Applied Biosystems StepOne Real

Applied Biosystems StepOne™
Real-Time PCR System
Guía de reactivos
Applied Biosystems StepOne™
Real-Time PCR System
Guía de reactivos
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AmpErase, AmpliTaq Gold, and TaqMan are registered trademarks of Roche Molecular Systems, Inc.
SYBR is a registered trademark of Molecular Probes, Inc.
All other trademarks are the sole property of their respective owners.
Número de referencia 4377718 Rev. B
06/2010
Contenido
Front Cover
Prólogo
Cómo utilizar esta guía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . vii
Cómo obtener más información . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ix
Cómo obtener asistencia técnica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xi
Capítulo 1
Introducción
Acerca del sistema StepOne™ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-2
Preparación de experimentos en el sistema StepOne™ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-4
Selección del tipo de experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-5
Selección del tipo de reactivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-6
Selección del tipo de ensayo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-7
Capítulo 2
Introducción a los reactivos
Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-2
Reactivos TaqMan® . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-2
Reactivos SYBR® Green . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-4
Selección del tipo de reactivo apropiado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-5
Reducción al mínimo de los contaminantes del DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-7
Capítulo 3
Experimentos de cuantificación
Sección 3.1: Acerca de los experimentos de cuantificación . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-3
Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-4
Selección de un método de cuantificación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-5
Selección de una RT-PCR de 1 o 2 pasos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-8
Selección de PCR en singleplex o en multiplex . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-10
Selección del tipo de reactivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-13
Selección del tipo de ensayo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-13
Sección 3.2: Directrices de diseño . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-17
Ensayos en inventario/fabricados bajo pedido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-18
TaqMan® Gene Expression Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-18
Custom TaqMan® Gene Expression Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-20
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
iii
Selección de la mezcla de reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-21
Diseño del experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-22
Ensayos personalizados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-22
Diseño de cebadores y sondas con el software Primer Express® . . . . . . . . . . . . 3-23
Selección de reactivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-26
Uso de las condiciones de termociclado recomendadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-28
Optimización de concentraciones de cebador . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-31
Optimización de la concentración de sonda . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-35
Para obtener más información . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-37
Capítulo 4
Experimentos de genotipado
Sección 4.1: Acerca de los experimentos de genotipado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-3
Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-4
Selección del tipo de ensayo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-6
Sección 4.2: Directrices de diseño . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-9
Ensayos prediseñados/validados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-10
TaqMan® SNP Genotyping Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-10
TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-11
Pre-Developed TaqMan® Assay Reagents for Allelic Discrimination . . . . . . . . . . 4-12
Selección de la mezcla de reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-13
Diseño del experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-14
Ensayos personalizados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-15
Custom TaqMan® SNP Genotyping Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-15
Selección de la mezcla de reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-17
Diseño del experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-17
Capítulo 5
Experimentos de presencia/ausencia
Sección 5.1: Acerca de los experimentos de presencia/ausencia . . . . . . . . . . . . . . 5-3
Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-4
Selección del tipo de ensayo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-6
Sección 5.2: Directrices de diseño . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-9
Ensayos en inventario/fabricados bajo pedido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-10
TaqMan® Gene Expression Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-10
Custom TaqMan® Gene Expression Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-12
TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-13
Selección de la mezcla de reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-14
Diseño del experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-15
Ensayos personalizados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-15
iv
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Apéndice A Fórmula
Fórmula para experimentos de CT comparativos (∆∆CT) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A-1
Apéndice B Limitación del cebador en la PCR en multiplex
Apéndice C Directrices de diseño de ensayos
Bibliografía
Glosario
Índice
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
v
vi
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Prólogo
Cómo utilizar esta guía
Finalidad de esta
guía
En esta guía, se proporciona información acerca de los reactivos que se pueden
utilizar en Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System (sistema
StepOne™). Información de esta guía:
• Introducción a los reactivos TaqMan® y SYBR® Green
• Descripciones y directrices de diseño para los siguientes tipos de experimentos:
– Experimentos de cuantificación
– Experimentos de genotipado
– Experimentos de presencia/ausencia
Público
Suposiciones
Esta guía está destinada al personal de laboratorio y a los principales investigadores
que realizan experimentos de curva estándar con el sistema StepOne.
En esta guía, se asume lo siguiente:
• Tiene un conocimiento práctico del proceso de reacción en cadena de
polimerasa (PCR).
• Sabe manejar muestras de DNA y/o RNA y prepararlas para la PCR.
Convenciones del
texto
En esta guía, se utilizan las siguientes convenciones:
Palabras de aviso
para el usuario
En la documentación de Applied Biosystems, aparecen dos palabras de aviso para el
usuario. Cada palabra implica un nivel concreto de observación o acción, tal y como
se describe a continuación:
• El texto en negrita indica una acción del usuario. Por ejemplo:
Escriba 0 y, a continuación, pulse Intro en cada uno de los campos restantes.
• El texto en cursiva señala palabras nuevas o importantes y también se utiliza
para enfatizar algo. Por ejemplo:
Antes de realizar el análisis, prepare siempre una matriz fresca.
• El símbolo de la flecha que apunta a la derecha () separa los comandos
sucesivos que se seleccionan en un menú desplegable o un menú de acceso
directo. Por ejemplo:
Seleccione File (Archivo)Open (Abrir).
Nota: Proporciona información que puede ser interesante o útil, pero no es esencial
para el uso del producto.
¡IMPORTANTE! Proporciona información que es necesaria para poder utilizar el
instrumento correctamente, para poder utilizar un kit de reactivos con precisión o
para poder utilizar un producto químico de manera segura.
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
vii
Prólogo
A continuación, se muestran algunos ejemplos de palabras de aviso para el usuario:
Nota: La función de calibración también está disponible en la consola de control.
¡IMPORTANTE! Para comprobar la conexión del cliente, necesita un identificador de
usuario válido.
Palabras de aviso
de seguridad
En la documentación del usuario de Applied Biosystems, aparecen cuatro palabras
de aviso de seguridad en los puntos del documento en los que debe conocer la
existencia de peligros importantes. Cada palabra de aviso (IMPORTANTE,
PRECAUCIÓN, ADVERTENCIA, PELIGRO) implica un nivel de observación o
acción particular, tal y como se explica a continuación.
Definiciones
¡IMPORTANTE! Proporciona información que es necesaria para poder utilizar el
instrumento correctamente, para poder utilizar un kit de reactivos con precisión o
para poder utilizar un producto químico de manera segura.
Indica una situación potencialmente peligrosa que, de no evitarse,
podría causar lesiones leves o moderadas. También puede utilizarse para alertar de
prácticas no seguras.
Indica una situación potencialmente peligrosa que, de no
evitarse, podría causar lesiones graves o mortales.
Indica una situación inminentemente peligrosa que, de no
evitarse, tendrá como resultado lesiones graves o mortales. Esta palabra de aviso se
limita a las situaciones más extremas.
A excepción de los avisos IMPORTANTE, todas las palabras de aviso de seguridad
de un documento de Applied Biosystems aparecen con la figura de un triángulo
abierto que contiene un símbolo de peligro. Estos símbolos de peligro son idénticos a
los que se incorporan en los instrumentos de Applied Biosystems.
Ejemplos
¡IMPORTANTE! Debe crear una hoja de cálculo de entradas de muestras diferente
para cada placa de reacción de 96-pocillos.
PELIGRO QUÍMICO. TaqMan® Universal PCR Master Mix
puede causar irritaciones en la piel y los ojos. Puede provocar molestias si se ingiere
o se inhala. Consulte la ficha técnica de seguridad (MSDS) y siga las instrucciones
de manipulación indicadas. Use protectores oculares, vestimenta protectora y
guantes apropiados.
PELIGRO DE LESIONES FÍSICAS. Durante el uso de los
instrumentos, la cubierta caliente y el bloque de muestras pueden alcanzar
temperaturas superiores a 100 °C.
PELIGRO ELÉCTRICO. La continuidad del circuito de toma a
tierra es vital para la seguridad. Jamás utilice el sistema con el conductor de toma de
tierra desconectado.
viii
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Prólogo
Cómo obtener más información
Documentación
relacionada
El sistema StepOne incluye la siguiente documentación:
Núm. ref.
inglés
Núm.
ref.
español
Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Getting
Started Guide for Genotyping Experiments
4376786
4377729
Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Getting
Started Guide for Presence/Absence Experiments
4376787
Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Getting
Started Guide for Relative Standard Curve and Comparative CT
Experiments
4376785
Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Getting
Started Guide for Standard Curve Experiments
4376784
4377736
Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Installation, Maintenance, and Networking Guide
4376782
4377798
Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Installation Quick Reference Card
4376783
4377792
Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Site
Preparation Guide
4376768
4378359
—
—
Documento
Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Software
Help
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
—
4377742
ix
Prólogo
Applied Biosystems puede proporcionarle la siguiente documentación auxiliar:
Documento
Número de
referencia
Applied Biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits
Protocol
4375575
Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Installation
Performance Verification Protocol
4376791
Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Installation
Qualification-Operation Qualification Protocol
4376790
Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Planned
Maintenance Protocol
4376788
Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol
4334429
Custom TaqMan® Genomic Assays Protocol: Submission Guidelines
4367671
Custom TaqMan® SNP Genotyping Assays Protocol
4334431
Power SYBR® Green PCR Master Mix and RT-PCR Protocol
4367218
Pre-Developed TaqMan® Assay Reagents Allelic Discrimination Protocol
4312214
Primer Express® Software Version 3.0 Getting Started Guide
4362460
SYBR® Green PCR and RT-PCR Reagents Protocol
4304965
SYBR® Green PCR Master Mix and RT-PCR Reagents Protocol
4310251
TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assays Protocol
4362038
TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents Protocol
4308335
TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2✕) Protocol
4351891
TaqMan® Gene Expression Assays Protocol
4333458
TaqMan® SNP Genotyping Assays Protocol
4332856
TaqMan® Universal PCR Master Mix Protocol
4304449
User Bulletin #2: Relative Quantitation of Gene Expression
4303859
Using TaqMan® Endogenous Control Assays to Select an Endogenous
Control for Experimental Studies Application Note
127AP08
Nota: Para obtener más documentación, consulte “Cómo obtener asistencia técnica”
en la página xi.
Obtención de
información de la
ayuda del
software
En Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Software (software
StepOne™ ) Help, se describe cómo se utiliza cada función de la interfaz de usuario.
Para acceder a la ayuda desde el software StepOne, realice una de las siguientes
acciones:
• Pulse F1.
• Haga clic en
x
en la barra de herramientas.
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Prólogo
• Seleccione Help (Ayuda)StepOne Help (Ayuda de StepOne).
Para buscar temas de interés en la ayuda:
• Consulte el índice de contenido.
• Busque un tema específico.
• Busque en un índice alfabético.
Envíenos sus
comentarios
Applied Biosystems agradece sus comentarios y sugerencias para mejorar sus
documentos de usuario. Puede enviar sus comentarios a la dirección de correo
electrónico:
techpubs@appliedbiosystems.com
¡IMPORTANTE! Esta dirección sólo sirve para enviar comentarios y sugerencias en
relación con la documentación. Para solicitar documentos, descargar archivos PDF u
obtener ayuda sobre una cuestión técnica, vaya a www.appliedbiosystems.com y, a
continuación, haga clic en el vínculo Support (Asistencia técnica). (Consulte “Cómo
obtener asistencia técnica” más adelante.)
Cómo obtener asistencia técnica
Para acceder a los servicios más recientes y obtener información acerca de la
asistencia técnica, vaya a www.appliedbiosystems.com y, a continuación, haga clic
en el vínculo Support (Asistencia técnica).
En la página Support (Asistencia técnica), puede:
• Buscar las preguntas más frecuentes (FAQ)
• Enviar una pregunta directamente al Servicio de asistencia técnica
• Solicitar a Applied Biosystems documentos de usuario, fichas técnicas de
solicitud de materiales (MSDS), certificados de análisis y otros documentos
relacionados
• Descargar documentos PDF
• Obtener información acerca de la formación del cliente
• Descargar actualizaciones y parches de software
Asimismo, en la página Support (Asistencia técnica) podrá acceder a los números de
teléfono y fax para ponerse en contacto con el Servicio de asistencia técnica y las
instalaciones de venta de Applied Biosystems en todo el mundo.
¡IMPORTANTE! Cuando se le solicite que lo haga en esta guía o cuando tenga que
programar el mantenimiento del instrumento StepOne™ (por ejemplo, el
mantenimiento anual planificado o la verificación/calibración de la temperatura),
póngase en contacto con el Centro de atención al cliente de Applied Biosystems.
Para obtener un número de teléfono o enviar un mensaje de correo electrónico al
centro, visite http://www.appliedbiosystems.com/support/contact.
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
xi
Prólogo
xii
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Introducción
1
1
Este capítulo cubre los siguientes temas:
Acerca del sistema StepOne™ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-2
Preparación de experimentos en el sistema StepOne™ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-4
Selección del tipo de experimento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-5
Selección del tipo de reactivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-6
Selección del tipo de ensayo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-7
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
1-1
Capítulo 1 Introducción
Acerca del sistema StepOne™
Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System (sistema StepOne™) utiliza
reactivos de reacción en cadena de polimerasa (PCR) basados en fluorescencia para
proporcionar:
• Detección cuantitativa de las secuencias de ácido nucléico de diana (dianas)
mediante análisis en tiempo real.
• Detección cualitativa de secuencias de ácido nucléico de diana (dianas)
mediante análisis de punto final y curva de disociación.
Acerca de la
recogida de
datos
El sistema StepOne recoge datos de fluorescencia brutos en diferentes puntos de una
PCR, dependiendo del tipo de proceso que realice:
Tipo de proceso
Procesos en
tiempo real
Curva estándar
Punto de recogida de datos
El instrumento recoge datos después de cada
paso de extensión de la PCR.
Curva estándar
relativa
CT comparativos
(∆∆CT)
Procesos de
punto final
Genotipado
El instrumento recoge datos antes y después de
la PCR. El instrumento también puede recoger
datos durante el proceso (en tiempo real), lo que
puede resultar útil para solucionar los problemas.
Presencia/ausencia
El instrumento recoge datos antes y después de
la PCR.
Con independencia del tipo de proceso que se realice, un punto de recogida de datos
o una lectura constan de tres fases:
1. Excitación: el instrumento StepOne™ ilumina todos los pocillos de la placa de
reacción en el instrumento StepOne para excitar los fluoróforos de cada
reacción.
2. Emisión: la óptica del instrumento StepOne capta la fluorescencia residual que
se emite desde los pocillos de la placa de reacción. La imagen resultante que
capta el dispositivo sólo consta de luz que se corresponde con el rango de las
longitudes de onda de emisión.
3. Recogida: el instrumento StepOne crea una representación digital de la
fluorescencia residual recogida en un intervalo de tiempo fijado. El software
StepOne™ almacena la imagen fluorescente bruta para analizarla.
Después de un proceso, el software StepOne utiliza datos de calibración (espacial,
espectral y de fondo) para determinar la ubicación y la intensidad de las señales
fluorescentes en cada lectura, el fluorocromo asociado a cada señal fluorescente y el
significado de la señal.
1-2
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Capítulo 1 Introducción
Consumibles
admitidos
El sistema StepOne admite los consumibles que se enumeran a continuación. Estos
consumibles se utilizan en protocolos o reactivos estándar y rápidos.
Número de
referencia
Consumible
• MicroAmp™ Fast Optical 48-Well Reaction Plates
• MicroAmp™ Optical 48-Well Adhesive Film
• 4375816
• 4375323
• MicroAmp™ Fast 8-Tube Strips
• MicroAmp™ Optical 8-Cap Strips
• 4358293
• 4323032
• MicroAmp® Fast Reaction Tubes with Caps
• 4358297
• MicroAmp™ Fast 48-Well Trays
• MicroAmp™ 48-Well Base Adaptor
• MicroAmp™ Splash Free 96-Well Base
• 4375282
• 4375284
• 4312063
D
F
G
A
E
B
B
A
C
#
C
C
Consumible
A
MicroAmp™ Fast Optical 48-Well Reaction Plate
B
MicroAmp™ Fast 48-Well Tray
C
MicroAmp™ Splash Free 96-Well Base
D
MicroAmp™ Optical 8-Cap Strip
E
MicroAmp™ Fast 8-Tube Strip
F
MicroAmp® Fast Reaction Tubes with Caps
G
MicroAmp™ Optical 48-Well Adhesive Film
Para obtener más
información
Para obtener más información acerca de alguno de los temas que se explican en esta
guía, acceda a la ayuda desde Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR
System Software pulsando F1, haciendo clic en
en la barra de herramientas o
seleccionado Help (Ayuda)StepOne Help (Ayuda de StepOne).
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
1-3
Capítulo 1 Introducción
Preparación de experimentos en el sistema StepOne™
Flujo de trabajo
general
Antes de realizar experimentos en el sistema StepOne, prepare el experimento de la
siguiente forma:
1. Seleccione un tipo de experimento (página 1-5).
2. Seleccione el tipo de reactivo (página 1-6).
3. Seleccione el tipo de ensayo (página 1-7).
Información de
esta guía
En este capítulo, se ofrece información general acerca de los tipos de experimentos,
los tipos de reactivos y los tipos de ensayos que se pueden utilizar en el sistema
StepOne.
