento, clonación, de fragmentos
de DNA complementarios a uno dado
DNA recombinante
Secuencia para la creación de
molécula de DNA recombinante:
una
1. Obtención de los fragmentos de
DNA que se quieren manipular (DNA
foráneo, DNA diana, DNA clonado, el
inserto de DNA) utilizando enzimas
de restricción
2.
Unión de los segmentos de DNA
con otras moléculas denominadas
vectores de clonación
3. Introducción
del
DNA
recombinante
en
células
hospedadoras, donde se replicará y
producirá numerosas copias idénticas
o clones
R
R
R
Digestió amb l'enzim de restricció
R
Unió
Plasmidi recombinant
Transformació
de bacteris
Cromosoma
bacterià
Plasmidi
Cultiu bacterià amb
moltes còpies del
DNA clonat
Tecnología del DNA recombinante
Molécula A
Molécula B
Digestión de ambas moléculas con la
misma enzima de restricción, BamHI
Extremos
cohesivos
Mezclar
Tratar con ADN-ligasa
ADN recombinante
HERRRAMIENTAS: ENZIMAS DE
RESTRICCION
• Descubiertas por W. Arber, H. Smith y Nathans a
fines de los 60
• Reconocen secuencias específicas en el DNA de
doble cadena
• Cortan ambas cadenas en lugares concretos
• Reconocen secuencias específicas de 4-8 pares
de bases
Tipos de enzimas de restricción
• Tipo I: Realizan corte y metilación, requieren de
ATP, cortan sitios aleatoriamente,distintos del
sitio de reconocimiento
• Tipo II: Realizan corte, no requieren ATP, cortan
dentro del sitio de reconocimiento
• Tipo III: Corte y metilación, utilizan ATP,cortan
sitios aleatorios cerca de los sitios de
reconocimiento
Tecnología del DNA recombinante
Clonación: vectores y hospedadores
Para conservar y propagar los fragmentos de DNAen el
interior de las células hospedadoras, es necesario emplear
unos vehículos que los transporten: vectores de
clonación.
Características:
-Capacidad para replicarse autónomamente en el interior
de las células hospedadoras
-Capacidad para aceptar fragmentos de ácido nucleico
heterólogo, el cual se propaga y mantiene junto al vector
-Poseen un marcador seleccionable que facilita la
identificación de las células dónde ha insertado
-Su recuperación de las células hospedadoras no ha de
implicar ninguna dificultad
Tecnología del DNA recombinante
Clonación: vectores y hospedadores
VECTORES DE CLONACIÓN
Vectores plasmídicos con alto número de
copias de tipo estándar
Vectores de inserción del fago lambda
Vectores de reemplazamiento del fago lambda
Vectores cosmídicos
Bacteriófago P1
Vectores PAC (cromosomas artificiales de P1)
Vectores BAC (cromosomas artificiales de bacterias)
Vectores YAC (cromosomas artificiales de levadura)
TAMAÑO DEL
INSERTO
0 a 10kb
0 a 10kb
9 a 23kb
30 a 44kb
70 a 100kb
130 a 150kb
hasta 300kb
200 a 2000kb
Capacidad de clonación de los diferentes tipos de vectores
Los más utilizados: plásmidos,
bacteriófagos,
cósmidos y los cromosomas artificiales de levadura
Tecnología del DNA recombinante:
Clonación: vectores y hospedadores
Plásmidos: Moléculas circulares extracromosómicas de DNA
bicatenario, heredadas de manera estable durante las sucesivas
generaciones celulares. Los más utilizados son del tipo
multicopia.
EcoR I Cla I Hind III
(A)
BamH I
Sph I
Sal I
Rru I
Pvu I
Pst I
Resistència
a ampicilina
Xma III
Resistència
a tetraciclina
(B)
Nru I
lacZ' + MCS
pBR322
ori
Ava I
Bal I
ori
r
amp
Sna I
ATG
1
2
3
4
5
6
THR
MET
ILE
THR
ASN
SER
ACC
ATG
ATT
AAT
TCG
ACG
EcoRI
Pvu II
(1
ser
2
3
4
5
6
7
8
ser
val
pro
gly
asp
pro
leu
AGC TCG
Sst I
GTA
CCC GGG GAT
KpnI
CCT
BamHI
Sma I
XmaI
9
10
11
12
13
14
glu
ser
thr
cys
arg
his
ACC
TGC
CTA GAG TCG
XbaI
Sal I
Acc I
HincI
AGG CAT
Pst I
15
16
17
18)
ala
ser
leu
ala
LEU
ALA
GCA
AGC TTG
GCA
CTG
GCC
Sph I
7
8
HindIII
(A) plásmido pBR322 (B) plásmido pUC: los plásmidos
pUC retiene el gen de resistencia a la ampicilina.
