Transcripción en eucariontes Diferentes tipos de RNA polimerasas ! 1. RNA Polimerasa I sintetiza RNA ribosomal (rRNA) 5.8S, 18S y 28S. ! 2. RNA Polimerasa II sintetiza RNAs mensajeros (mRNA), RNAs pequeños nucleolares (snoRNA), micro RNAs (miRNA), RNAs pequeños interferentes (siRNA) y la mayoría de RNAs pequeños nucleares (snRNA). ! 3. RNA polimerasa III sintetiza RNAs de transferencia (tRNAs), rRNA 5S y algunos RNAs pequeños nucleares (snRNAs). ! En plantas hay RNA Polimerasa IV y V involucradas en la síntesis de ciertos siRNAs y silenciamiento epigenético. La Topología del DNA eucarionte impone mayor limitación al acceso de la RNA polimerasa y factores de transcripción Organización nuclear eucarionte Nucleolo Territorios cromosómicos Fábricas transcripcionales Poros nucleares Complejos ribonucleoprotéicos nucleares Territorios cromosómicos nucleares Fábricas transcripcionales Chakalova et al., 2005 TRANSCRIPCIÓN ACTIVA TRANSCRIPCIÓN INACTIVA INTERFASE METAFASE REPLICACIÓN EUCROMATINA VS HETEROCROMATINA B Transcripción A Proteínas modificadoras de Histonas Remodeladores de cromatina Factores de Transcripción y RNA polimerasa Otros Remodeladores de cromatina Promotores Basales eucariontes Clase II (RNA pol II) para mRNAs INICIO Eucariontes Bacteria Unión TBP Unión Holoenzima Cambio conformacional Unión TFIIB Unión RNA pol II y TFIIF Complejo cerrado Complejo de pre-inicio Complejo abierto Unión TFIIE y TFIIH Síntesis de RNA Liberación de Sigma Complejo de inicio Síntesis de RNA Fosforilación de CTD De RNA pol II y liberación De varios factores TFII Escape del promotor Escape del promotor Factores Basales de transcripción Clase II (TFII) TFIID: TBP (proteína de unión a caja TATA) y factores accesorios TFIIA: Estabiliza la unión de TFIID TFIIB: Ayuda a posicionar al complejo de factores y la RNA pol II sobre el promotor TFIIF: Proporciona la ocupación de 30 pb, tiene actividad de helicasa para abrir la doble cadena en el sitio +1 TFIIE: Recluta a TFIIH y regula sus actividades de helicasa y cinasa TFIIH: Complejo de 9 subunidades: actividad de helicasa para abrir la doble hélice e iniciar transcripción; actividad de cinasa para fosforilar el Dominio Carboxilo Terminal (CTD) de la RNA pol II y permitir escape del promotor; actividad de exonucleasa para reparar errores en NER La unión de TBP a un sitio TATA distorsiona la cadena y permite el reconocimiento del sitio +1 por las tres polimerasas eucariontes La RNA polimerasa II - 12 subunidades formando un complejo de mas de 500 kDa cola que se fosforila (CTD) RNA pol bacteriana Esquema General del Complejo Transcripcional Eucarionte TFs: Factores basales de transcripción; TFI (RNA pol I), TFII (RNA pol II), TFIII (RNA pol III) TAFs: Factores de transcripción accesorios (facilitan la unión de TFs) Activadores: Proteínas que unen secuencias distantes en el DNA llamadas “enhancer” o “intensificador” y estimulan la transcripción Represores: Proteínas que unen secuencias distantes en el DNA llamadas “silencer” o “silenciador” y reprimen la transcripción MEDIADOR: Complejo MULTI-proteico que comunica a los Activadores/Represores con TFs/TAFs para REGULAR los niveles de Transcripción (NO se une directamente al DNA) PIC: Complejo de pre-inicio de la transcripción Unidades transcripcionales Clase I (Transcritos por RNA pol I) ARN ribosomal 18S, 28S, 5.8S Unidades transcripcionales Clase III (Transcritos por RNA pol III) Los promotores de Clase III (RNA pol III) se