En capítulos posteriores se ofrece información específica:
Capítulo
Descripción
Capítulo 2, Introducción a los
reactivos
• Describe y compara los reactivos TaqMan® y
SYBR® Green.
• Proporciona información acerca de cómo reducir al
mínimo la contaminación del DNA.
Capítulo 3, Experimentos de
cuantificación
• Explica cómo funciona el tipo de experimento.
• Ofrece el flujo de trabajo específico para el tipo de
experimento.
• Ofrece directrices de diseño para cada tipo de
ensayo.
Capítulo 4, Experimentos de
genotipado
Capítulo 5, Experimentos de
presencia/ausencia
1-4
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Capítulo 1 Introducción
Selección del tipo de experimento
En el sistema StepOne, se pueden realizar los siguientes tipos de experimentos:
• Cuantificación, incluidos:
– Curva estándar
– Curva estándar relativa
– CT comparativos (∆∆CT)
• Genotipado
• Presencia/ausencia
Nota: También se puede realizar un análisis de curva de disociación en el sistema
StepOne.
Experimentos de
punto final y
experimentos en
tiempo real
Los tres tipos de experimentos se pueden clasificar como experimentos en tiempo
real y experimentos de punto final, tal y como se explica a continuación.
Categoría
Propiedades
Tipo de
experimento
Tiempo real
• El instrumento supervisa el progreso de la
PCR a medida que se produce. ‡
• Se recogen datos durante el proceso de
PCR.
• Las reacciones se caracterizan por el punto
temporal del ciclo en el que se detecta por
primera vez la amplificación de una diana. §
Cuantificación
Punto final
• Los datos se recogen al final del proceso de
PCR.
• Las reacciones se caracterizan por la
cantidad de diana acumulada al final de la
PCR.§
• El punto de datos es la intensidad
normalizada del fluorocromo notificador, o Rn.
Genotipado
Presencia/ausencia
Nota: Algunos experimentos de punto final
también incluyen puntos de datos anteriores a la
PCR. Si es así, el sistema calcula el valor delta
Rn (∆Rn) de acuerdo con la siguiente fórmula:
Rn posterior a PCR – Rn anterior a PCR = ∆Rn
‡ Kwok y Higuchi, 1989.
§ Saiki et al., 1985.
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
1-5
Capítulo 1 Introducción
Selección del tipo de reactivo
En el sistema StepOne, se pueden utilizar los siguientes tipos de reactivos
(químicos):
• Reactivos TaqMan®
• Reactivos SYBR® Green
• Otros reactivos basados en fluorescencia
Reactivos
TaqMan
Los reactivos TaqMan incluyen ensayos TaqMan® (mezclas preformuladas que
contienen conjuntos de sondas y cebadores) y mezclas de reacción TaqMan®. Los
reactivos TaqMan se pueden utilizar para los siguientes tipos de experimentos:
• Cuantificación, incluidos:
– Curva estándar
– Curva estándar relativa
– CT comparativos (∆∆CT)
• Genotipado
• Presencia/ausencia
¡IMPORTANTE! Applied Biosystems no recomienda el uso del fluorocromo
TAMRA™ como notificador o apantallador con el sistema StepOne.
Reactivos SYBR
Green
Los reactivos SYBR Green incluyen cebadores y mezclas de reacción que contienen
fluorocromo SYBR® Green. Los reactivos SYBR Green se pueden utilizar para los
experimentos de cuantificación de:
• Curva estándar
• Curva estándar relativa
• CT comparativos (∆∆CT)
Nota: No se puede realizar una PCR en multiplex con reactivos SYBR Green. Para
obtener más información, consulte “Selección de PCR en singleplex o en multiplex”
en la página 3-10.
Otros reactivos
Se pueden utilizar otros reactivos basados en fluorescencia en el sistema StepOne,
pero se debe tener en cuenta lo siguiente:
• El software StepOne calcula automáticamente los volúmenes de reacción de los
reactivos TaqMan y SYBR Green, pero no de otros reactivos.
• Se debe diseñar el experimento con el flujo de trabajo Advanced Setup
(Configuración avanzada), en lugar de con el flujo de trabajo del asistente de
diseño.
1-6
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Capítulo 1 Introducción
Selección del tipo de ensayo
En el software StepOne, se pueden seleccionar los siguientes tipos de ensayos para
los experimentos de cuantificación, presencia/ ausencia y genotipado:
Tipo de experimento
Cuantificación ‡
Presencia/ausencia
Genotipado
Tipo de ensayo
Véase...
• En inventario y fabricado bajo
pedido
• Personalizado
más abajo
• Prediseñado/validado
• Personalizado
• Diseñado por el usuario
página 1-8
‡ Los experimentos de cuantificación incluyen experimentos de curva estándar,
cuantificación relativa.
Experimentos de
cuantificación y
de presencia/
ausencia
Ensayos en inventario/fabricados bajo pedido (Made to Order)
Para los experimentos de cuantificación o de presencia/ausencia, seleccione el tipo
de ensayo Inventoried/Made to Order (En inventario/fabricado bajo pedido) en el
software StepOne si utiliza:
• TaqMan® Gene Expression Assays, en inventario: conjuntos de cebadores y
sondas MGB (ligando de unión al surco menor) TaqMan® prediseñados con el
marcaje FAM, como fluorocromo™ que se pueden adquirir ya preparados. La
mezcla del ensayo está disponible en un solo tubo de 20✕ preformulado.
• TaqMan® Gene Expression Assays, fabricados bajo pedido (Made to
Order): conjuntos de cebadores y sondas TaqMan MGB prediseñados con el
marcaje fam, como fluorocromo que se fabrican en el momento de realizar el
pedido. La mezcla del ensayo está disponible en un solo tubo de 20✕
preformulado.
• Custom TaqMan® Gene Expression Assays: conjuntos de cebadores y sondas
TaqMan MGB con el marcaje del fluorocromo FAM que están diseñados,
sintetizados y formulados por el servicio Custom TaqMan® Genomic Assays de
acuerdo con la información de secuencia remitida. La mezcla del ensayo está
disponible en un solo tubo de 20✕ o 60✕ preformulado.
Nota: Cuando seleccione el tipo de ensayo en el software StepOne, vaya a la pantalla
Reaction Setup (Configuración de reacción) en el flujo de trabajo del asistente de
diseño o Advanced Setup (Configuración avanzada) y, a continuación, seleccione
Inventoried/Made to Order (En inventario/fabricado bajo pedido) en el menú
desplegable Assay Type (Tipo de ensayo).
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
1-7
Capítulo 1 Introducción
Ensayos personalizados (Custom Assays)
Para los experimentos de cuantificación y de presencia/ausencia, seleccione el tipo
de ensayo Custom (Personalizado) en el software StepOne si va a diseñar sus propios
ensayos (cebadores o sondas) con el software Primer Express® y reactivos TaqMan o
SYBR Green. Cuando diseñe sus propios ensayos, siga las directrices de diseño de
ensayos de Applied Biosystems para optimizar los resultados.
¡IMPORTANTE! Applied Biosystems no recomienda el uso del fluorocromo
TAMRA™ como notificador o apantallador con el sistema StepOne.
Nota: Cuando seleccione el tipo de ensayo en el software StepOne, vaya a la pantalla
Reaction Setup (Configuración de reacción) en el flujo de trabajo del asistente de
diseño o Advanced Setup (Configuración avanzada) y, a continuación, seleccione
Custom (Personalizado) en el menú desplegable Assay Type (Tipo de ensayo).
Experimentos de
genotipado
Ensayos prediseñados/validados
En los experimentos de genotipado, el tipo de ensayo Pre-Designed/Validated
(Prediseñado/validado) incluye:
• TaqMan® SNP Genotyping Assays: conjuntos de cebadores y sondas MGB
(ligando de unión al surco menor) TaqMan® prediseñados con el marcaje de los
fluorocromos FAM™ y VIC® que están disponibles en dos categorías:
– TaqMan® Validated & Coding SNP Genotyping Assays, que se pueden
adquirir ya preparados (en inventario). La mezcla del ensayo está disponible
en un solo tubo de 20✕ preformulado.
– TaqMan® Pre-Designed SNP Genotyping Assays, que se fabrican en el
momento de realizar el pedido (fabricados bajo pedido [Made to Order]). La
mezcla del ensayo está disponible en un solo tubo de 20✕ preformulado.
• TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assays: conjuntos de cebadores y
sondas TaqMan MGB prediseñados con el marcaje de los fluorocromos FAM y
VIC que se pueden adquirir ya preparados (en inventario). La mezcla del ensayo
está disponible en un solo tubo de 20✕ preformulado.
• Pre-Developed TaqMan® Assay Reagents for Allelic Discrimination
(TaqMan® PDARs for AD): conjuntos de cebadores y sondas TaqMan MGB
prediseñados con el marcaje de los fluorocromos FAM y VIC que se pueden
adquirir ya preparados (en inventario). La mezcla del ensayo está disponible en
un solo tubo de 10✕ preformulado.
Nota: Cuando seleccione un ensayo de SNP en el software StepOne, vaya a la
pantalla SNP Assays (Ensayos de SNP) del flujo de trabajo del asistente de diseño o
a la pantalla Plate Setup (Configuración de placa) del flujo de trabajo Advanced
Setup (Configuración avanzada). En la pantalla SNP Assays (Ensayos de SNP) o
Plate Setup (Configuración de placa), se puede seleccionar un ensayo en la biblioteca
o crear uno nuevo.
1-8
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Capítulo 1 Introducción
Ensayos personalizados (Custom Assays)
Para los experimentos de genotipado, el tipo de ensayo Custom (Personalizado)
incluye Custom TaqMan® SNP Genotyping Assays. Custom TaqMan SNP
Genotyping Assays son conjuntos de cebadores y sondas TaqMan MGB con el
marcaje de los fluorocromos FAM y VIC que están diseñados, sintetizados y
formulados por el servicio Custom TaqMan® Genomic Assays de acuerdo con la
información de secuencia remitida. La mezcla del ensayo está disponible en un solo
tubo de 40✕ o 80✕ preformulado.
Nota: Cuando seleccione un ensayo de SNP en el software StepOne, vaya a la
pantalla SNP Assays (Ensayos de SNP) del flujo de trabajo del asistente de diseño o
a la pantalla Plate Setup (Configuración de placa) del flujo de trabajo Advanced
Setup (Configuración avanzada). En la pantalla SNP Assays (Ensayos de SNP) o
Plate Setup (Configuración de placa), se puede seleccionar un ensayo en la biblioteca
o crear uno nuevo.
Ensayos diseñados por el usuario
Si desea diseñar sus propios cebadores y sondas para los ensayos de SNP, consulte
Primer Express® Software Version 3.0 Getting Started Guide.
¡IMPORTANTE! Applied Biosystems no recomienda el uso del fluorocromo
TAMRA™ como notificador o apantallador con el sistema StepOne.
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
1-9
Capítulo 1 Introducción
1-10
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Introducción a los reactivos
2
2
Este capítulo cubre los siguientes temas:
Introducción. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-2
Reactivos TaqMan® . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-2
Reactivos SYBR® Green . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-4
Selección del tipo de reactivo apropiado. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-5
Reducción al mínimo de los contaminantes del DNA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-7
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
2-1
Capítulo 2 Introducción a los reactivos
Introducción
Applied Biosystems ha desarrollado dos tipos de reactivos (químicos) que se pueden
utilizar para detectar productos de PCR en Applied Biosystems StepOne™ Real-Time
PCR System:
• Reactivos TaqMan® (más abajo)
• Reactivos SYBR® Green (página 2-4)
Reactivos TaqMan®
Tipos de
experimentos
Los reactivos TaqMan® incluyen ensayos TaqMan® (mezclas preformuladas que
contienen conjuntos de sondas y cebadores) y mezclas de reacción TaqMan®. Los
ensayos son específicos de la diana de interés. Las mezclas de reacción contienen los
demás componentes que son necesarios para la reacción de PCR. Los reactivos
TaqMan se pueden utilizar para los siguientes tipos de experimentos:
• Cuantificación, incluidos:
– Curva estándar
– Curva estándar relativa
– CT comparativos (∆∆CT)
• Genotipado
• Presencia/ausencia
¡IMPORTANTE! Applied Biosystems no recomienda el uso del fluorocromo
TAMRA™ como notificador o apantallador con el sistema StepOne.
Desarrollo de
reactivos TaqMan
Al principio, se utilizaban fluorocromos intercalantes para medir los productos de
PCR en tiempo real. El principal inconveniente de este método de detección es que
detecta la acumulación de productos de PCR tanto específicos como no específicos.
Los sistemas en tiempo real para PCR mejoraron gracias a la introducción de sondas
con marcajes de fluorocromos que utilizan la actividad 5′ nucleasa de la Taq
polimerasa de DNA. La existencia de estas sondas fluorogénicas permitió desarrollar
un método en tiempo real para detectar únicamente productos de amplificación
específicos.
Funcionamiento
de los reactivos
TaqMan
Los reactivos TaqMan utilizan una sonda fluorogénica para detectar un producto de
PCR específico a medida que se acumula durante la PCR. Así es cómo funciona:
1. Se construye una sonda oligonucleótida con un fluorocromo notificador unido
al extremo 5′ y un apantallador en el extremo 3′.
Mientras la sonda está intacta, la proximidad del apantallador reduce
enormemente la fluorescencia que emite el fluorocromo notificador por medio
de la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET; resonancia
de Förster, Förster, V. T. 1948) a través del espacio.
2. Si la diana está presente, la sonda anilla entre las localizaciones de los
cebadores y se rompe por la actividad de la 5' nucleasa de la Taq Polimerasa,
durante la extensión.
2-2
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Capítulo 2
Introducción a los reactivos
3. Esta ruptura de la sonda:
– Separa el fluorocromo notificador del apantallador, lo que aumenta la señal
del fluorocromo notificador.
– Quita la sonda de la cadena de la diana, lo que permite que la extensión del
cebador continúe hasta el final de la cadena del molde. De esta forma, la
inclusión de la sonda no inhibe el proceso global de PCR.
4. En cada ciclo, se separan más moléculas de fluorocromo notificador de sus
respectivas sondas, lo que produce un aumento de la intensidad de la
fluorescencia que es proporcional a la cantidad de amplicón producido. Cuanto
más alto sea el número inicial de copias de la diana de ácido nucleico, antes se
observará un aumento significativo de la fluorescencia.
La Figura 2-1 ilustra este proceso.
DESPLAZAMIENTO DE CADENA
POLIMERIZACIÓN
5'
3'
CEBADOR
DIRECTO
R
SONDA
Q
3'
R = NOTIFICADOR
Q = APANTALLADOR
5'
5'
3'
5'
R
5'
3'
POLIMERIZACIÓN COMPLETADA
PARTICIÓN
R
Q
R
Q
3'
5'
5'
3'
5'
5'
3'
3'
5'
5'
3'
5'
Q
3'
5'
3'
5'
5'
3'
5'
CEBADOR REVERSO
Paso 1: un notificador (R) y
un apantallador (Q) se
unen a los extremos 5′ y 3′
de una sonda TaqMan®.
Paso 2: cuando ambos
marcajes están unidos a la
sonda, se inhibe la emisión
del fluorocromo notificador.
Figura 2-1
Sondas TaqMan
MGB
Paso 3: durante cada
ciclo de extensión, la
polimerasa Taq DNA
separa el fluorocromo
notificador de la sonda.
Paso 4: una vez separado
del apantallador, el
fluorocromo notificador
emite su fluorescencia
característica.
Funcionamiento de los reactivos TaqMan
Applied Biosystems recomienda el uso general de sondas TaqMan MGB®, sobre
todo si las sondas TaqMan® convencionales superan los 30 nucleótidos. Las sondas
TaqMan MGB contienen:
• Un fluorocromo notificador en el extremo 5′: genera una señal cuando se
rompe a causa de la actividad 5′ nucleasa de la Taq polimerasa de DNA.
• Un apantallador no fluorescente (NFQ) en el extremo 3′: permite a los
sistemas de PCR en tiempo real medir con más precisión las contribuciones de
fluorocromo notificador, dado que el apantallador no emite fluorescencia.
• Un ligando de unión al surco menor (MGB) en el extremo 3′: aumenta la
temperatura de desnaturalización (Tm) de las sondas sin aumentar la longitud de
la sonda (Afonina et al., 1997; Kutyavin et al., 1997), por lo que permite diseñar
sondas más cortas. Por consiguiente, las sondas TaqMan MGB tienen mayores
diferencias en los valores de Tm entre sondas complementarias y no
perfectamente complementarias con la diana. Estas mayores diferencias en los
valores de Tm permiten realizar el genotipado con precisión.
