Cap 3. Experimental

III. EXPERIMENTAL
Experimental
III. EXPERIMENTAL
1. Toma y preservación de muestras
Para la toma de muestra se ha seleccionado un total de 29 puntos, de
los cuales 8 se han localizado a lo largo del litoral de Huelva y 21 en 8
estuarios que desembocan en este litoral.
Los puntos de muestreo y el número de muestras tomadas se recogen
en la tabla 8.
Tabla 8. Situación geográfica y número de muestras de los puntos de muestreo
Toma de muestras
Situación geográfica
Número de muestras
Litoral de Huelva
8
Río Guadiana
2
Río Carreras
2
Río Piedras
2
Río Odiel
3
Río Tinto
3
Canal del Padre Santo
3
Río Guadalquivir
4
Dársena del Río Guadalquivir
1
Río Guadaira
1
Las muestras se han tomado de acuerdo con la norma UNE-EN-ISO
5667-19:2004.
Las muestras se tomaron mediante dragas de impacto o con tubos
cilíndricos (estas últimas en los puntos en los que los sedimentos se
70
Experimental
encontraban a poca profundidad), se transvasaron a recipientes de vidrio1 y se
transportaron hasta el laboratorio en neveras refrigeradas.
En el laboratorio las muestras se mantuvieron en la oscuridad y
refrigeradas a 4ºC hasta su análisis.
Antes de proceder al análisis de las muestras se homogeneizaron, se
dejaron decantar para eliminar el exceso de agua y se separaron en dos
fracciones. La primera se utilizó sin secar (para evitar pérdidas por
volatilización) para los análisis de los compuestos orgánicos estudiados y la
segunda se secó a 105 ºC, para determinar el contenido en humedad de las
muestras y así poder expresar los resultados de los análisis en base seca.
2. Análisis de sedimentos
El análisis de compuestos orgánicos en los sedimentos se ha realizado
por
CG,
empleando
tres
métodos
diferentes,
el
primero
mediante
microextracción en fase sólida (SPME) en el espacio de cabeza, el segundo
mediante extracción líquida seguida de una SPME y el tercero por la técnica
del espacio en cabeza.
2.1. Microextracción en fase sólida en el espacio en cabeza
Este método se empleó para analizar a los siguientes compuestos:
Alacloro
p,p´-DDT
γ-Hexaclorociclohexano (lindano)
Aldrina
Dieldrina
δ-Hexaclorociclohexano
Antraceno
α-Endosulfán
Isodrina
Atrazina
Endrina
Para-tert-octifenol
Clorfenvinfos
Hexaclorobenceno
Pentaclorobenceno
1
Antes de su uso los frascos se lavaron con agua, se enjuagaron con agua ultrapura,
se secaron en estufa, se volvieron a lavar con metanol y se secaron nuevamente.
71
Experimental
Clorpirifos
Hexaclorobutadieno
Simazina
O,p´-DDT
α-Hexaclorociclohexano
Trifluralina
Para los análisis se utilizó un equipo cromatográfico que consta de:
ƒ Un cromatógrafo de gases 6890N Agilent acoplado a un espectrómetro
de masas 5973 Inert de Agilent
ƒ Unidad de desorción termica (TDU de Gerstel)
ƒ Inyector vaporizador (CIS-4 de Gerstel)
ƒ Muestreador automático (MPS-2 de Gerstel).
Figura 4. Equipo cromatográfico.
Para la extracción y concentración de los analitos se coloca un Twister
en el espacio de cabeza de un vial de 20 mL, al que previamente se le han
añadido 2 gramos de muestra de sedimentos, 3 mL de agua ultrapura y un
imán agitador. Una vez cerrado herméticamente el vial se calienta, con
agitación magnética, a 80 ºC durante dos horas. Después de enfriar se retira el
Twister y se somete a un proceso de desorción y análisis de los analitos.