distinguen por ubicarse dentro de la región que se transcribe (entre +41 y +87) Unidades transcripcionales de tRNAs y rRNA 5S, otros snRNAs El complejo de RNA pol III es el mas grande y pesa 700 kDa ELONGACIÓN Bacteria Eucariontes ELONGACIÓN mRNA Eucariontes Modificación del extremo 5’ del RNA Remoción de intrones Modificación del extremo 3’ del RNA 1. Capping Adición de “cap” (7mGpppN) en el extremo 5’ 1) La fosfatasa remueve un fosfato del 5´ 2) Una guanil transferasa agrega GMP 3) Una metil transferasa agrega el grupo metilo ¿Para qué el 5’ Cap? 1. Le da estabilidad al mRNA en el extremo 5’ (evita corte por exonucleasas de RNA). 2. Permite la exportación nuclear del mRNA, o en su caso la retención en el núcleo. 3. Posibilita el inicio de la traducción en mRNAs eucariontes. 4. Promueve la degradación de mRNAs cuando están las señales celulares apropiadas. 2. Remoción de intrones (splicing) Corte en la unión exónintrón; junta dos exones Dos reacciones de transesterificación Catalizadas por RNA; RIBOZIMA Existen secuencias específicas en los límites exón-intrón y una Adenina en contexto de secuencia que promueve la catálisis R= purinas Y= pirimidinas Una molécula de RNA (snRNA) es responsable del corte: actividad RIBOZIMA Los snRNAs forman parte de partículas ribonucleoprotéicas (snRNPs): U1, U2, U4, U5, U6 Además participan otras proteínas como BBP y U2AF 3. Poliadenilación en extremo 3’ TERMINACIÓN TERMINACIÓN Proteínas específicas reconocen las secuencias de poliadenilación El RNA es cortado y la enzima Poli-A polimerasa (PAP) agrega Adeninas (50-250) TERMINACIÓN TERMINACIÓN Proteínas de unión a la cola de poli A se unen (PABP) Pueden existir cortes alternativos de intrones/exones en el premRNA (Splicing altenativo) y sitios alternativos de poliadenilación Fuente de variabilidad genética, dependiendo de tejido, desarrollo, etc. Un gen 5 mRNAs maduros 5 proteínas diferentes El receptor de exporte nuclear dirige la salida del mRNA del núcleo al citoplasma La salida del mRNA es coordinada por proteínas unidas a la molécula: CBC: Complejo de proteínas de unión al “5’ Cap” EJC: Complejo de “splicing” de intrones PABP: Proteína de unión a cola de poli A Inhibidores de la transcripción eucarionte + N H Acridina Actinomicina D Sar L-Pro Sar L-meVal D-Val O L-Pro D-Val L-Thr O L-meVal O L-Thr C C N Se intercala entre bases G y C NH2 O O CH3 O CH3 a-amanitina Es un octapéptido bicíclico que se obtiene del hongo Amanita phalloides. Inhibe la transcripción de la RNA polimerasa II eucarionte. Resumen Procariontes Eucariontes 1. Todas las especies de RNA son sintetizadas por la misma especie de RNA polimerasa. 1. Hay 3 diferentes RNA polimerasas responsables de la transcripción de diferentes moléculas de RNA 2. El mRNA se traduce durante la transcripción. 2. El mRNA es procesado antes de ser transportado a citoplasma (adición de CAP, cola de poliA, splicing 3. Los genes son segmentos contiguos de DNA alineados ininterrumpidamente con el RNA traducido a proteína. 3. Los genes frecuentemente se interrumpen por intrones. 4. Los mRNAs son frecuentemente policistrónicos (operones) 4. Los mRNAs son monocistrónicos 5. La RNA polimerasa solo requiere a sigma para reconocer el promotor 5. Las RNA polimerasas requieren múltiples factores de transcripción adicionales para reconocer el promotor. 6. No hay procesamiento co- y posttranscripcional del mRNA 6. El mRNA sufre procesamiento extenso durante y después de la transcripción