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
2-3
Capítulo 2 Introducción a los reactivos
Applied Biosystems ofrece las siguientes sondas TaqMan MGB con NFQ para el
sistema StepOne™:
Fluorocromo con marcaje
en 5′
Ensayos TaqMan®
(sonda TaqMan MGB®)
®
Ensayos TaqMan
personalizados (sonda
TaqMan MGB® )
Sondas personalizadas
Expresión de genes
Genotipado SNP
Fluorocromo FAM™
™
®
Fluorocromos FAM y VIC
™
Fluorocromo con
marcaje en 3′
Otras
funciones
NFQ
MGB
NFQ
MGB
Expresión de genes
Fluorocromo FAM
NFQ
MGB
Genotipado SNP
Fluorocromos FAM™ y VIC®
NFQ
MGB
Sonda TaqMan MGB®
personalizada
Fluorocromo FAM™, TET™,
NED™ o VIC®
NFQ
MGB
¡IMPORTANTE! Applied Biosystems no recomienda el uso del fluorocromo
TAMRA™ como notificador o apantallador con el sistema StepOne.
Reactivos SYBR® Green
Tipos de
experimentos
Los reactivos SYBR® Green incluyen cebadores y mezclas de reacción que
contienen fluorocromo SYBR® Green. Los reactivos SYBR Green se pueden utilizar
para los experimentos de cuantificación de:
• Curva estándar
• Curva estándar relativa
• CT comparativos (∆∆CT)
Nota: No se puede realizar una PCR en multiplex con reactivos SYBR Green. Para
obtener más información, consulte “Selección de PCR en singleplex o en multiplex”
en la página 3-10.
Desarrollo de
reactivos SYBR
Green
Las pequeñas moléculas que se unen al DNA de doble cadena se pueden dividir en
dos clases: las que se intercalan en el DNA y las que se unen al surco menor del
DNA. Higuchi (Higuchi et al., 1992) utilizaba el agente intercalante bromuro de
etidio para la detección de la PCR en tiempo real. Hoechst 33258 es un ejemplo de
un fluorocromo de ligando de unión al surco menor cuya fluorescencia aumenta
cuando se une a DNA de doble cadena (Higuchi et al., 1993).
Con independencia del método de unión, al menos hay dos requisitos para que un
fluorocromo de unión a DNA detecte productos de PCR en tiempo real:
• Aumento de fluorescencia cuando se une a DNA de doble cadena
• Sin inhibición de la PCR
Applied Biosystems ha desarrollado condiciones que permiten el uso del
fluorocromo SYBR® Green I en la PCR sin que haya inhibición de la PCR y con
mayor sensibilidad de detección en comparación con el bromuro de etidio.
2-4
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Capítulo 2
Funcionamiento
de los reactivos
SYBR Green
Introducción a los reactivos
Los reactivos SYBR Green utilizan el fluorocromo SYBR Green I para detectar
productos de PCR uniéndose al DNA de doble cadena que se forma durante la PCR.
Así es cómo funciona:
1. Cuando se añade SYBR® Green PCR Master Mix a la muestra, el fluorocromo
SYBR Green I se une inmediatamente a todo el DNA de doble cadena.
2. Durante la PCR, AmpliTaq Gold® DNA Polymerase amplifica la diana, lo que
crea el producto de PCR, o “amplicón”.
3. A continuación, el fluorocromo SYBR Green I se une a cada copia nueva del
DNA de doble cadena.
4. A medida que se produce la PCR, se crea más amplicón.
Dado que el fluorocromo SYBR Green I se une a todo el DNA de doble cadena,
el resultado es un aumento de la intensidad de la fluorescencia que es
proporcional a la cantidad de producto de PCR de doble cadena producido.
Las Figuras 2-2 más abajo ilustran este proceso.
Paso 1: Configuración de la reacción
El fluorocromo SYBR® Green I emite
una fluorescencia cuando se une
a DNA de doble cadena.
Paso 2: Desnaturalización
Cuando el DNA se desnaturaliza,
se libera el fluorocromo SYBR®
Green I y la fluorescencia disminuye
considerablemente.
CEBADOR
DIRECTO
Paso 3: Polimerización
Durante la extensión, los cebadores
se hibridan y se genera el producto
de PCR.
CEBADOR
REVERSO
Paso 4: Polimerización completada
El fluorocromo SYBR® Green I se une
al producto de doble cadena, lo que
produce un aumento neto de
la fluorescencia que detecta
el instrumento.
Figura 2-2
Funcionamiento de los reactivos SYBR Green
Selección del tipo de reactivo apropiado
Los reactivos TaqMan y SYBR Green se pueden utilizar para los tipos de
experimentos que se indican a continuación.
Tipo de experimento
Tipo de reactivo
Reactivos SYBR® Green
Reactivos TaqMan®
Cuantificación ‡
(Capítulo 3)
Genotipado
(Capítulo 4)
Presencia/
ausencia
(Capítulo 5)
Sí
Sí
No recomendado
Sí
No recomendado
Sí
‡ Incluye experimentos de curva estándar, cuantificación relativa.
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
2-5
Capítulo 2 Introducción a los reactivos
Consideraciones
sobre los
experimentos de
cuantificación
Los experimentos de cuantificación se pueden realizar con reactivos TaqMan o
SYBR Green. Tenga en cuenta lo siguiente a la hora de elegir entre dos tipos de
reactivos:
Tipo de reactivo
Reactivos o kits TaqMan®
Proceso
PCR y detección de cDNA
a. Componentes del ensayo
Descripción
MGB
Cebador reverso
Sonda
Los reactivos TaqMan utilizan una sonda
fluorogénica para permitir la detección de
un producto de PCR específico cuando se
acumula durante los ciclos de PCR.
Ventajas
F
Cebador directo
3'
Q
5'
Molde de cDNA
cDNA
3'
5'
Leyenda
b. Plantilla desnaturalizada e hibridada de los componentes del ensayo
• Aumenta la especificidad con una
sonda. La hibridación específica entre
la sonda y la diana genera una señal de
fluorescencia.
• Proporciona capacidades de multiplex.
• Hay disponibles ensayos
preformulados que están optimizados
para funcionar en condiciones de ciclos
térmicos universales.
• Se puede utilizar para la RT-PCR de 1 o
2 pasos.
3'
5'
Cebador reverso
MGB
Sonda
F
RP
Fluorocromo
FAM™
Q
Apantallador
Q
Cebador directo
3'
5'
Cebador aleatorio
F
MGB
c. Generación de señal
Ligando de unión
al surco menor
AmpliTaq Gold ®
DNA Polymerase
3'
5'
Sonda
Cebador reverso
Cebador
F
Cebador directo
MGB
5'
Q
3'
3'
5'
Molde
Cebador extendido
Limitaciones
Requiere la síntesis de una única sonda
Reactivos SYBR® Green
Paso 1: Configuración de la reacción
El fluorocromo SYBR® Green I emite
una fluorescencia cuando se une
a DNA de doble cadena.
Descripción
Los reactivos SYBR Green utilizan el
fluorocromo SYBR® Green I, que es un
fluorocromo de unión a DNA de doble
cadena que sirve para detectar productos
de PCR cuando se acumulan durante los
ciclos de PCR.
Paso 2: Desnaturalización
Cuando el DNA se desnaturaliza,
se libera el fluorocromo SYBR®
Green I y la fluorescencia disminuye
considerablemente.
Ventajas
• Económico (no se necesita una sonda).
• Permite que los análisis de curvas de
disociación midan la Tm de todos los
productos de PCR.
• Se puede utilizar para la RT-PCR de 1 o
2 pasos.
Limitaciones
Se une de manera no específica a todas
las secuencias de DNA de doble cadena.
Para evitar señales positivas falsas,
compruebe la formación de un producto
no específico utilizando un análisis de gel
o de curva de disociación.
CEBADOR
DIRECTO
Paso 3: Polimerización
Durante la extensión, los cebadores
se hibridan y se genera el producto
de PCR.
CEBADOR
REVERSO
Paso 4: Polimerización completada
El fluorocromo SYBR® Green I se une
al producto de doble cadena, lo que
produce un aumento neto de
la fluorescencia que detecta
el instrumento.
¡IMPORTANTE! Applied Biosystems no recomienda el uso del fluorocromo
TAMRA™ como notificador o apantallador con el sistema StepOne.
2-6
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Capítulo 2
Introducción a los reactivos
Reducción al mínimo de los contaminantes del DNA
La capacidad de amplificación de DNA del proceso de PCR hace necesario el uso de
prácticas especiales de laboratorio para realizar experimentos en los que se utilizan
reactivos TaqMan o SYBR Green. Las muestras que tienen altas concentraciones de
DNA podrían introducir contaminación, ya sea por los controles de moldes de DNA
o por la contaminación por arrastre de PCR.
Asimismo, debido a la naturaleza no específica del fluorocromo SYBR Green I, se
detecta cualquier DNA de doble cadena. Cuando utilice reactivos SYBR Green,
compruebe si se forman productos no específicos mediante un análisis de curva de
disociación o de gel. Procure evitar la contaminación con el DNA diana. Los ensayos
de expresión de genes que abarcan uniones exón-exón minimizan el efecto de los
contaminantes de gDNA (DNA genómico).
Uso de UNG para
reducir al mínimo
la reamplificación
de los productos
de contaminación
por arrastre
La uracil-N-glicosilasa, Amperase® (UNG) es una enzima recombinante de 26-kDa
codificada por el gen de uracil-N-glicosilasa de Escherichia coli. Este gen se ha
introducido en un huésped de E. coli para dirigir la expresión de la forma nativa de la
enzima (Kwok y Higuchi, 1989).
La UNG actúa en DNA de cadena sencilla y de doble cadena que contiene dU.
Hidroliza las uniones uracil-glicosídicas en emplazamientos de DNA que contienen
dU. La enzima causa la liberación de uracilo, por lo que se crea un emplazamiento
apiridímico sensible al álcali en el DNA. La enzima no tiene ninguna actividad en el
RNA o en el DNA que contiene dT (Longo et al., 1990).
Ensayos TaqMan
Para los ensayos TaqMan®, el tratamiento de AmpErase® UNG puede evitar la
reamplificación de los productos de PCR de contaminación por arrastre a partir de
reacciones de PCR anteriores. Si dUTP sustituye a dTTP en la reacción de
amplificación, el tratamiento de AmpErase UNG puede eliminar hasta 200.000
copias de amplicón por reacción de 50µL.
Nota: TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix está disponible con o sin AmpErase
UNG. Si utiliza TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2✕), No AmpErase®
UNG, debe adquirir AmpErase UNG por separado.
Ensayos de fluorocromo SYBR Green I
Para los ensayos de fluorocromo SYBR Green I , el tratamiento de AmpErase UNG
puede evitar la reamplificación de los productos de PCR de contaminación por
arrastre a partir de reacciones de PCR anteriores. Aunque Power SYBR® Green PCR
Master Mix y SYBR® Green PCR Master Mix no contienen AmpErase UNG, sí
contienen dUTP y, por lo tanto, son compatibles con AmpErase UNG. Si se sospecha
que hay contaminación por arrastre de PCR, utilice AmpErase UNG para solucionar
el problema.
Nota: AmpErase UNG se puede adquirir de manera individual o como parte de
SYBR® Green PCR Core Reagents Kit.
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
2-7
Capítulo 2 Introducción a los reactivos
Prácticas
generales de
PCR
2-8
Utilice las siguientes precauciones para reducir al mínimo la contaminación de las
muestras y la contaminación por arrastre de productos de PCR:
• Lleve una bata de laboratorio limpia (que no llevara puesta mientras manejaba
productos de PCR amplificados o durante la preparación de las muestras) y
guantes limpios cuando prepare las muestras para la reacción de amplificación.
Cámbiese de guantes siempre que sospeche que están contaminados.
• Mantenga áreas separadas, equipo especial y suministros para:
– Preparación de las muestras.
– Configuración de la PCR. Nunca lleve productos de PCR amplificados al
área de configuración de la PCR.
– Amplificación de PCR.
– Análisis de productos de PCR.
• Abra y cierre todos los tubos de muestras con cuidado. Procure no pulverizar ni
salpicar con muestras de PCR.
• Utilice pipetas de desplazamiento de aire o desplazamiento positivo con puntas
con filtro. Cambie las puntas después de cada uso.
• Mantenga las reacciones y los componentes tapados todo el tiempo posible.
• Limpie las mesas del laboratorio y el equipo periódicamente con una solución
de lejía al 10% o 70% de etanol.
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Experimentos de cuantificación
3
3
Este capítulo cubre los siguientes temas:
Sección 3.1 Acerca de los experimentos de cuantificación . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-3
Sección 3.2 Directrices de diseño . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-17
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
3-1
Capítulo 3 Experimentos de cuantificación
3-2
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Capítulo 3 Experimentos de cuantificación
Sección 3.1 Acerca de los experimentos de
cuantificación
Esta sección cubre los siguientes temas:
Introducción. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-4
Selección de un método de cuantificación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-5
Selección de una RT-PCR de 1 o 2 pasos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-8
Selección de PCR en singleplex o en multiplex . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-10
Selección del tipo de reactivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-13
Selección del tipo de ensayo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-13
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
3-3
Capítulo 3 Experimentos de cuantificación
Introducción
¿Qué es un
experimento de
cuantificación?
Un experimento de cuantificación es un experimento en tiempo real en el que se
mide la cantidad de una secuencia de ácido nucleico de una diana (diana) durante
cada ciclo de amplificación de la reacción en cadena de polimerasa (PCR). La diana
puede ser DNA, cDNA o RNA.
En esta guía, se explican tres tipos de experimentos de cuantificación:
• Curva estándar (página 3-5)
• Curva estándar relativa (página 3-5)
• CT comparativos (∆∆CT) (página 3-6)
Funcionamiento
de los
experimentos de
cuantificación
En los experimentos de cuantificación en tiempo real, las reacciones se caracterizan
por el punto temporal del ciclo en el que la amplificación de un producto de PCR
logra un nivel fijo de fluorescencia, en lugar de la cantidad final de producto de PCR
acumulado después de un número de ciclos fijo. Las gráficas de amplificación
muestran la fluorescencia detectada en el número de ciclos que se han realizado.
En los primeros ciclos de la PCR, no hay ningún cambio significativo en la señal de
fluorescencia. Este rango predefinido de ciclos de PCR se denomina línea basal. En
primer lugar, el software genera una gráfica de amplificación en la que se ha
sustraído la línea basal. Para ello, calcula una tendencia matemática de la señal del
notificador fluorescente normalizado (valores Rn correspondientes a los ciclos de la
línea basal). A continuación, un algoritmo busca el punto de la gráfica de
amplificación en el que la señal del notificador fluorescente normalizado con la línea
basal corregida (valor delta Rn [∆Rn]) cruza el umbral. El ciclo fraccional en el que
el valor ∆Rn cruza el umbral se define como CT.
Flujo de trabajo
Antes de realizar experimentos de cuantificación en Applied Biosystems StepOne™
Real-Time PCR System, prepare el experimento de la siguiente forma:
1. Seleccione un método de cuantificación (página 3-5).
2. Seleccione una RT-PCR de 1 o 2 pasos (página 3-8)
3. Seleccione reacciones de PCR en singleplex o en multiplex (página 3-10).
4. Seleccione el tipo de reactivo (página 3-13).
5. Seleccione el tipo de ensayo (página 3-13).
6. Revise las directrices de diseño del tipo de ensayo que ha seleccionado
(Sección 3.2 en la página 3-17).
3-4
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Capítulo 3 Experimentos de cuantificación
Selección de un método de cuantificación
Acerca de los
experimentos de
curva estándar
Los experimentos de curva estándar determinan la cantidad absoluta de una diana en
una muestra. Para conseguir los resultados, se utiliza una curva estándar construida a
partir de una dilución seriada de una cantidad conocida.
Componentes
Las reacciones de PCR de los experimentos de curva estándar incluyen los siguientes
componentes:
• Muestra: la muestra en la que la cantidad de la diana es desconocida.
• Estándar: una muestra de una cantidad conocida.
• Dilución seriada de estándar: un conjunto de diluciones del estándar (por
ejemplo, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32) que se utilizan para construir una curva
estándar.
• Réplicas: reacciones idénticas que contienen componentes y volúmenes
idénticos.
• Controles negativos: muestras que contienen agua o tampón en lugar de molde;
también se denominan NTC (sin ácido nucleico molde). Los controles negativos
no se deberían amplificar.
Acerca de los
experimentos de
curva estándar
relativa
Los experimentos de curva estándar relativa determinan el cambio de expresión de
una diana en una muestra en relación con la misma diana de una muestra de
referencia. Para conseguir los resultados, se utiliza una curva estándar construida a
partir de una dilución seriada de una cantidad conocida.
Los experimentos de curva estándar relativa se suelen utilizar para:
• Comparar niveles de expresión de un gen en diferentes tejidos.
• Comparar los niveles de expresión de un gen en una muestra tratada y en una
muestra no tratada.
• Comparar los niveles de expresión de alelos de tipo salvaje y alelos mutados.
Componentes
Las reacciones de PCR de los experimentos de curva estándar relativa incluyen los
siguientes componentes:
• Muestra: la muestra en la que la cantidad de la diana es desconocida.
• Muestra de referencia: la muestra utilizada como base para los resultados de la
comparación. Por ejemplo, en un estudio sobre los efectos de las drogas en la
expresión de genes, un control no tratado sería una muestra de referencia
apropiada.
• Estándar: una muestra de una cantidad conocida.