Tecnología del DNA recombinante
Clonación: vectores y hospedadores
Bacteriófagos Pueden actuar como vehículos naturales en la
transducción de DNA bacteriano. Los fagos modificados por
ingeniería genética pueden hacer lo mismo a partir de cualquier
tipo de DNA. Los más conocidos derivan del fago lambda de E.
coli. Se dividen en vectores lambda de inserción y de
reemplazamiento o sustitución.
(A)
R
Fag
R
de reemplaçament
(B)
R
Insert de 20 kb
R
Fag
(C)
R
R
d'inserció
R
Insert de 5 kb
R
R
R
Insert de 45 kb
Cosmidi
Vectores derivados del fago lambda: (A) fago lambda de reemplazo. (B)
fago lambda de inserción. (C) cósmido
Tecnología del DNA recombinante
Clonación: vectores y hospedadores
Cósmidos Plásmidos con la secuencia cos del fago lambda.
Los cósmidos recombinantes son encapsula-dos en partículas
fágicas con capacidad infectiva y se replican como plásmidos
en el interior de las células hospedadoras.
cósmido
Tecnología del DNA recombinante: Clonación:
vectores y hospedadores
Cromosomas artificiales. Fragmentos de DNA de gran
longitud, de unas cuantas megabases: YAC, yeast
artificial chromosomes.
Secuencias eucarióticas necesarias para construir un YAC:
-Dos telómeros, para la replicación completa y para la
protección de los extremos de las moléculas de DNA lineales
-Un centrómero, para la correcta segregación de las
cromátidas hermanas durante la mitosis y de los
cromosomas homólogos en la meiosis
-Un origen de replicación o región autónoma de
replicación (ARS), para la replicación independiente del
cromosoma
También: marcador
restricción
seleccionable
y
dianas
de
Tecnología del DNA recombinante
Clonación: vectores y hospedadores
Otros tipos de cromosomas artificiales que se utilizan junto
con los YAC y los cósmidos para generar mapas físicos de
genomas son los BAC (“Bacterial Artificial Chromosomes”,
cromosomas bacterianos artificiales) y los PAC (“Phage P1based artificial chromosomes”, cromosomas artificiales
derivados del bacteriófago P1).
Estructura de un cromosoma artificial
bacteriano
(BAC)
utilizado
para
la
clonación de fragmentos de DNA grandes.
CMR es un marcador seleccionable de
resistencia al cloramfenicol. oriS, repE,
parA y parB son genes del plásmido F que
controlan la replicación y el número de
copias por célula. cosN es el lugar cos del
fago lambda. HindIII y BamHI son sitios
de clonación en los que se inserta el DNA
foráneo. Los dos promotores permiten
transcribir el fragmento insertado. Los
sitios NotI se utilizan para retirar el
fragmento insertado
Tecnología del DNA recombinante
Clonación: vectores y hospedadores
Vectores de expresión
Se caracterizan por disponer de un promotor muy activo y
en algunos casos regulable, que asegure la síntesis de la
proteína.
El producto que se obtiene es muchas
veces una proteína de fusión porque,
además del producto del gen insertado, presenta unos pocos aminoácidos extra en el extremo aminoterminal, propios de la proteína del
hospedador
Vector de expresión de la serie pIN.
Tecnología del DNA recombinante
Clonación: vectores y hospedadores
Los hospedadores
Las bacterias son los organismos más utilizados como receptores
del DNA recombinante, tanto por razones históricas como por las
ventajas que ofrece su uso.
Con respecto a los organismos eucariotas, la levadura es uno de
los más utilizados como hospedador del DNA recombinante,
debido a su facilidad de manipulación en el laboratorio, su rápido
crecimiento, la abundancia de mutantes disponibles y de vectores
para su transfor-mación, y el amplio conocimiento molecular que
se tiene de este organismo.
Tecnología del DNA recombinante
Genotecas: obtención y tipos
Las genotecas son colecciones de clones de DNA obtenidas a
partir de cierto DNA donador
Genoteca genómica: genoteca que comprende un genoma
completo
Genoteca de cDNA: genoteca compuesta de cDNA obtenido
a partir de los RNAm de un determinado tejido o tipo celular
Genoteca de expresión: genoteca realizada con un vector
que lleva señales adecuadas para provocar que cualquier
inserto de DNA clonado genere un mRNA y, en última
instancia, un producto proteico.
2
0
0
3
Tecnología del DNA recombinante
Genotecas: obtención y tipos
Método más común para
construir una genoteca genómica:
fraccionamiento
del
DNA de partida con una
enzima de restricción y la
clonación no selectiva de
todos los fragmentos obtenidos. Este método se denomina
método de la perdigonada.