72
Experimental
Figura 5. Vial con Twister en el espacio de cabeza
La desorción de los compuestos orgánicos retenidos en el Twister se
lleva a cabo en el equipo de medida en dos etapas, la primera en la unidad de
desorción térmica (en adelante TDU) y la segunda en el inyector vaporizador
automático (en adelante CIS-4). El muestreador automático introduce el Twister
en el TDU y a continuación éste incrementa su temperatura, desde 40ºC hasta
280ºC a una velocidad de 60º/min manteniéndose la temperatura final durante
6 minutos. Este incremento de temperatura provoca la
desorción de los
analitos que son arrastrados por una corriente de helio hasta el CIS-4. Durante
el proceso de desorción el CIS-4 permanece a una temperatura de 30ºC lo que
permite retener en el liner2 los compuestos desorbidos del Twister. A
continuación el CIS-4 aumenta su temperatura hasta llegar a 300ºC a una
velocidad de 10ºC/s y se mantiene 7 minutos a esa temperatura final lo que
provoca la desorción de los analitos retenidos en el liner que son transportados
hasta el interior de la columna cromatográfica (de 30 metros de longitud, HP5MS de Agilent) por una corriente de helio.
2 Tubo de vidrio relleno de lana de vidrio y tenax que se encuentra en el interior del
CIS.
73
Experimental
Figura 6. Unidad de desorción térmica (TDU)
Los analitos, una vez separados en la columna donde las condiciones de
temperatura están optimizadas para obtener la separación de los compuestos
orgánicos, son arrastrados por el helio hasta el espectrómetro de masas, que
actúa como detector y permite llevar a cabo la identificación y cuantificación de
los analitos. Para ello se emplean dos métodos de trabajo: SCAN y SIM, lo que
hace necesario medir las muestras dos veces. En el modo SCAN se miden
todos los iones que se generan en el espectrómetro en un rango de relación
masa/carga entre 40 y 400. De esta forma se obtiene un cromatograma y los
espectros completos de las sustancias orgánicas presentes en la muestra, y
por comparación con los espectros contenidos en librerías3 se identifican de
forma inequívoca los compuestos que aparecen en el cromatograma. En modo
SIM soló se miden los iones más importantes de cada compuesto (Tabla 9) y
se integra el área del pico cromatográfico correspondiente al ión principal
(Target ion) de cada compuesto, lo que permite obtener las concentraciones de
éstos mediante curvas de calibración calculadas a partir de patrones que se
someten al mismo procedimiento que la muestra.
3
Librerías RTLPest y NIST.
74
Experimental
Tabla 9. Iones analizados por el método SIM.
Sustancia
INTERVALO DE
INTEGRACIÓN
(min)
Hexaclorobutadieno
5,54 – 7,35
225
227
190
260
223
188
Pentaclorobenceno
7,35 – 9,60
250
252
248
254
215
213
Para-tert-octifenol
9,60 – 10,93
135
107
206
57
108
96
Trifluralina
10,93 – 11,84
306
264
307
290
43
41
α -HCH
11,84 – 12,20
181
219
183
217
221
111
Hexaclorobenceno
12,20 – 12,62
284
286
282
288
249
142
Simacina
12,62 – 13,03
201
186
44
173
203
68
Atracina, Lindano
13,03 – 13,71
200
181
215
183
202
173
109
58
111
219
δ -HCH
14,30 – 15,28
181
219
183
217
109
111
Alacloro
16,50 – 17,66
160
188
45
146
237
161
Aldrina
17,66 – 18,80
263
66
265
261
91
79
Cloropirifos
18,80 – 19,50
197
199
314
97
316
258
Isodrina
19,50 – 20,35
193
195
263
66
265
261
Clorofenvinfos
21,17 – 22,06
267
323
269
325
81
225
α -endosulfan
22,06 – 23,20
241
195
239
237
Dieldrina
23,20 – 24,25
79
263
277
279
81
82
Endrina
24,25 – 25,20
317
263
315
319
o-p´-DDT
25,20 – 26,36
235
237
165
236
199
p-p´-DDT
26,36 –
235
237
165
236
199
TIon Q1 Q2 Q3 Q4 Q5
2.2. Extracción líquida
Este método se empleó para analizar a los siguientes compuestos:
Benzo(b)fluoranteno
Benzo(g,h,I)perileno
Indeno(1,2,3-cd)pireno
Benzo(k)fluoranteno
Fluoranteno
Naftaleno
El equipo utilizado fue un cromatógrafo de gases 6890N Agilent
acoplado a un espectrómetro de masas 5973 Inert de Agilent y provisto de una
unidad de desorción termica (TDU de Gerstel), un inyector vaporizador (CIS-4
de Gerstel) y un muestreador automático (MPS-2 de Gerstel).