• Dilución seriada de estándar: un conjunto de diluciones del estándar (por
ejemplo, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32) que se utilizan para construir una curva
estándar. En todas las muestras, la cantidad de diana se determina realizando
una interpolación a partir de la curva estándar y luego dividiendo por la cantidad
de diana de la muestra de referencia. Dado que la muestra de referencia es la
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
3-5
Capítulo 3 Experimentos de cuantificación
muestra 1✕, todas las demás cantidades se expresan como una diferencia
multiplicada por n relativa a ella. Asimismo, la unidad de la curva estándar
desaparece porque la cantidad de muestra se divide por la cantidad de muestra
de referencia. Por consiguiente, lo único que se necesita de los estándares es
conocer sus diluciones relativas. Se puede utilizar cualquier cDNA, RNA o
DNA de solución de partida que contenga la diana apropiada para preparar los
estándares.
• Control endógeno: un gen presente en un nivel de expresión uniforme en todas
las muestras. El control endógeno sirve para normalizar posibles variaciones de
la cantidad de cDNA que se añade a cada reacción producidas como
consecuencia de imprecisiones en el pipeteo.
• Réplicas: reacciones idénticas que contienen componentes y volúmenes
idénticos.
• Controles negativos: muestras que contienen agua o tampón en lugar de molde;
también se denominan NTC (sin ácido nucleico molde). Los controles negativos
no se deberían amplificar.
Acerca de los
experimentos de
CT comparativos
Los experimentos de CT comparativos (∆∆CT) determinan el cambio de expresión de
una diana en una muestra en relación con la misma diana en una muestra de
referencia. Se utiliza una fórmula aritmética para conseguir los resultados (consulte
“Fórmula para experimentos de CT comparativos (∆∆CT)” en la página A-1).
Los experimentos de CT comparativos se suelen utilizar para:
• Comparar niveles de expresión de un gen en diferentes tejidos.
• Comparar los niveles de expresión de un gen en una muestra tratada y en una
muestra no tratada.
• Comparar los niveles de expresión de alelos de tipo salvaje y alelos mutados.
Componentes
Las reacciones de PCR de los experimentos de CT comparativos incluyen los
siguientes componentes:
• Muestra: la muestra en la que la cantidad de la diana es desconocida.
• Muestra de referencia: la muestra utilizada como base para los resultados de la
comparación. Por ejemplo, en un estudio sobre los efectos de las drogas en la
expresión de los genes, un control no tratado sería una muestra de referencia
apropiada.
• Control endógeno: un gen presente en un nivel de expresión uniforme en todas
las muestras. El control endógeno sirve para normalizar posibles variaciones de
la cantidad de cDNA que se añade a cada reacción producidas como
consecuencia de imprecisiones en el pipeteo.
• Réplicas: reacciones idénticas que contienen componentes y volúmenes
idénticos.
• Controles negativos: muestras que contienen agua o tampón en lugar de molde;
también se denominan NTC (sin ácido nucleico molde). Los controles negativos
no se deberían amplificar.
3-6
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Capítulo 3 Experimentos de cuantificación
Comparación de
métodos de
cuantificación
Tipo de
experimento
Tenga en cuenta lo siguiente a la hora de elegir entre experimentos de curva estándar,
experimentos de curva estándar relativa y experimentos de CT comparativos:
Descripción
Ventaja
Limitación
Curva estándar
Se utiliza una curva estándar
para determinar la cantidad
absoluta de una diana en una
muestra. Se suele utilizar para
cuantificar la carga viral.
Permite realizar
comparaciones con
cantidades estándar
conocidas.
Se debe crear una curva
estándar para cada diana, lo
que exige más reactivos y más
espacio en la placa de
reacción.
Curva estándar
relativa
Se utiliza una curva estándar
para determinar el cambio de
expresión de una diana en una
muestra en relación con la
misma diana en una muestra
de referencia. Es ideal para los
ensayos que tienen una
eficiencia de PCR por debajo
de la óptima.
Es el experimento que requiere
menos validación, porque las
eficiencias de PCR de la diana
y el control endógeno no
tienen que ser equivalentes.
Se debe crear una curva
estándar para cada diana, lo
que exige más reactivos y más
espacio en la placa de
reacción.
CT
comparativos
(∆∆CT)
Se utilizan fórmulas aritméticas
para determinar el cambio de
expresión de una diana en una
muestra en relación con la
misma diana en una muestra
de referencia. Es ideal para
realizar mediciones de alto
rendimiento de una expresión
de gen relativa en muchos
genes de muchas muestras.
• Los niveles relativos de
diana en las muestras se
pueden determinar sin
utilizar una curva estándar,
siempre que las eficiencias
de PCR de la diana y el
control endógeno sean
relativamente equivalentes.
• Menor uso de reactivos.
• Más espacio disponible en
la placa de reacción.
• Los ensayos que no son
óptimos (con una eficiencia
de PCR baja) pueden
producir resultados
imprecisos.
• Antes de utilizar el método
de CT comparativos,
Applied Biosystems
recomienda determinar si
las eficiencias de PCR del
ensayo diana y el ensayo de
control endógeno son
aproximadamente iguales.
Para obtener más
información
Para obtener más información acerca de los métodos de cuantificación, consulte
User Bulletin #2: Relative Quantitation of Gene Expression.
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
3-7
Capítulo 3 Experimentos de cuantificación
Selección de una RT-PCR de 1 o 2 pasos
La transcripción reversa-reacción en cadena de polimerasa (RT-PCR) se utiliza para
cuantificar el RNA. La RT-PCR se puede realizar en un procedimiento de 1 o 2
pasos.
Acerca de la RTPCR de 1 paso
En las RT-PCR de 1 paso, se puede realizar la transcripción reversa y la PCR en un
solo sistema de tampón (Figura 3-1). La reacción se realiza sin necesidad de añadir
reactivos entre los pasos de RT y PCR. La RT-PCR de 1 paso es cómoda porque sólo
se necesita una preparación de un tubo para la amplificación de RT y PCR. Sin
embargo, con la RT-PCR de 1 paso no se puede utilizar la enzima de prevención de
contaminación por arrastre, AmpErase® uracil-N-glicosylasa (UNG). En la RT-PCR
de 1 paso, la presencia de UNG destruiría el cDNA a medida que se fuera creando.
Para obtener información acerca de UNG, consulte “Uso de UNG para reducir al
mínimo la reamplificación de los productos de contaminación por arrastre” en la
página 2-7.
Un
solo
tubo
Figura 3-1
Acerca de la RTPCR de 2 pasos
3-8
Representación esquemática de la RT-PCR de 1 paso
La RT-PCR de 2 pasos se realiza en dos reacciones distintas: una para la RT y otra
para la PCR (Figura 3-2). La RT-PCR de 2 pasos es útil para detectar múltiples
transcripciones a partir de una sola reacción de cDNA, o para guardar una parte del
cDNA para utilizarlo más adelante. Si la PCR se realiza utilizando dUTP como una
de las bases, se puede utilizar la enzima AmpErase® UNG para evitar la
contaminación por arrastre. Para obtener información acerca de UNG, consulte “Uso
de UNG para reducir al mínimo la reamplificación de los productos de
contaminación por arrastre” en la página 2-7.
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Capítulo 3 Experimentos de cuantificación
Tubo 1
Oligo d(T) o hexámero aleatorio
Tubo 2
Figura 3-2
Cebadores
utilizados para la
síntesis de cDNA
Paso de PCR
Representación esquemática de la RT-PCR de 2 pasos
Para la RT-PCR de 1 paso, se pueden utilizar cebadores reversos específicos de la
secuencia para la síntesis del cDNA.
Para la RT-PCR de 2 pasos, se pueden utilizar los siguientes cebadores para la
síntesis del cDNA:
• Oligo d(T)16
• Cebadores aleatorios
• Cebadores reversos específicos de la secuencia
Es mejor realizar la elección de cebadores para la transcripción reversa después de
evaluar experimentalmente los tres sistemas de cebadores. Para secuencias de RNA
cortas que no contengan estructuras en horquilla, cualquiera de los tres sistemas
funciona bien. Para transcripciones o secuencias de RNA más largas que contengan
estructuras en horquilla, siga estas directrices:
Cebadores
Directrices de selección
Oligo d(T)16
• Se utiliza para realizar transcripciones reversas sólo de mRNA
eurocariota y retrovirus con colas de poli-A.
• Evita amplicones o transcripciones de mRNA largas mayores
de 2 kilobases en sentido ascendente desde el emplazamiento
del poli-A.
Cebadores aleatorios
• Intente utilizarlos primero con transcripciones reversas largas
o transcripciones reversas que contengan estructuras en
horquilla.
• Se utiliza para transcribir todo el RNA (rRNA, mRNA y tRNA).
Cebadores reversos
específicos de la
secuencia
• Se utilizan para realizar transcripciones reversas sólo de
secuencias complementarias que contengan RNA.
• Se utiliza en la RT-PCR de 1 paso.
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
3-9
Capítulo 3 Experimentos de cuantificación
Comparación de
métodos de RTPCR
Método
Cebadores para la síntesis de
cDNA
RT-PCR
de 1 paso
Cebador reverso específico de la
secuencia
Comentarios
Requiere una sola mezcla de
reacción.
No se puede utilizar AmpErase®
UNG.
RT-PCR
de 2 pasos
Hexámeros aleatorios
El cDNA se puede guardar para
utilizarlo posteriormente.
Oligo d(T)16
Se puede utilizar AmpErase® UNG.
Cebadores reversos específicos de
la secuencia
Requiere dos mezclas de reacción.
Selección de PCR en singleplex o en multiplex
Se puede realizar una reacción de PCR utilizando:
• PCR en singleplex: Para experimentos de curva estándar, cuantificación
relativa. En la PCR en singleplex, hay un solo conjunto de cebadores en el tubo
de reacción o el pocillo. Sólo se puede amplificar una diana o un control
endógeno por reacción.
o
• PCR en multiplex: Para experimentos de CT comparativos. En la PCR en
multiplex, hay dos o más conjuntos de cebadores en el tubo de reacción o
pocillo. Cada conjunto amplifica una diana o un control endógeno específicos.
Normalmente, una sonda marcada con fluorocromo FAM™ detecta la diana y
una sonda marcada con fluorocromo VIC® detecta el control endógeno.
¡IMPORTANTE! No se pueden utilizar reactivos SYBR®Green para la PCR en
multiplex.
¡IMPORTANTE! Applied Biosystems no recomienda el uso del fluorocromo
TAMRA™ como notificador o apantallador con el sistema StepOne.
Conjunto de cebadores de gen diana
Conjunto de cebadores de control
endógeno
PCR en singleplex
PCR en mulitplex
para
experimentos de
CT comparativos
3-10
PCR en multiplex
cDNA
GR2331
Para realizar una PCR en multiplex para los experimentos de CT comparativos, debe:
• Asegurarse de que el control endógeno que ha seleccionado es más abundante
(menor CT) que todas las dianas que está intentando cuantificar en todas las
condiciones.
• Realice el ensayo del control endógeno como un ensayo con limitación de
concentración de cebadores. El ensayo del control endógeno (para el molde más
abundante) en cada reacción debe tener el cebador limitante para evitar la
competencia en la PCR y altere el CT del molde menos abundante.
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Capítulo 3 Experimentos de cuantificación
Limitación del cebador en la PCR en multiplex
Para generar un ensayo en multiplex preciso, es importante que la amplificación de
una especie no domine a la otra. De lo contrario, la amplificación de una especie
muy abundante puede impedir que la especie menos abundante se amplifique
eficientemente.
Si la especie menos abundante no se amplifica eficientemente, los resultados del
experimento podrían ser imprecisos o, en los casos más graves, se podría inhibir por
completo la detección de la especie menos abundante. Para evitar este problema,
limite las concentraciones de los cebadores que se utilizan para amplificar la especie
más abundante, de manera que la amplificación se “desactive” poco después de
establecer el CT. Sin embargo, los ensayos con cebadores limitantes son más
susceptibles a sufrir fluctuaciones en las condiciones de la reacción que los ensayos
de dianas con cebadores no limitados que se normalizan. Para obtener más
información, consulte el Apéndice B, “Limitación del cebador en la PCR en
multiplex.”.
PCR en singleplex y PCR en multiplex
La limitación de cebadores en la PCR en multiplex es cada vez más compleja a
medida que aumenta el número de dianas que se desea cuantificar. Para analizar un
gran número de dianas, quizá sea más eficiente utilizar la PCR en singleplex por las
siguientes razones:
• En la PCR en multiplex, puede resultar difícil encontrar un control endógeno
adecuado, es decir, uno que:
– Sea más abundante que todas las dianas que se están cuantificando.
– No cambie los niveles de expresión con condiciones experimentales o entre
diferentes muestras.
En primer lugar, tendría que realizar todos los ensayos diana y todos los ensayos
de control endógeno en los formatos en multiplex y en singleplex, y luego
comparar los valores de CT de ambos formatos para determinar si la
multiplexación ha afectado a los valores de CT.
• En la PCR en singleplex, cualquier diana que no cambie los niveles de expresión
con condiciones experimentales o entre muestras puede servir de control
endógeno. Por lo tanto, cuantas más dianas se tengan en un formato en
singleplex, más probabilidades hay de que haya uno o varios controles
endógenos adecuados con los que normalizar las demás dianas.
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
3-11
Capítulo 3 Experimentos de cuantificación
Tenga en cuenta lo siguiente a la hora de elegir entre la PCR en singleplex y la PCR
en multiplex para los experimentos de CT comparativos:
PCR
Descripción
Ventaja
En singleplex
Reacción en la que se
amplifica una sola
diana o control
endógeno en el tubo de
reacción o pocillo.
• No es necesario optimizar los
ensayos TaqMan®.
• Cualquier diana que no cambie
los niveles de expresión con
condiciones experimentales o
entre muestras puede servir de
control endógeno.
• Flexibilidad para utilizar reactivos
TaqMan® o SYBR® Green.
• Se requiere una muestra para
la diana y para el control
endógeno.
En multiplex
Reacción en la que se
amplifica más de una
diana o control
endógeno en el tubo de
reacción o pocillo.
• Reduce los costes del proceso y
la dependencia de la precisión del
pipeteo al separar una muestra en
dos tubos diferentes.
• El ensayo del control
endógeno se debe realizar
como un ensayo con cebador
limitante.
• Requiere validación y
optimización.
• Podría no ser tan efectiva
como la PCR en singleplex
para analizar un gran número
de dianas.
• No se pueden utilizar reactivos
SYBR® Green.
3-12
Limitación
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Capítulo 3 Experimentos de cuantificación
Selección del tipo de reactivo
Reactivos
TaqMan y
reactivos SYBR
Green
En el sistema StepOne, se pueden realizar experimentos de cuantificación con:
• Reactivos TaqMan®
• Reactivos SYBR® Green
Para obtener información acerca de la elección de reactivos TaqMan o reactivos
SYBR Green, consulte “Consideraciones sobre los experimentos de cuantificación”
en la página 2-6.
Selección del tipo de ensayo
Para diseñar experimentos con el software StepOne, puede seleccionar los siguientes
tipos de ensayos para los experimentos de cuantificación:
• En inventario/fabricados bajo pedido (página 3-14)
• Personalizados (página 3-15)
En esta sección, se enumeran los productos disponibles para cada tipo de ensayo.
Nota: Los ensayos son específicos de la diana de interés. Las mezclas de reacción
contienen los demás componentes que son necesarios para la reacción de PCR.
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
3-13
Capítulo 3 Experimentos de cuantificación
Ensayos en
inventario/
fabricados bajo
pedido
Producto
Atributos
TaqMan® Gene
Expression Assays
• Conjuntos de sondas y cebadores prediseñados y
específicos de un gen para genes humanos, de ratones,
ratas, Arabidopsis, Drosophila, C. elegans, C. familiares
(perro) y Rhesus.
• Cómodo formato de un solo tubo disponible en ensayos
en inventario o fabricados bajo pedido.
TaqMan® Endogenous
Control Assays
• Ensayos de control endógeno optimizados, preformulados
y listos para ser usados.
• Cuantificación rentable para la expresión de genes para
humanos, ratones, ratas, Arabidopsis, Drosophila y
cualquier especie eurocariota.
• Posibilidad de elección de marcaje con fluorocromo FAM™
o VIC® (con cebador limitante).
Nota: Los TaqMan
Endogenous Control
Assays están incluidos en
los TaqMan Gene
Expression Assays en
inventario.
Custom TaqMan® Gene
Expression Assays
• Cualquier especie u organismo.
• Elección de la diana.
• Cómodo formato de un solo tubo.
TaqMan® 2✕ Universal
PCR Master Mix (con o
sin AmpErase® UNG)
• Proporciona un rendimiento óptimo para los ensayos
TaqMan® que utilizan cDNA o DNA como molde.
• Contiene componentes que garantizan un rendimiento
excelente del ensayo.
• El uso de un reactivo para todos los ensayos simplifica el
proceso de implementación de los ensayos.
TaqMan® Fast Universal
PCR Master Mix (2✕), No
AmpErase® UNG
• Proporciona los mismos atributos que se han indicado
anteriormente para TaqMan® 2✕ Universal PCR Master
Mix.