Obtención de una genoteca genómica:
primero se fracciona el DNA genómico y
los fragmentos obtenidos son clonados
al azar en vectores específicos. Estos
mantendrán y propagarán los respectivos insertos dentro de las células
hospedadoras, cada una de las cuales
es portadora de un DNA recombinante
diferente.
Genoma de
l'organisme
Fragmentació per
crear extrems
cohesius o roms
Clonatge en fags
o cosmidis
Amplificació i
aïllament del
vector en E. coli
GENOTECA
Tecnología del DNA recombinante
Genotecas: obtención y tipos
Para aislar un gen en un organismo eucariótico quizás es
más fácil utilizar las genotecas construidas a partir de los
5'
AAA-OH 3'
mRNA, es decir, genotecas de cDNA.
Oligo(dT) + transcriptasa inversa
Obtención de cDNA. Primero, se dispone de
un mRNA eucariótico, portador de una cola
poli(A) en el extremo 3'. La utilización de
un cebador oligo(dT) posibilita la transcripción inversa de RNA a DNA por la
polimerasa correspondiente. Así se obtiene
la primera cadena de cDNA. El RNA molde
se elimina con RNAsa H, y por la vía de la
transferasa terminal se añaden colas
poli(dC) al extremo 3' del cDNA. La
segunda cadena es sintetizada empleando
cebadores oligo(dG) y el fragmento Klenow
de la
DNA polimerasa. Para facilitar la
clonación del cDNA en un vector, se recurre
otra vez a la transferasa terminal, que
construye extremos coherentes entre las
dos moléculas. El DNA recombinante
formado se utiliza para transformar una
cepa bacteriana
5'
3'
AAA-OH 3'
TTT 5'
RNAasa H
3'
TTT 5'
Transferasa terminal + dCTP
3' HO-CCC
3' HO-CCC
5' GGG
TTT 5'
Oligo(dG) + DNA polimerasa
(fragment Klenow)
TTT 5'
AAA-OH 3'
3' HO-CCCCCC
5' GGG
Transferasa terminal + dCTP
TTT 5'
AAACCC-OH 3'
3'
HO-GGG 5'
+
VECTOR
CCC
C C G GG C
G
G
G
CC
A
G C AA T
G G T T
5'
GGG-OH 3'
Tecnología del DNA recombinante
Genotecas: obtención y tipos
Las genotecas de expresión requieren para su
construcción del uso de
vectores de expresión los
cuales se caracterizan por
disponer de todas las secuencias reguladoras necesarias para permitir la
expresión del gen insertado.
1
Inserción de un fragmento de
clonación
Plásmido
Plásmidos
gen de resistencia
a la ampicilina
2
3
Extremos cohesivos
Molécula de ADN recombinante
Plásmido
Introducción del vector
1
Inserción de un fragmento de
clonación
Virus
2
3
Inserción de un fragmento de
clonación
Ciclo lisogénico
Ciclo lítico
(f)
(g)
(h)
ACTTTGTCCACGGCCTAAGCGTTTTTTGCCC
Secuenciación
de genomas
AGTGACTTTGTCCAAC
GTCCAACAGTTACCAAGTGACTTTGTCCAC
TTTTGCCC
AGTGACTTTGTCCA
ACGGCCTAAGCGTTTTTTTT
ALINEAMIENTO DE TODAS LAS SECUENCIAS Y RECONSTRUCCIÓN DEL CROMOSOMA
METODO DE SANGER (1977)
El método dideoxi
(Sanger.1977) se basa
en el empleo de
didesoxinucleótidos que
carecen de uno de los
grupos hidroxilo,
cuando uno de estos
nucleótidos se
incorpora a una cadena
de ADN en crecimiento,
está cadena no puede
continuar elongándose
ya que la ADN
polimerasa necesita un
extremo 3’ OH para
añadir el siguiente
nucleótido.
Secuenciación del DNA
Clonación y secuenciación del DNA
27
Secuenciación automatizada del DNA
Clonación y secuenciación del DNA
Clonación y secuenciación del DNA
29
Clonación y secuenciación del DNA
30
Clonación y secuenciación del DNA
31
Clonación y secuenciación del DNA
32
Diagnóstico de enfermedades de origen genético
Mediante ingeniería genética
se construye una sonda de
ADN, marcada (marcaje
fluorescente), con la
secuencia complementaria del
ADN enfermo
ADN sano
ADN enfermo
Conocimiento previo de
la secuencia de ADN
enfermo
Biochip
Microarray
DNAchip
ADN complementario
del ADN enfermo
DIAGNÓSTICO
Si aparecen bandas
fluorescentes
demuestra que la
persona presenta la
anomalía
¿Hibridación?
Renaturalización Desnatura
¿No hibridación? del ADN con la lización
sonda
del ADN
fluorescente
ADN de la
persona que se
quiere
diagnosticar