75
Experimental
En este método también se utilizó un Twister para la extracción y
concentración de los analítos, pero precedido de una extracción con un
disolvente orgánico. Para esta extracción líquida se introdujeron 2 gramos de
muestra en un vial de 20 ml, a continuación se añadieron 3 mL de una solución
de acetona y agua ultrapura (4:1 en volumen) y un imán agitador. Una vez
cerrado herméticamente el vial se agitó magnéticamente, a temperatura
ambiente, durante 30 minutos y se calentó a 80 ºC durante una hora. Después
de dejar decantar la muestra se tomaron 1,5 mL del líquido sobrenandante, se
introdujeron en un matraz erlenmeyer, se diluyó con 50 mL de agua ultrapura,
se añadió un Twister y se sometió a un proceso de extracción y análisis de los
analitos similar al descrito en el apartado 2.1. En este caso, en el modo SIM los
iones medidos de cada compuesto se muestran en la tabla 10.
Tabla 10. Iones analizados por el método SIM.
Sustancia
INTERVALO DE
INTEGRACIÓN
(min)
TIon Q1 Q2 Q3 Q4 Q5
Naftaleno
4,00 – 9,74
128
129
127
51
64
102
Antraceno
9,74 – 17,44
178
76
139
89
176
179
Fluoranteno
17,44 – 25,00
202
203
201
101
200
100
Benzo(b) fluoranteno
Benzo (k) fluoranteno
25,00 – 39,15
252
253
126
125
250
Indenol(1,2,3-cd) pireno
Benzo(g,h,i) perileno
39,15 – 50,37
276
277
138
137
274
2.3. Espacio en cabeza
Este método se empleó para el análisis de los siguientes compuestos:
Cloroformo
Tetracloroeteno
1,2,4-Triclorobenceno
1,2-Dicloroetano
Tetraclorometano
1,1,2-Tricloroeteno
Diclorometano
76
Experimental
Para los análisis se utilizó un equipo cromatográfico que consta de:
ƒ Un cromatógrafo de gases 6890N Agilent acoplado a un detector de
captura de electrones Agilent.
ƒ Unidad de incubación de viales.
ƒ Unidad de desorción termica (TDU de Gerstel)
ƒ Inyector vaporizador (CIS-4 de Gerstel)
ƒ Muestreador automático (MPS-2 de Gerstel).
Figura 7. Unidad de incubación
Figura 8. Detector de captura de electrones
Para la extracción y análisis de las muestras de sedimentos mediante la
técnica de espacio en cabeza se añaden, a un vial de 20 mL, 2 gramos de
sedimento, 3 mL de agua ultrapura, 0,7 gramos de sulfato sódico y un imán
agitador. Se cierra herméticamente el vial tras un barrido con argón cuya
finalidad es extraer toda la cantidad de aire atmosférico y dejar un gas inerte,
de elevada pureza y libre de compuestos orgánicos. Se agita magnéticamente
a temperatura ambiente durante 30 minutos y, a continuación, se coloca en el
dispositivo de incubación que mantiene a la muestra a 75 ºC durante 30
minutos estableciéndose un equilibrio entre la muestra y la fase gaseosa.
77
Experimental
Posteriormente mediante una jeringa instalada en el MPS-2 se toman 2,5 mL
de la fase vapor del vial y se introducen en el CIS-4 (que se encuentra a una
temperatura de 5ºC, por criogenización con CO2) que retiene los analitos en su
interior (en el denominado liner). A continuación el CIS-4 aumenta su
temperatura hasta alcanzar 250ºC, lo que provoca la desorción de los analitos
que son transportados hasta el interior de la columna cromatográfica (de 60m
de longitud, DB-624 de Agilent) por una corriente de helio.
En la columna cromatográfica se produce la separación de los
compuestos orgánicos, que son arrastrados por el helio hasta el detector de
captura de electrones. El equipo genera un cromatograma que permite
identificar y cuantificar los analitos presentes en las muestras. La identificación
se realiza a partir de los tiempos de retención de los analitos del cromatograma
y la cuantificación se consigue midiendo las áreas bajo los picos
cromatográficos de los distintos compuestos en las muestras y en los patrones
que se someten al mismo procedimiento que la muestra.
78