• Permite realizar experimentos de cuantificación en el
sistema StepOne™ en aproximadamente 35 minutos.
¡IMPORTANTE! Applied Biosystems no recomienda el uso del fluorocromo
TAMRA™ como notificador o apantallador con el sistema StepOne.
Para conocer las directrices de diseño de experimentos con ensayos en inventario o
fabricados bajo pedido, consulte la página 3-18.
3-14
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Capítulo 3 Experimentos de cuantificación
Ensayos
personalizados
Producto
Atributos
Sondas y cebadores
TaqMan® personalizados
• Cualquier especie u organismo.
• Posibilidad de elección de marcajes de fluorocromos,
apantalladores y escalas de síntesis.
• Para uso con el software Primer Express® y las directrices
de diseño de ensayos de Applied Biosystems.
Software Primer
Express®
Software que diseña cebadores y sondas para PCR en
tiempo real.
TaqMan® 2✕ Universal
PCR Master Mix (con o
sin AmpErase® UNG)
• Proporciona un rendimiento óptimo para los ensayos
TaqMan® que utilizan cDNA o DNA como molde.
• Contiene componentes que garantizan un rendimiento
excelente del ensayo.
• El uso de un reactivo para todos los ensayos simplifica el
proceso de implementación de los ensayos.
TaqMan® Fast Universal
PCR Master Mix (2✕), No
AmpErase® UNG
• Proporciona los mismos atributos que se han indicado
anteriormente para TaqMan® 2✕ Universal PCR Master
Mix.
• Permite realizar experimentos de cuantificación en el
sistema StepOne™ en aproximadamente 35 minutos.
Power SYBR® Green
PCR Master Mix
• La gran sensibilidad de la cuantificación permite detectar
pocos números de copias (hasta dos copias de un gen
diana).
• Detecta DNA de doble cadena, por lo que no se necesitan
sondas específicas.
• Contiene AmpliTaq Gold® DNA Polymerase LD altamente
purificado para reducir al mínimo la formación de
productos no específicos (incluido dímero de cebador).
• Para uso con el software Primer Express® y las directrices
de diseño de ensayos de Applied Biosystems.
SYBR® Green PCR
Master Mix
• Detecta DNA de doble cadena, por lo que no se necesitan
sondas específicas.
• Para aplicaciones estándar cuando no se requiere una
gran sensibilidad.
• Contiene AmpliTaq Gold® DNA Polymerase para reducir al
mínimo la formación de productos no específicos (incluido
dímero de cebador).
• Para uso con el software Primer Express® y las directrices
de diseño de ensayos de Applied Biosystems.
¡IMPORTANTE! Applied Biosystems no recomienda el uso del fluorocromo
TAMRA™ como notificador o apantallador con el sistema StepOne.
Para conocer las directrices de diseño de experimentos con ensayos personalizados,
consulte la página 3-22.
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
3-15
Capítulo 3 Experimentos de cuantificación
3-16
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Capítulo 3 Experimentos de cuantificación
Sección 3.2 Directrices de diseño
Esta sección cubre los siguientes temas:
Ensayos en inventario/fabricados bajo pedido. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-18
TaqMan® Gene Expression Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-18
Custom TaqMan® Gene Expression Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-20
Selección de la mezcla de reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-21
Diseño del experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-22
Ensayos personalizados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-22
Diseño de cebadores y sondas con el software Primer Express® . . . . . . . .
Selección de reactivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Uso de las condiciones de termociclado recomendadas . . . . . . . . . . . . . . .
Optimización de concentraciones de cebador . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Optimización de la concentración de sonda . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Para obtener más información . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
3-23
3-26
3-28
3-31
3-35
3-37
3-17
Capítulo 3 Experimentos de cuantificación
Ensayos en inventario/fabricados bajo pedido
Flujo de trabajo
Si se selecciona el tipo de ensayo Inventoried/Made to Order (En
inventario/fabricado bajo pedido) en el software StepOne™, Applied Biosystems
recomienda seguir el flujo de trabajo que se indica a continuación:
1. Seleccione el ensayo:
• TaqMan® Gene Expression Assays (más abajo).
• Custom TaqMan® Gene Expression Assays (página 3-20).
2. Seleccione la mezcla de reacción (página 3-21).
3. Diseñe el experimento utilizando el software StepOne (página 3-22).
TaqMan® Gene Expression Assays
Descripción del
producto
TaqMan® Gene Expression Assays son una colección completa de conjuntos de
sondas y cebadores en inventario y fabricados bajo pedido que sirven para realizar
experimentos de cuantificación en genes humanos, de ratones, ratas, Arabidopsis,
Drosophila, C. elegans, C. familiares (perro) y Rhesus.
Cada ensayo está diseñado con un procedimiento de diseño automatizado en el que
se ha controlado la calidad. Los ensayos en inventario ya están fabricados y en
inventario, mientras que los ensayos fabricados bajo pedido están prediseñados y se
fabrican cuando se realiza el pedido.
Propiedades del
producto
3-18
Todos los TaqMan Gene Expression Assays:
• Requieren tres componentes:
– 1 a 100 ng de muestra de cDNA (obtenido a partir de RNA) por pocillo,
teniendo todos los pocillos la misma cantidad de DNA.
– 20✕ de Gene Expression Assay Mix (específica para cada diana). Cada
mezcla de ensayo consta de dos cebadores de PCR no marcados y una sonda
MGB (ligando de unión al surco menor) TaqMan® marcada con fluorocromo
FAM™ en una mezcla preformulada de 20✕. Las concentraciones finales de
1✕ son de 250 nM para la sonda y de 900 nM para cada cebador.
– TaqMan® Universal PCR Master Mix (con o sin AmpErase® UNG) o
TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix, No AmpErase® UNG.
• Están diseñadas y optimizadas para funcionar con una mezcla de reacción
TaqMan® utilizando condiciones de ciclos térmicos universales.
• Para obtener resultados, sólo se requiere un paso de amplificación de la PCR y
una lectura simultánea en tiempo real.
• Cuando sea posible, amplifique el cDNA diana sin amplificar el DNA
genómico (sufijo m en el identificador de ensayo) diseñando sondas diseñadas
sobre la unión exón-exón.
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Capítulo 3 Experimentos de cuantificación
Ensayos
disponibles
Los TaqMan Gene Expression Assays están disponibles para los genes humanos, de
ratones, ratas, Arabidopsis, Drosophila, C. elegans, C. familiares (perros) y Rhesus.
Los números de referencia son:
• PN 4331182 para los ensayos en inventario
• PN 4351372 para los ensayos fabricados bajo pedido
El prefijo del nombre del ensayo indica la especie para la que se ha diseñado el
ensayo: Hs para Homo sapiens (humano), Mm para Mus musculus (ratón), Rn para
Rattus norvegicus (rata), At para Arabidopsis thaliana, Dm para Drosophila
melanogaster, Ce para C. elegans, Cf para C. familiares (perro) y Rh para Rhesus.
El sufijo del nombre del ensayo indica la colocación del ensayo, tal y como se
describe en la siguiente tabla.
Sufijo
Descripción
_m
La sonda del ensayo está diseñada sobre la unión de dos exones; el ensayo
no detecta DNA genómico.
_s
Los cebadores y las sondas del ensayo están diseñados en un solo exón; el
ensayo detecta DNA genómico.
_g
Los cebadores y las sondas del ensayo pueden estar en un solo exón; el
ensayo puede detectar DNA genómico.
_mH
_sH
_gH
_u
El ensayo se ha diseñado para una transcripción que pertenece a una familia
de genes con una homología de secuencias alta. El ensayo ofrece una
diferencia de entre 10 CT y 15 CT entre el gen diana y el gen con la homología
de secuencias más próxima. Por lo tanto, el ensayo detecta la transcripción
de la diana con una discriminación (sensibilidad) entre 1000 y 3000 veces
mayor que la transcripción homóloga más próxima, si está presente en el
mismo número de copias de una muestra.
El amplicón del ensayo está diseñada sobre la unión de dos exones y la
sonda se asienta por completo en uno de los exones expandidos.
TaqMan® Endogenous Control Assays
Los TaqMan® Endogenous Control Assays están incluidos en los TaqMan Gene
Expression Assays (PN 4331182) en inventario. Los TaqMan Endogenous Control
Assays:
• Están disponibles como un TaqMan Gene Expression Assay con una sonda
TaqMan MGB con marcaje con fluorocromo FAM™ en un solo tubo
preformulado de 20✕.
• Están disponibles para todas las especies de humano, ratón, y rata, con sondas
TaqMan MGB con marcaje con fluorocromo VIC® o FAM™. Los controles
endógenos TaqMan con marcajes de fluorocromo VIC tienen los cebadores
limitantes.
¡IMPORTANTE! Applied Biosystems no recomienda el uso del fluorocromo
TAMRA™ como notificador o apantallador con el sistema StepOne.
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
3-19
Capítulo 3 Experimentos de cuantificación
Para obtener más
información
• Para obtener más información acerca de los últimos productos disponibles y los
usos específicos de los productos, consulte el sitio web de Applied Biosystems:
http://www.appliedbiosystems.com/
a. En la página de inicio, bajo TaqMan® Products (Productos TaqMan),
seleccione TaqMan® Gene Expression Assays.
b. En la página Gene Expression Assays & Arrays (Matrices y ensayos de
expresión de genes), bajo Individual Assays (Ensayos individuales),
seleccione TaqMan® Gene Expression Assays.
• Para obtener información acerca de Custom TaqMan Endogenous Control
Assays, consulte Using TaqMan® Endogenous Control Assays to Select an
Endogenous Control for Experimental Studies Application Note.
• Para obtener información acerca de la preparación de reacciones de PCR con
TaqMan Gene Expression Assays, consulte TaqMan® Gene Expression Assays
Protocol.
Custom TaqMan® Gene Expression Assays
Descripción del
producto
Custom TaqMan® Gene Expression Assays son conjuntos de sondas y cebadores de
TaqMan que ha diseñado, sintetizado y formulado el servicio Custom TaqMan®
Genomic Assays de acuerdo con la información de secuencia remitida. Los Custom
TaqMan Gene Expression Assays le permiten realizar experimentos de
cuantificación en cualquier gen o variante de splicing de cualquier organismo.
Los ensayos emplean reactivos TaqMan para amplificar y detectar la diana en
muestras de cDNA. Todos los ensayos se han desarrollado utilizando software de
diseño de ensayos propio.
Propiedades del
producto
3-20
Todos los Custom TaqMan Gene Expression Assays:
• Requieren que se cree un archivo de envío (con el software gratuito File
Builder) con la secuencia de diana y que dicho archivo se envíe al servicio
Custom TaqMan Genomic Assays.
• Requieren tres componentes:
– 1 a 100 ng de muestra de cDNA (obtenido a partir de RNA) por pocillo,
teniendo todos los pocillos la misma cantidad de DNA.
– 20✕ de Gene Expression Assay o 60✕ de Gene Expression Assay (específico
para cada diana). Cada ensayo consta de dos cebadores específicos de la
diana y una sonda TaqMan MGB con marcaje del fluorocromo FAM™ en una
mezcla preformulada de 20✕ o 60✕. Las concentraciones finales de 1✕ son
de 250 nM para la sonda y de 900 nM para cada cebador.
– TaqMan® Universal PCR Master Mix (con o sin AmpErase® UNG) o
TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix, No AmpErase® UNG.
• Están diseñadas y optimizadas para funcionar con una mezcla de reacción
TaqMan utilizando condiciones de ciclos térmicos universales.
• Para obtener resultados, sólo se requiere un paso de amplificación de la PCR y
una lectura simultánea en tiempo real.
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Capítulo 3 Experimentos de cuantificación
Para obtener más
información
• Para obtener más información acerca de los últimos productos disponibles y los
usos específicos de los productos, consulte el sitio web de Applied Biosystems:
http://www.appliedbiosystems.com/
a. En la página de inicio, bajo TaqMan® Products (Productos TaqMan),
seleccione TaqMan® Gene Expression Assays.
b. En la página Gene Expression Assays & Arrays (Matrices y ensayos de
expresión de genes), bajo Individual Assays (Ensayos individuales),
seleccione Custom TaqMan® Gene Expression Assays.
• Para obtener información acerca de cómo pedir Custom TaqMan Gene
Expression Assays, consulte Custom TaqMan® Genomic Assays Protocol:
Submission Guidelines.
• Para obtener información acerca de la preparación de reacciones de PCR con
Custom TaqMan Gene Expression Assays, consulte Custom TaqMan® Gene
Expression Assays Protocol.
Selección de la mezcla de reacción
Mezclas de
reacción
disponibles
Para obtener más
información
Los ensayos en inventario/fabricados bajo pedido de Applied Biosystems para los
experimentos de cuantificación están diseñados para las siguientes mezclas de
reacción TaqMan®:
Mezcla de reacción
Número de
referencia
TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2✕), No AmpErase® UNG,
250 reacciones
4352042
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix, 200 reacciones
4304437
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix, 2000 reacciones
4326708
Pack de 10, TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix
4305719
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix, No AmpErase® UNG, 200
reacciones
4324018
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix, No AmpErase® UNG, 2000
reacciones
4326614
Pack de 10, TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix, No AmpErase®
UNG
4324020
Para obtener más información acerca del uso de reactivos TaqMan, consulte:
• TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2✕) Protocol
• TaqMan® Universal PCR Master Mix Protocol
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
3-21
Capítulo 3 Experimentos de cuantificación
Diseño del experimento
Uso del software
StepOne
Para los ensayos en inventario/fabricados bajo pedido de Applied Biosystems, utilice
el software StepOne para diseñar sus experimentos de cuantificación. El software
StepOne calcula automáticamente volúmenes para:
• Componentes de la mezcla de la reacción
• Diluciones de muestras
• (Sólo experimentos de curva estándar y curva estándar relativa) Series de
dilución estándar
Nota: Cuando seleccione el tipo de ensayo Inventoried/Made to Order (En
inventario/fabricado bajo pedido) en el software StepOne, vaya a la pantalla Reaction
Setup (Configuración de reacción) en el flujo de trabajo del asistente de diseño o
Advanced Setup (Configuración avanzada) y, a continuación, seleccione
Inventoried/Made to Order (En inventario/fabricado bajo pedido) en el menú
desplegable Assay Type (Tipo de ensayo).
Para obtener más
información
Para obtener más información acerca del diseño y la realización de experimentos de
cuantificación en el sistema StepOne, consulte:
• Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
para experimentos de curva estándar
• Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
para experimentos de cuantificación relativa
Ensayos personalizados
Flujo de trabajo
Si selecciona el tipo de ensayo Custom (Personalizado) en el software StepOne™
para realizar un experimento de cuantificación (es decir, si va diseñar sus propios
cebadores y sondas), Applied Biosystems recomienda seguir el flujo de trabajo de las
directrices de diseño de ensayos de Applied Biosystems:
1. Diseñe los cebadores y las sondas con el software Primer Express® (más abajo).
2. Seleccione los reactivos adecuados (página 3-26).
¡IMPORTANTE! Applied Biosystems no recomienda el uso del fluorocromo
TAMRA™ como notificador o apantallador con el sistema StepOne.
3. Utilice las condiciones de ciclos térmicos recomendadas (página 3-28).
3-22
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Capítulo 3 Experimentos de cuantificación
4. Comience con las concentraciones de cebadores y sondas predeterminadas. Si
es preciso, optimice las concentraciones de cebador (página 3-31) y las
concentraciones de sonda (página 3-35).
¡IMPORTANTE! Estos pasos son un sistema rápido y fiable para diseñar y optimizar
los ensayos únicamente si se siguen de principio a fin. Utilice el sistema en su
totalidad para lograr los mejores resultados. Para leer una descripción más detallada
de las directrices de diseño de ensayos de Applied Biosystems, consulte el
Apéndice C.
Nota: Cuando seleccione el tipo de ensayo Custom (Personalizado) en el software
StepOne, vaya a la pantalla Reaction Setup (Configuración de reacción) en el flujo
de trabajo del asistente de diseño o Advanced Setup (Configuración avanzada) y, a
continuación, seleccione Custom (Personalizado) en el menú desplegable Assay
Type (Tipo de ensayo).
Diseño de cebadores y sondas con el software Primer Express®
El software Primer Express® utiliza los parámetros recomendados cuando seleccione
cebadores y sondas basándose en la secuencia de DNA que se proporciona.
Si va a diseñar su propio ensayo, utilice el resumen de las directrices de diseño de
cebadores y sondas para experimentos de cuantificación en la página 3-25. Para leer
una explicación más detallada de estas directrices, consulte “Acerca de las directrices
de diseño de cebadores y sondas” en la página 3-24.
¡IMPORTANTE! Applied Biosystems no recomienda el uso del fluorocromo
TAMRA™ como notificador o apantallador con el sistema StepOne.
Nota: Aunque no se necesita una sonda para detectar el fluorocromo SYBR® Green
I, sigue siendo conveniente utilizar el software Primer Express cuando seleccione un
conjunto de cebadores y sondas a la hora de diseñar un ensayo para reactivos SYBR®
Green. Aunque no se utilice ninguna sonda, los cebadores cumplen todos los
criterios necesarios; si necesita convertir el ensayo en reactivos TaqMan para obtener
una especifidad mayor, encontrará la sonda inmediatamente en el documento original
del software Primer Express.
Selección de un
emplazamiento
de amplicones
para los ensayos
de cuantificación
La selección de un buen emplazamiento de amplicones garantiza la amplificación de
la diana mRNA/cDNA sin coamplificar la secuencia genómica, los pseudogenes y
otros genes relacionados. Los reactivos SYBR Green pueden ser útiles para cribar los
emplazamientos de amplicones para la expresión de genes.
Directrices
• El amplicón debería expandir uno o varios intrones para evitar la amplificación
del gen diana en el DNA genómico.
• La pareja de cebadores debería ser específica al gen diana para evitar la
amplificación de los pseudogenes u otros genes relacionados.
• Para diseñar cebadores, utilice las directrices del software Primer Express.
• Si no se encuentra ninguna secuencia buena, puede que sea necesario examinar
la secuencia y volver a diseñar el amplicón o simplemente realizar un cribado
para encontrar más emplazamientos.
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
3-23
Capítulo 3 Experimentos de cuantificación
Si el gen que está estudiando no tiene intrones, no es posible diseñar un amplicón que
amplifique la secuencia de mRNA sin amplificar la secuencia genómica. En este
caso, realice un control de la muestra de RNA en la que no se haya realizado una
transcripción reversa (controles RT menos).
Acerca de las
directrices de
diseño de
cebadores y
sondas
Selección de pequeños amplicones
Uno de los parámetros predeterminados más importantes del software Primer
Express es la selección de amplicones en el rango de 50 a 150 parejas base. Es
preferible utilizar amplicones pequeños porque permiten que la amplificación sea
muy eficiente.
Asimismo, los ensayos de alta eficiencia permiten realizar una cuantificación
relativa utilizando el método de CT comparativos (∆∆CT) (Livak y Schmittgen,
2001). Este método aumenta el rendimiento de las muestras al eliminar la necesidad
de utilizar curvas estándar para observar los niveles de expresión de una diana en
relación con una muestra de referencia.
Contenido de G/C
Siempre que sea posible, elija cebadores y sondas de una región que tenga un
contenido de G/C del 30 al 80%. Las regiones con un contenido de G/C >80%
podrían no desnaturalizarse bien durante el termociclado, lo que se deriva en una
reacción menos eficiente. Las secuencias ricas en G/C son susceptibles a sufrir
interacciones no específicas que pueden reducir la eficiencia de la reacción y
producir señales no específicas en ensayos en los que se utilizan reactivos SYBR
Green. Evite las secuencias de cebadores y sondas que contengan procesos de cuatro
o más bases G.
Temperatura de desnaturalización
Cuando seleccione cebadores y sondas con la temperatura de desnaturalización (Tm)
recomendada, puede utilizar condiciones de ciclos térmicos universales. Applied
Biosystems recomienda que la Tm de la sonda sea 10 °C superior a la de los
cebadores.
Extremo 5′ de sondas
El software Primer Express no selecciona sondas con una G en el extremo 5′. El
efecto apantallador de una base G en esta posición estará presente aún después de la
ruptura de la sonda, lo que puede reducir los valores de la fluorescencia (∆Rn) e
influir en el rendimiento del ensayo. No se ha demostrado que, el hecho de tener
bases G en posiciones próximas al extremo 5′, pero no en él, afecte al rendimiento de
los ensayos.
3-24
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Capítulo 3 Experimentos de cuantificación
Extremo 3′ de cebadores
Para reducir la posibilidad de que se formen productos no específicos, asegúrese de
que las últimas cinco bases del extremo 3′ de los cebadores no contenga más de dos
bases C y/o G. En determinadas circunstancias (por ejemplo, en una secuencia de
molde rica en G/C), podría ser necesario saltarse esta recomendación para mantener
el amplicón a una longitud inferior a 150 pares base. En general, evite que los
extremos 3′ de los cebadores sean muy ricos en bases G y/o C.
Resumen de las
directrices de
diseño de
cebadores y
sondas MGB
Directrices de sondas
Directrices de cebadores
Primero, seleccione la sonda y, a continuación, diseñe los cebadores de la manera más
parecida posible a la sonda sin superponerse a la sonda (se recomiendan
encarecidamente amplicones de 50 a 150 pares base).
Mantenga el contenido de G/C en un rango del 30 al 80%.
Evite repeticiones de un nucleótido idéntico, especialmente de guanina, en los que se
deberían evitar repeticiones de cuatro o más G.
Si se utiliza el software Primer Express®, la
Tm debería ser de 68 a 70 °C.
Si se utiliza el software Primer Express®, la
Tm debería ser de 58 a 60 °C.
Sin G en el extremo 5′.
Los cinco nucleótidos del extremo 3′ no
deberían tener más de 2 bases G y/o C.
Las sondas TaqMan MGB® deberían ser lo
más cortas posible, sin llegar a tener
menos de 13 nucleótidos.
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
3-25
Capítulo 3 Experimentos de cuantificación
Selección de reactivos
Hay disponibles muchos reactivos TaqMan y SYBR Green para los experimentos de
cuantificación. Los reactivos que se utilicen dependen de la diana:
• DNA o cDNA (más abajo).
• RNA con RT-PCR de 1 paso (página 3-27).
• RNA con RT-PCR de 2 pasos (página 3-27).
Nota: Si utiliza reactivos SYBR Green, Applied Biosystems recomienda
encarecidamente los reactivos Power SYBR Green.
Cuantificación de
DNA o cDNA
Reactivo
Reactivos
TaqMan®
Kit
Número de
referencia
TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2✕), No
AmpErase® UNG, 250 reacciones
4352042
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix, 200
reacciones
4304437
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix, 2000
reacciones
4326708
Pack de 10, TaqMan® 2✕ Universal PCR Master
Mix
4305719
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix, No
AmpErase® UNG, 200 reacciones
4324018
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix, No
AmpErase® UNG, 2000 reacciones
4326614
Pack de 10, TaqMan® 2✕ Universal PCR Master
Mix, No AmpErase® UNG
4324020
TaqMan® PCR Core Reagents Kit, 200 reacciones
Reactivos SYBR®
Green
3-26
N808-0228
Power SYBR® Green PCR Master Mix (1 mL),
40 reacciones
4368577
Power SYBR® Green PCR Master Mix (5-mL),
200 reacciones
4367659
Power SYBR® Green PCR Master Mix
(10 × 5-mL), 2000 reacciones
4368708
Power SYBR® Green PCR Master Mix (50 mL),
2000 reacciones
4367660
SYBR® Green PCR Master Mix (1-mL),
40 reacciones
4344463
SYBR® Green PCR Master Mix (5-mL),
200 reacciones
4309155
SYBR® Green PCR Master Mix (50-mL),
2000 reacciones
4334973
SYBR® Green PCR Core Reagents, 200
reacciones
4304886
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Capítulo 3 Experimentos de cuantificación
Cuantificación de
RNA con RT-PCR
en 1 paso
Kit
Número de
referencia
TaqMan® One-Step RT-PCR Master Mix Reagents
Kit
4309169
Reactivo
Reactivos
TaqMan®
TaqMan® EZ RT-PCR Core Reagents
N808-0236
®
Nota: Utilice TaqMan EZ RT-PCR Core
Reagents cuando se necesite un paso de RT a
alta temperatura.
Reactivos SYBR®
Green
Cuantificación de
RNA con RT-PCR
en 2 pasos
Reactivo
Reactivos
TaqMan®
Power SYBR® Green RT-PCR Reagents Kit
4368711
SYBR® Green RT-PCR Reagents
4310179
Kit
Número de
referencia
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master
Mix
4304437
TaqMan® Fast Universal PCR Master
Mix (2✕), No AmpErase® UNG
4352042
High-Capacity cDNA Reverse
Transcription Kit
4374966
TaqMan® Reverse Transcription
Reagents
N808-234
Pasos RT y
PCR
Kit TaqMan® Gold RT PCR
N808-232
Sólo paso de
PCR
Power SYBR® Green PCR Master
Mix
4367659
SYBR® Green PCR Master Mix
4309155
High-Capacity cDNA Reverse
Transcription Kit
4374966
TaqMan® Reverse Transcription
Reagents
N808-234
Power SYBR® Green RT-PCR
Reagents Kit
4368711
SYBR® Green RT-PCR Reagents
4310179
Paso
Sólo paso de
PCR
Sólo paso de
RT
Reactivos
SYBR® Green
Sólo paso de
RT
Pasos RT y
PCR
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
3-27
Capítulo 3 Experimentos de cuantificación
Acerca de
AmpliTaq Gold
DNA Polymerase
El uso de la enzima activada por calor AmpliTaq Gold® DNA Polymerase es una
parte integral de las directrices de diseño de ensayos de Applied Biosystems para
reactivos TaqMan y SYBR Green. AmpliTaq Gold DNA Polymerase garantiza una
reacción robusta y puede reducir enormemente la cantidad de formación de
productos no específicos. Otro beneficio adicional es que simplifica la configuración
del ensayo, el cual se puede realizar a temperatura ambiental.
Nota: La polimerasa de DNA que se incluye en TaqMan Fast Universal PCR Master
Mix (2✕), No AmpErase UNG es activada por calor de modo muy rápido. El
rendimiento es similar al de AmpliTaq Gold DNA Polymerase.
Acerca de
MultiScribe
Reverse
Transcriptase
MultiScribe™ Reverse Transcriptase es una transcriptasa reversa del virus de la
leucemia murina de Moloney (MuLV) recombinante que realiza la transcripción
reversa del RNA en DNA complementario (cDNA).
Uso de las condiciones de termociclado recomendadas
Utilice las condiciones del termociclado que se recomiendan para la muestra:
• DNA o cDNA (más abajo).
• RNA con RT-PCR de 1 paso (página 3-29).
• RNA con RT-PCR de 2 pasos (página 3-30).
Nota: Las condiciones del termociclado de los reactivos rápidos son diferentes a las
condiciones del termociclado de los reactivos estándar.
3-28
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Capítulo 3 Experimentos de cuantificación
Cuantificación de
DNA o cDNA
Para TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2✕), No AmpErase UNG, utilice
estas condiciones:
Tiempos y temperaturas
Pasos iniciales
PCR (40 ciclos)
Activación de
AmpErase® UNG ‡
Activación
HOLD (en espera)
HOLD (en espera)
2 min a 50 °C
20 seg a 95 °C
Hibridación/
extensión
Desnaturalización
CICLADO
3 seg a 95 °C
30 seg a 60 °C
‡ Sólo es necesario si se añade AmpErase® UNG a las reacciones.
Para TaqMan 2✕ Universal PCR Master Mix y Power SYBR Green PCR Master
Mix, utilice estas condiciones:
Tiempos y temperaturas
Pasos iniciales
PCR (40 ciclos)
Activación de
AmpErase® UNG ‡
Activación de
AmpliTaq Gold®
DNA Polymerase
HOLD (en espera)
HOLD (en espera)
2 min a 50 °C
10 min a 95 °C
Hibridación/
extensión
Desnaturalización
CICLADO
15 seg a 95 °C
1 min a 60 °C
‡ Sólo necesario si se añade AmpErase® UNG a las reacciones o está incluida en la mezcla
de reacción.
Cuantificación de
RNA con RT-PCR
de 1 paso
Para TaqMan One-Step RT-PCR Master Mix Reagents Kit o Power SYBR Green
RT-PCR Reagents Kit, utilice estas condiciones:
Tiempos y temperaturas
Pasos iniciales
Transcripción
reversa
Activación de
AmpliTaq Gold®
DNA Polymerase
HOLD (en espera)
HOLD (en espera)
30 min a 48 °C
10 min a 95 °C
PCR (40 ciclos)
Desnaturalización
Hibridación/
extensión
40 CICLOS
15 seg a 95 °C
1 min a 60 °C
Nota: Estas condiciones no se aplican a TaqMan EZ RT-PCR Kit. Consulte
TaqMan® EZ RT-PCR Kit Protocol para conocer las condiciones adecuadas.
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
3-29
Capítulo 3 Experimentos de cuantificación
Cuantificación de
RNA con RT-PCR
de 2 pasos
Para High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit, utilice estas condiciones:
Paso
1. Paso de RT
Tiempos y temperaturas
Paso 1
Paso 2
HOLD (en espera)
HOLD (en espera)
10 min a 25 °C
120 min a 37 °C
Después de realizar la transcripción reversa del RNA en cDNA (paso de RT), se pueden
guardar muestras o se pueden utilizar para el siguiente paso de la PCR que se describe a
continuación.
¡IMPORTANTE! Para la mayoría de las aplicaciones y cuando se necesitan grandes
cantidades de cDNA, Applied Biosystems recomienda 120 minutos a 37 °C para que
la transcripción reversa logre la conversión óptima.
Para TaqMan 2✕ Universal PCR Master Mix (con AmpErase UNG) o Power SYBR
Green PCR Master Mix, utilice estas condiciones:
Paso
Tiempos y temperaturas
Pasos iniciales
2. Paso de
PCR
Activación de
AmpErase®
UNG
Activación de
AmpliTaq
Gold® DNA
Polymerase
HOLD (en
espera)
HOLD (en
espera)
2 min a 50 °C
10 min a 95 °C
PCR (40 ciclos)
Desnaturalización
Hibridación/
extensión
CICLADO
15 seg a 95 °C
1 min a 60 °C
Para TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2✕), No AmpErase UNG, utilice
estas condiciones:
Paso
Tiempos y temperaturas
Pasos iniciales
2. Paso de
PCR
Activación de
AmpErase®
UNG ‡
Activación de
AmpliTaq
Gold® DNA
Polymerase
HOLD (en
espera)
HOLD (en
espera)
2 min a 50 °C
20 seg a 95 °C
PCR (40 ciclos)
Desnaturalización
Hibridación/
extensión
CICLADO
3 seg a 95 °C
30 seg a 60 °C
‡ Sólo es necesario si se añade AmpErase® UNG a las reacciones.
3-30
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Capítulo 3 Experimentos de cuantificación
Optimización de concentraciones de cebador
Al cambiar de manera independiente las concentraciones de cebador directo y
reverso, se pueden identificar las concentraciones con las que se obtiene el
rendimiento óptimo del ensayo. Los cebadores siempre tienen un gran exceso molar
durante la fase exponencial de la reacción de amplificación.
A la hora de utilizar TaqMan 2✕ Universal PCR Master Mix, Applied Biosystems
recomienda las concentraciones de cebadores que se indican en “Concentraciones de
cebador predeterminadas” más abajo. A continuación, se ofrece una explicación
detallada de:
• Matriz de optimización del cebador (más abajo)
• Reactivos TaqMan (más abajo)
• Reactivos SYBR Green (página 3-33)
Concentraciones
de cebador
predeterminadas
Las concentraciones de cebador recomendadas que se enumeran en la siguiente tabla
son para ensayos de cuantificación de DNA y cDNA.
Concentraciones (nM)
Reactivo
Cebador directo
Cebador reverso
Reactivos TaqMan®
900
900
Reactivos SYBR® Green
50
50
Matriz de
optimización de
cebadores
La matriz de optimización de cebadores le permite determinar si la concentración
mínima de cebador produce el CT mínimo y el ∆Rn máximo.
Reactivos
TaqMan
Para obtener el rendimiento óptimo en los ensayos de cuantificación en los que se
utilizan reactivos TaqMan, hay que seleccionar concentraciones de cebador que
proporcionen el CT menor y el ∆Rn mayor para una cantidad fija de molde diana.
La matriz de optimización de cebadores puede ayudarle a compensar la unión no
específica del cebador, lo que puede reducir la cantidad de cebador disponible para
unirse en su emplazamiento específico.
Nota: Aunque los valores CT son el parámetro por el cual se asignan valores
cuantitativos en los ensayos de cuantificación en tiempo real, los valores ∆Rn
también pueden ser importantes para intentar obtener la máxima sensibilidad y
reproducibilidad.
Los resultados de un experimento típico de matriz de optimización de cebadores de
reactivos TaqMan se muestran en la Figura 3-3 en la página 3-32:
• La Figura 3-3a muestra las gráficas de amplificación de todas las
combinaciones de concentraciones de cebadores en una visión lineal.
• La Figura 3-3b muestra los mismos datos en el formato de vista de logaritmos.
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
3-31
Capítulo 3 Experimentos de cuantificación
La combinación de cebador directo y reverso de 50-nM (grupo C) produce el ∆Rn
menor y el CT mayor. Todas las demás concentraciones de cebador que contienen una
concentración de 150-nM de cebador directo o reverso (grupo B) producen un ∆Rn
reducido. Todas las concentraciones de cebador que contienen al menos 300-nM de
cebador directo y reverso (grupo A) producen el ∆Rn mayor y el CT menor; como
resultado, cualquier combinación del grupo A o B proporciona un rendimiento
óptimo.
a) Visión lineal
A
}Grupo
Plot Group
A
∆Rn
}Grupo
Plot Group
B
B
C
}Grupo
Plot Group
C
Ciclo
Cycle
b) Visión algorítmica
Grupo
A A
} Plot
Group
Grupo
B B
} Plot
Group
∆Rn
Grupo
C C
} Plot
Group
Ciclo
Cycle
Figura 3-3 Resultados del experimento de optimización de cebadores en los
que se muestran gráficas de amplificación (visión lineal y algorítmica) de
combinaciones de cebadores
Clave de grupos:
A: Combinaciones que contienen al menos 300 nM de cebador directo y reverso
B: Combinaciones que contienen al menos 150 nM de cebador directo y reverso
C: Combinaciones que contienen al menos 50 nM de cebador directo y reverso
3-32
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Capítulo 3 Experimentos de cuantificación
Reactivos SYBR
Green
La optimización de las concentraciones de cebador es ligeramente más compleja en
los ensayos de cuantificación en los que se utilizan reactivos SYBR Green. Se
debería utilizar la misma matriz de optimización de cebador que para los reactivos
TaqMan; sin embargo, para los reactivos SYBR Green, se deben incluir controles
negativos. Las concentraciones de cebador que seleccione deberían producir un CT
bajo y un ∆Rn alto cuando se procesan en el molde diana, pero no deberían producir
una formación de productos no específicos con controles negativos.
Los análisis de curvas de disociación o gel pueden resultar enormemente útiles
cuando seleccione concentraciones de cebador óptimas para los ensayos de
cuantificación en los que se utilizan reactivos SYBR Green. La Figura 3-4 en la
página 3-34 muestra los resultados de una matriz de optimización de cebadores en
concentraciones de cebador directo y reverso de 900-nM:
• La Figura 3-4a muestra una fuerte amplificación de los pocillos de control
negativo, lo que indica que se está produciendo una amplificación no específica
significativa.
• La Figura 3-4b muestra que la temperatura de desnaturalización del producto
generado en ausencia de molde es menor que la temperatura de
desnaturalización del producto específico generado con molde, lo que indica
que se está produciendo una amplificación no específica importante.
Los resultados que se muestran en la Figura 3-4 son típicos de la formación de un
dímero de cebadores. Estos resultados indican que unas concentraciones menores de
cebador pueden producir mejores resultados. Asimismo, puede volver a diseñar otro
conjunto de cebadores para la diana de interés.
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
3-33
Capítulo 3 Experimentos de cuantificación
a) Gráfica de amplificación, visión lineal
Amplificación de diana
NC (amplificación no
específica)
Número de ciclo
Derivado (fluorescencia
bruta)
b) Análisis de curva de disociación
NC
(amplificación
no específica)
Diana de
amplificación
Temperatura (°C)
Figura 3-4 Datos de amplificación con reactivos SYBR® Green
(a) Gráfica de amplificación (visión lineal) que demuestra una amplificación no
específica sospechosa en los pocillos de control negativo (NC).
(b) Análisis de curva de disociación que confirma que el producto de los pocillos
NC tiene una temperatura de desnaturalización diferente a la del producto
específico.
3-34
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Capítulo 3 Experimentos de cuantificación
Optimización de la concentración de sonda
Para la detección por medio de sondas TaqMan®, la concentración de sonda
recomendada de 250 nM garantiza un rendimiento excelente del ensayo. Sin
embargo, dependiendo de los requisitos del ensayo, podría resultar útil realizar un
experimento de optimización de sondas.
Nota: No se requiere ninguna sonda para la detección del fluorocromo SYBR Green I.
Concentraciones
de sonda
recomendadas
Las concentraciones de sonda recomendadas para los ensayos de cuantificación de
DNA y cDNA en los que se utilizan reactivos TaqMan es de 250 nM. La Figura 3-5
muestra los resultados de un experimento de optimización de sondas en donde la
concentración de sonda se cambia de 50 a 250 nM:
• La Figura 3-5a muestra un aumento de ∆Rn a medida que se aumenta la
concentración de sonda.
• La Figura 3-5b muestra que el valor CT cambia con la concentración de sonda
suficiente.
Para garantizar la mejor reproducibilidad, especialmente si se desean detectar pocas
copias de una diana, evite concentraciones de sonda limitantes. Realice el ensayo con
una concentración de sonda de 250 nM. Con una concentración de 250-nM, se evita
la limitación de sonda y se garantizan valores de ∆Rn altos. Los valores de ∆Rn altos
indican que el ensayo es robusto y se está realizando con una gran eficiencia, lo que
se deriva en una buena producción de producto y permite medir con precisión los
picos.
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
3-35
Capítulo 3 Experimentos de cuantificación
a) Visión lineal
Sonda
250 nM
250 nMde
Probe
∆Rn
150 nMde
Probe
Sonda
150 nM
100 nMde
Probe
Sonda
100 nM
Sonda
de 50 nM
50 nM Probe
Número
Cyclede ciclos
b) Visión algorítmica
∆Rn
250
nMde
Probe
Sonda
250 nM
150
nMde
Probe
Sonda
150 nM
100
nMde
Probe
Sonda
100 nM
50
nM
Probe
Sonda de 50 nM
Número
de ciclos
Cycle
Figura 3-5 Gráfica de amplificación (visiones lineal y algorítmica) con
concentraciones de sonda de 50 a 250 nM
3-36
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Capítulo 3 Experimentos de cuantificación
Para obtener más información
Para obtener más información acerca de:
• El uso de reactivos TaqMan, consulte:
– TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2✕) Protocol
– TaqMan® Universal PCR Master Mix Protocol
• El uso de reactivos SYBR Green, consulte:
– Power SYBR® Green PCR Master Mix and RT-PCR Protocol
– SYBR® Green PCR Master Mix and RT-PCR Reagents Protocol
– SYBR® Green PCR and RT-PCR Reagents Protocol
• La realización de experimentos de cuantificación en el sistema StepOne,
consulte:
– Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR
System para experimentos de curva estándar
– Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR
System para experimentos de cuantificación relativa
• La realización de experimentos de presencia/ausencia en el sistema StepOne,
consulte Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Getting Started
Guide for Presence/Absence Experiments.
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
3-37
Capítulo 3 Experimentos de cuantificación
3-38
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Experimentos de genotipado
4
4
Este capítulo cubre los siguientes temas:
Sección 4.1 Acerca de los experimentos de genotipado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-3
Sección 4.2 Directrices de diseño . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-9
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
4-1
Capítulo 4 Experimentos de genotipado
4-2
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Capítulo 4 Experimentos de genotipado
Sección 4.1 Acerca de los experimentos de
genotipado
Esta sección cubre los siguientes temas:
Introducción. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-4
Selección del tipo de ensayo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-6
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
4-3
Capítulo 4 Experimentos de genotipado
Introducción
¿Qué es un
experimento de
genotipado?
Los experimentos de genotipado son experimentos de punto final que se utilizan para
determinar el genotipo de muestras desconocidas. Con este tipo de experimento, se
puede diferenciar un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP).
Los experimentos de genotipado determinan si las muestras desconocidas son:
• Homocigotos (muestras que sólo tienen el alelo 1)
• Homocigotos (muestras que sólo tienen el alelo 2)
• Heterocigotos (muestras que tienen el alelo 1 y el alelo 2)
Componentes
Las reacciones de PCR de los experimentos de genotipado incluyen los siguientes
componentes:
• Muestra: la muestra en la que el genotipo es desconocido.
• (Opcional) Réplicas: reacciones idénticas que contienen componentes y
volúmenes idénticos.
• Controles negativos: muestras que contienen agua o tampón en lugar de molde;
también se denominan NTC (sin ácido nucleico molde). Los controles negativos
no se deberían amplificar.
• (Opcional) Controles positivos: muestras que contienen genotipos conocidos
(homocigotos para el alelo 1, homocigotos para el alelo 2 y heterocigotos para
los alelos 1 y 2).
Instrumentos
Los experimentos de genotipado requieren dos pasos: una reacción de termociclado
(amplificación de PCR) seguido por la detección del punto final de las señales
fluorescentes resultantes. La reacción de termociclado (amplificación de PCR) se
puede realizar en Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System o en un
termociclador autónomo.
Si utiliza el sistema StepOne™:
• Puede analizar la PCR, lo que resulta útil para solucionar problemas.
• Realice la lectura de la placa de punto final por separado.
Funcionamiento
de los
experimentos de
genotipado
En los experimentos de genotipado, la PCR incluye una sonda marcada con
fluorocromo específico para cada alelo. Las sondas contienen diferentes
fluorocromos notificadores para diferenciar cada alelo.
En el sistema StepOne, se pueden utilizar sondas de ligando de unión al surco menor
(MGB) TaqMan®. Cada sonda TaqMan MGB® contiene:
• Un fluorocromo notificador en el extremo 5′ de cada sonda
– Fluorocromo VIC® que está unido al extremo 5′ de la sonda del alelo 1
– Fluorocromo FAM™ que está unido al extremo 5′ de la sonda del alelo 2
4-4
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Capítulo 4 Experimentos de genotipado
• Un ligando de unión al surco menor (MGB)
Esta modificación aumenta la temperatura de desnaturalización (Tm) de las
sondas sin aumentar la longitud de la sonda (Afonina et al., 1997; Kutyavin
et al., 1997), por lo que permite diseñar sondas más cortas. Por consiguiente, las
sondas TaqMan MGB tienen mayores diferencias en los valores de Tm entre
sondas complementarias y no perfectamente complementarias con la diana.
Estas mayores diferencias en los valores de Tm permiten realizar el genotipado
con precisión.
• Un apantallador no fluorescente (NFQ) en el extremo 3′ de la sonda
Dado que el apantallador no emite fluorescencia, los sistemas de PCR en tiempo
real pueden medir con más precisión las contribuciones del fluorocromo
notificador.
Durante la PCR, cada sonda se hibrida de manera específica para su secuencia
complementaria situada entre el cebador directo y reverso. AmpliTaq Gold ® DNA
Polymerase sólo puede romper sondas que se hibridan con la secuencia del alelo
(complementariedad). De esta forma, el fluorocromo notificador se separa del
fluorocromo del apantallador, lo que aumenta la fluorescencia del fluorocromo
notificador. Por eso, las señales de fluorescencia generadas durante la reacción de
amplificación indican qué alelos hay en la muestra.
Faltas de complementariedad entre la sonda y las secuencias de alelos
La falta de complementariedad entre una sonda y un alelo (Figura 4-1) reduce la
eficiencia de la hibridación de la sonda. Asimismo, es probable que AmpliTaq Gold
DNA Polymerase desplace a la sonda no complementaria en lugar de romperla para
liberar el fluorocromo notificador.
Alelo
1
F
V
Q
Complementariedad
Alelo
2
Leyenda
Q
No complementariedad
V
Fluorocromo
VIC
F
Fluorocromo
FAM
Q
Apantallador
V
F
Q
Q
Complementariedad
No complementariedad
AmpliTaq
Gold DNA
Polymerase
GR1556
Figura 4-1 Resultados de complementariedad y no complementariedad entre
secuencias de alelos y sondas en los experimentos de genotipado
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
4-5
Capítulo 4 Experimentos de genotipado
La Tabla 4-1 resume los posibles resultados del experimento de genotipado de
ejemplo que se ha mostrado anteriormente.
Tabla 4-1
Resultados del experimento de genotipado
Aumento sustancial de…
Flujo de trabajo
Indica…
sólo fluorescencia del fluorocromo VIC®
homocigosidad del alelo 1.
sólo fluorescencia del fluorocromo FAM™
homocigosidad del alelo 2.
ambas señales fluorescentes
heterocigosidad.
Antes de realizar experimentos de genotipado en el sistema StepOne, prepare el
experimento de la siguiente forma:
1. Seleccione el tipo de ensayo (más abajo).
2. Revise las directrices de diseño del tipo de ensayo que ha seleccionado
(Sección 4.2 en la página 4-9).
Selección del tipo de ensayo
Para diseñar experimentos con el software StepOne, puede seleccionar los siguientes
tipos de ensayos para los experimentos de genotipado:
• Prediseñados/validados (más abajo)
• Personalizados (página 4-7)
En esta sección, se enumeran los productos disponibles para cada tipo de ensayo.
Nota: Los ensayos son específicos de la diana de interés. Las mezclas de reacción
contienen los demás componentes que son necesarios para la reacción de PCR.
Nota: Los reactivos rápidos TaqMan® y los reactivos SYBR® Green no se admiten
en los experimentos de genotipado.
4-6
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Capítulo 4 Experimentos de genotipado
Ensayos
prediseñados/
validados
Producto
Atributos
TaqMan® SNP
Genotyping Assays
• Ensayos prediseñados para una alta densidad elevada de
avisos a lo largo de todo el genoma
• Para estudios de cribado, asociación, región candidata,
gen candidato y refinamiento.
• Cómodo formato de un solo tubo.
TaqMan® Drug
Metabolism Genotyping
Assays
• Detecta polimorfismos en 220 genes que codifican
diversas enzimas del metabolismo de fármacos y
transportadores de fármacos.
• Para estudiar polimorfismos de un solo nucleótido (SNP),
inserciones/eliminaciones (in/dels) y polimorfismos de
varios nucleótidos (MNP).
Pre-Developed TaqMan®
Assay Reagents for
Allelic Discrimination
• Genotipado de muestras de DNA purificado para
mutaciones específicas; la mayoría de los ensayos
discriminan entre dos alelos de polimorfismos de un solo
nucleótido (SNP).
• Se añade un ligando de unión al surco menor (MGB) para
que el genotipado sea mejor.
• Se ha incluido DNA de control de los alelos 1 y 2 para
poder generar cada señal de homocigoto en cada
proceso.
• El sistema de tubos cerrados no requiere ninguna
manipulación posterior a la PCR ni geles.
TaqMan® 2✕ Universal
PCR Master Mix (con o
sin AmpErase® UNG)
• Proporciona un rendimiento óptimo para los ensayos
TaqMan® que utilizan cDNA o DNA como molde.
• Contiene componentes que garantizan un rendimiento
excelente del ensayo.
• El uso de un reactivo para todos los ensayos simplifica el
proceso de implementación de los ensayos.
Para conocer las directrices de diseño de experimentos con ensayos
prediseñados/validados, consulte la página 4-10.
Ensayos
personalizados
Producto
Atributos
Custom TaqMan® SNP
Genotyping Assays
• Cualquier polimorfismo de un solo nucleótido (SNP)
posible en cualquier organismo.
• Detecta inserciones/eliminaciones (in/dels) de hasta seis
bases.
• Detecta polimorfismos de varios nucleótidos (MNP) de
hasta seis bases.
• Cómodo formato de un solo tubo.
TaqMan® 2✕ Universal
PCR Master Mix (con o
sin AmpErase® UNG)
• Proporciona un rendimiento óptimo para los ensayos
TaqMan® que utilizan cDNA o DNA como molde.
• Contiene componentes que garantizan un rendimiento
excelente del ensayo.
• El uso de un reactivo para todos los ensayos simplifica el
proceso de implementación de los ensayos.
Para conocer las directrices de diseño de experimentos con ensayos personalizados,
consulte la página 4-15.
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
4-7
Capítulo 4 Experimentos de genotipado
4-8
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Capítulo 4 Experimentos de genotipado
Sección 4.2 Directrices de diseño
Esta sección cubre los siguientes temas:
Ensayos prediseñados/validados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-10
TaqMan® SNP Genotyping Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-10
TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-11
Pre-Developed TaqMan® Assay Reagents for Allelic Discrimination . . . . 4-12
Selección de la mezcla de reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-13
Diseño del experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-14
Ensayos personalizados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-15
Custom TaqMan® SNP Genotyping Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-15
Selección de la mezcla de reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-17
Diseño del experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-17
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
4-9
Capítulo 4 Experimentos de genotipado
Ensayos prediseñados/validados
Flujo de trabajo
Si va a diseñar un experimento de genotipado utilizando ensayos
prediseñados/validados de Applied Biosystems, Applied Biosystems recomienda
seguir el flujo de trabajo que se indica a continuación:
1. Seleccione el ensayo:
• TaqMan® SNP Genotyping Assays (más abajo).
• TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assays (página 4-11).
• TaqMan® Pre-Developed Assays Reagents for Allelic Discrimination
(página 4-12).
2. Seleccione la mezcla de reacción (página 4-13).
3. Diseñe el experimento utilizando el software StepOne™ (página 4-14).
TaqMan® SNP Genotyping Assays
Descripción del
producto
TaqMan® SNP Genotyping Assays son una colección completa de conjuntos de
cebadores y sondas para realizar el genotipado de polimorfismos de un solo
nucleótido (SNP) en estudios de humanos.
Los ensayos emplean reactivos TaqMan® para amplificar y detectar alelos de SNP
específicos en muestras de DNA genómico purificado. Todos los ensayos se han
diseñado con software y procesos bioinformáticos de Applied Biosystems, así como
con información genómica de Celera Genomics y bases de datos públicas.
Propiedades del
producto
4-10
Todos los TaqMan SNP Genotyping Assays:
• Requieren tres componentes:
– 1 a 20 ng de muestra de DNA genómico purificado
– 20✕, 40✕, o 80 de✕ SNP Genotyping Assay Mix (específica para cada
polimorfismo). Cada ensayo consta de cebadores reversos o directos
específicos de la secuencia para amplificar el SNP de interés y dos sondas
TaqMan MGB: Una sonda marcada con fluorocromo VIC® detecta la
secuencia del alelo 1 y una sonda marcada con el fluorocromo FAM™ detecta
la secuencia del alelo 2.
– TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix (con o sin AmpErase® UNG)
• Están diseñadas y optimizadas para funcionar con TaqMan 2✕ Universal PCR
Master Mix (con o sin AmpErase UNG), utilizando condiciones de
termociclado universales.
• Para obtener resultados, se necesita la reacción de amplificación y una lectura
de punto final.
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Capítulo 4 Experimentos de genotipado
Ensayos
disponibles
Existen dos categorías de TaqMan SNP Genotyping Assays:
Categoría
Para obtener más
información
Descripción
TaqMan® Validated &
Coding SNP Genotyping
Assays
• Aproximadamente 5000 ensayos de SNP a pequeña
escala, de los cuales, unos 2000 son ensayos de SNP
codificantes.
• En inventario (es decir, se guardan en inventario para
poderlos adquirir ya preparados).
TaqMan® Pre-Designed
SNP Genotyping Assays
• Más de 4,5 millones de ensayos SNP prediseñados,
incluidos 3,5 millones de ensayos HapMap y unos 68.000
ensayos de SNP codificantes.
• Disponibles a pequeña, media y larga escala.
• Fabricados bajo pedido (es decir, fabricados en el
momento de realizar el pedido).
• Para obtener más información acerca de los últimos productos disponibles y los
usos específicos de los productos, consulte el sitio web de Applied Biosystems:
http://www.appliedbiosystems.com/
a. En la página de inicio, bajo TaqMan® Products (Productos TaqMan),
seleccione TaqMan® SNP Genotyping Assays.
b. En la página SNP Genotyping Assays (Ensayos de genotipado SNP), bajo
Pre-Designed/Validated Assays (Ensayos prediseñados/validados),
seleccione TaqMan® SNP Genotyping Assays.
• Para obtener información acerca de la preparación de reacciones de PCR con
TaqMan SNP Genotyping Assays, consulte TaqMan® SNP Genotyping Assays
Protocol.
TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assays
Descripción del
producto
TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assays son una colección completa de
conjuntos de cebadores y sondas en inventario para el genotipado de SNP,
inserciones y eliminaciones (in/dels) y polimorfismos de varios nucleótidos (MNP)
en genes relacionados con el metabolismo de fármacos.
Los ensayos emplean reactivos TaqMan para amplificar y detectar polimorfismos
específicos en muestras de DNA genómico purificado. Todos los ensayos se han
diseñado con software y procesos bioinformáticos de Applied Biosystems, así como
con información genómica de bases de datos de SNP públicas y ensamblajes de
genomas públicos.
Propiedades del
producto
Todos los TaqMan Drug Metabolism Genotyping Assays:
• Requieren tres componentes:
– 3 a 30 ng de muestra de DNA genómico purificado
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
4-11
Capítulo 4 Experimentos de genotipado
– 20✕ de Drug Metabolism Genotyping Assay Mix (específico para cada
polimorfismo). Cada ensayo consta de cebadores reversos o directos
específicos de la secuencia para amplificar la secuencia polimórfica de
interés y dos sondas TaqMan MGB: Una sonda marcada con fluorocromo
VIC detecta la secuencia del alelo 1 y una sonda marcada con el fluorocromo
FAM detecta la secuencia del alelo 2.
– TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix (con o sin AmpErase® UNG)
• Están diseñadas y optimizadas para funcionar con TaqMan 2✕ Universal PCR
Master Mix (con o sin AmpErase UNG), utilizando condiciones de
termociclado universales.
• Para obtener resultados, se necesita la reacción de amplificación y una lectura
de punto final.
Para obtener más
información
• Para obtener más información acerca de los últimos productos disponibles y los
usos específicos de los productos, consulte el sitio web de Applied Biosystems:
http://www.appliedbiosystems.com/
a. En la página de inicio, bajo TaqMan® Products (Productos TaqMan),
seleccione TaqMan® SNP Genotyping Assays.
b. En la página SNP Genotyping Assays (Ensayos de genotipado SNP), bajo
Pre-Designed/Validated Assays (Ensayos prediseñados/validados),
seleccione TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assays.
• Para obtener información acerca de la preparación de reacciones de PCR con
TaqMan SNP Genotyping Assays, consulte TaqMan® Drug Metabolism
Genotyping Assays Protocol.
Pre-Developed TaqMan® Assay Reagents for Allelic Discrimination
Descripción del
producto
Propiedades del
producto
Pre-Developed TaqMan® Assay Reagents for Allelic Discrimination (TaqMan®
PDARs for AD) son ensayos en inventario optimizados para la discriminación alélica
específica.
TaqMan PDARs for AD requieren tres componentes:
• 2 a 20 ng de muestra de DNA genómico purificado.
• 10✕ de Allelic Discrimination Assay Mix (específica para cada polimorfismo).
Cada ensayo consta de cebadores reversos o directos específicos de la secuencia
para amplificar la secuencia polimórfica de interés y dos sondas TaqMan MGB:
Una sonda marcada con fluorocromo VIC detecta la secuencia del alelo 1 y una
sonda marcada con el fluorocromo FAM detecta la secuencia del alelo 2.
• TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix (con AmpErase® UNG).
Nota: Se ha incluido DNA de control de los alelos 1 y 2 con cada ensayo para poder
generar cada señal de homocigoto en cada proceso.
4-12
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Capítulo 4 Experimentos de genotipado
Para obtener más
información
• Para obtener más información acerca de los últimos productos disponibles y los
usos específicos de los productos, consulte el sitio web de Applied Biosystems:
http://www.appliedbiosystems.com/
a. En la página de inicio, bajo TaqMan® Products (Productos TaqMan),
seleccione TaqMan® SNP Genotyping Assays.
b. En la página SNP Genotyping Assays (Ensayos de genotipado SNP), bajo
Pre-Designed/Validated Assays (Ensayos prediseñados/validados),
seleccione TaqMan® Pre-Developed Assay Reagents for Allelic
Discrimination (TaqMan® PDARs for AD).
• Para obtener información acerca de la preparación de reacciones de PCR
utilizando TaqMan PDARs for Allelic Discrimination, consulte Pre-Developed
TaqMan® Assay Reagents Allelic Discrimination Protocol.
Selección de la mezcla de reacción
Mezclas de
reacción
disponibles
Los ensayos prediseñados/validados de Applied Biosystems para experimentos de
genotipado están diseñados para las siguientes mezclas de reacción TaqMan®:
• TaqMan PDARs for AD contienen TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix
(con AmpErase® UNG).
• Se pueden utilizar TaqMan SNP Genotyping Assays y Custom TaqMan SNP
Genotyping Assays con:
Mezcla de reacción
Número de
referencia
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix, 200 reacciones
4304437
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix, 2000 reacciones
4326708
Pack de 10, TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix
4305719
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix, No AmpErase®
UNG, 200 reacciones
4324018
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix, No AmpErase®
UNG, 2000 reacciones
4326614
Pack de 10, TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix, No
AmpErase® UNG
4324020
Nota: No se pueden realizar experimentos de genotipado con TaqMan® Fast
Universal PCR Master Mix.
Para obtener más
información
Para obtener información acerca del uso de mezclas de reacción TaqMan, consulte
TaqMan® Universal PCR Master Mix Protocol.
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
4-13
Capítulo 4 Experimentos de genotipado
Diseño del experimento
Uso del software
StepOne
Para los ensayos prediseñados/validados de Applied Biosystems, utilice el software
StepOne para diseñar sus experimentos de genotipado. El software StepOne calcula
automáticamente volúmenes para:
• Componentes de la mezcla de la reacción
• Diluciones de muestras
Nota: Cuando seleccione un ensayo de SNP en el software StepOne, vaya a la
pantalla SNP Assays (Ensayos de SNP) del flujo de trabajo del asistente de diseño o
a la pantalla Plate Setup (Configuración de placa) del flujo de trabajo Advanced
Setup (Configuración avanzada). En la pantalla SNP Assays (Ensayos de SNP) o
Plate Setup (Configuración de placa), se puede seleccionar un ensayo en la biblioteca
o crear uno nuevo.
Para obtener más
información
4-14
Para obtener información acerca del diseño y la realización de experimentos de
genotipado en el sistema StepOne, consulte la Guía de introducción de Applied
Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de genotipado.
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Capítulo 4 Experimentos de genotipado
Ensayos personalizados
Flujo de trabajo
Si va a diseñar un experimento de genotipado utilizando ensayos personalizados de
Applied Biosystems, Applied Biosystems recomienda seguir el flujo de trabajo que
se indica a continuación:
1. Solicite el ensayo: Custom TaqMan® SNP Genotyping Assays (más abajo).
2. Seleccione la mezcla de reacción (página 4-17).
3. Diseñe el experimento utilizando el software StepOne (página 4-17).
Custom TaqMan® SNP Genotyping Assays
Descripción del
producto
Custom TaqMan® SNP Genotyping Assays son conjuntos de sondas y cebadores
TaqMan que ha diseñado, sintetizado y formulado el servicio Custom TaqMan®
Genomic Assays en función de la información de secuencia remitida. Los Custom
TaqMan SNP Genotyping Assays le permiten:
Acción
Ejemplo
Realizar estudios de genotipado con
cualquier polimorfismo de un solo
nucleótido (SNP) posible en cualquier
organismo
AGTTCATCCATGGTCA -->
AGTTCATACATGGTCA
Detectar inserciones/eliminaciones (in/dels)
de hasta seis bases para los estudios de
genotipado.
AGTTCATCCATGGTCA -->
AGTTCATGGTCA
Detectar polimorfismos de varios
nucleótidos (MNP) de hasta seis bases
para los estudios de genotipado.
AGTTCATCCGGTCA -->
AGTTCATATGGTCA
Anotado como: AGTTCAT[C/A]CATGGTCA
Anotado como: AGTTCAT[CCAT/*]GGTCA
Anotado como: AGTTCAT[CC/AT]GGTCA
Los ensayos emplean reactivos TaqMan para amplificar y detectar polimorfismos
específicos en muestras de DNA genómico purificado (gDNA). Todos los ensayos se
han desarrollado utilizando software de diseño de ensayos propio.
Propiedades del
producto
Todos los Custom TaqMan SNP Genotyping Assays:
• Requieren que se cree un archivo de envío (con el software gratuito File
Builder) con la secuencia de SNP de diana y que dicho archivo se envíe al
servicio Custom TaqMan® Genomic Assays.
• Requieren tres componentes:
– 1 a 20 ng de muestra de gDNA purificado por pocillo.
Nota: Puede utilizar muestras de cDNA, sin embargo, actualmente Applied
Biosystems no ofrece recomendaciones para utilizar cDNA con Custom
TaqMan SNP Genotyping Assays.
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
4-15
Capítulo 4 Experimentos de genotipado
– 40✕ de SNP Genotyping Assay o 80✕ de SNP Genotyping Assay
(específicos para cada polimorfismo). Cada ensayo consta de cebadores
reversos o directos específicos de la secuencia para amplificar el SNP de
interés y dos sondas TaqMan MGB: Una sonda marcada con fluorocromo
VIC detecta la secuencia del alelo 1 y una sonda marcada con el fluorocromo
FAM detecta la secuencia del alelo 2.
– TaqMan® Universal PCR Master Mix (con o sin AmpErase® UNG).
• Están diseñadas y optimizadas para funcionar con TaqMan Universal PCR
Master Mix (con o sin AmpErase UNG), utilizando condiciones de
termociclado universales.
• Para obtener resultados, se necesita la reacción de amplificación y una lectura
de punto final.
Para obtener más
información
• Para obtener más información acerca de los últimos productos disponibles y los
usos específicos de los productos, consulte el sitio web de Applied Biosystems:
http://www.appliedbiosystems.com/
a. En la página de inicio, bajo TaqMan® Products (Productos TaqMan),
seleccione TaqMan® SNP Genotyping Assays.
b. En la página SNP Genotyping Assays (Ensayos de genotipado SNP), bajo
Custom Assays (Ensayos personalizados), seleccione TaqMan® SNP
Genotyping Assays.
• Para obtener información acerca de cómo pedir Custom TaqMan SNP
Genotyping Assays, consulte Custom TaqMan® Genomic Assays Protocol:
Submission Guidelines.
• Para obtener información acerca de la preparación de reacciones de PCR con
Custom TaqMan SNP Genotyping Assays, consulte Custom TaqMan® SNP
Genotyping Assays Protocol.
4-16
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Capítulo 4 Experimentos de genotipado
Selección de la mezcla de reacción
Mezclas de
reacción
disponibles
Los ensayos fabricados bajo pedido de Applied Biosystems para experimentos de
genotipado están diseñados para las siguientes mezclas de reacción TaqMan:
Mezcla de reacción
Número de
referencia
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix, 200 reacciones
4304437
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix, 2000 reacciones
4326708
Pack de 10, TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix
4305719
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix, No AmpErase® UNG, 200
reacciones
4324018
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix, No AmpErase® UNG, 2000
reacciones
4326614
Pack de 10, TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix, No AmpErase®
UNG
4324020
Nota: No se pueden realizar experimentos de genotipado con TaqMan® Fast
Universal PCR Master Mix.
Para obtener más
información
Para obtener información acerca del uso de mezclas de reacción TaqMan, consulte
TaqMan® Universal PCR Master Mix Protocol.
Diseño del experimento
Uso del software
StepOne
Para los ensayos personalizados de Applied Biosystems, utilice el software StepOne
para diseñar los experimentos de genotipado. El software StepOne calcula
automáticamente volúmenes para:
• Componentes de la mezcla de la reacción
• Diluciones de muestras
Nota: Cuando seleccione un ensayo de SNP en el software StepOne, vaya a la
pantalla SNP Assays (Ensayos de SNP) del flujo de trabajo del asistente de diseño o
a la pantalla Plate Setup (Configuración de placa) del flujo de trabajo Advanced
Setup (Configuración avanzada). En la pantalla SNP Assays (Ensayos de SNP) o
Plate Setup (Configuración de placa), se puede seleccionar un ensayo en la biblioteca
o crear uno nuevo.
Para obtener más
información
Para obtener información acerca del diseño y la realización de experimentos de
genotipado en el sistema StepOne, consulte la Guía de introducción de Applied
Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de genotipado.
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
4-17
Capítulo 4 Experimentos de genotipado
4-18
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Experimentos de presencia/ausencia5
5
Este capítulo cubre los siguientes temas:
Sección 5.1 Acerca de los experimentos de presencia/ausencia . . . . . . . . . . . . . . . 5-3
Sección 5.2 Directrices de diseño . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-9
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
5-1
Capítulo 5 Experimentos de presencia/ausencia
5-2
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Capítulo 5 Experimentos de presencia/ausencia
Sección 5.1 Acerca de los experimentos de
presencia/ausencia
Esta sección cubre los siguientes temas:
Introducción. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-4
Selección del tipo de ensayo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-6
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
5-3
Capítulo 5 Experimentos de presencia/ausencia
Introducción
¿Qué es
un experimento
de presencia/
ausencia?
Un experimento de presencia/ausencia es un experimento de punto final que indica la
presencia o la ausencia de una secuencia de ácido nucléico específica (diana) en una
muestra. No se determina la cantidad real de diana.
Los experimentos de presencia/ausencia se suelen utilizar para detectar la presencia o
la ausencia de un patógeno (por ejemplo, un patógeno vírico o bacteriano). Por
ejemplo, un experimento de presencia/ausencia puede servir para determinar si la
bacteria Salmonella está presente en la carne de una hamburguesa. Los resultados
muestran si la bacteria Salmonella está presente o no; no se determina la cantidad de
bacterias.
Componentes
Las reacciones de PCR de los experimentos de presencia/ausencia incluyen los
siguientes componentes:
• Muestra: la muestra en la que la presencia de una diana es desconocida.
• Réplicas: reacciones idénticas que contienen componentes y volúmenes
idénticos.
• Control positivo interno (IPC): molde de DNA sintético corto que se añade a
las reacciones de PCR. Se puede utilizar el IPC para distinguir los resultados
falsos negativos en las reacciones afectadas por los apantalladores de PCR, una
configuración incorrecta del ensayo o un fallo del reactivo o del instrumento.
• Pocillos de control negativo-IPC bloqueado: pocillos que contienen un
inhibidor de IPC en lugar de muestra en la reacción de PCR. No se debería
producir ninguna amplificación en los pocillos de control negativo-IPC
bloqueado, porque la reacción no contiene ninguna muestra y la amplificación
del IPC está bloqueada.
• Pocillos de control negativo-IPC: pocillos que contienen un molde de IPC y
tampón o agua en lugar de muestra en la reacción de PCR. El molde de IPC es
lo único que se debería amplificar en los pocillos de control negativo- IPC,
porque la reacción no contiene ninguna muestra.
Nota: Los experimentos de presencia/ausencia se pueden realizar sin IPC; sin
embargo, el IPC garantiza que una PCR fallida no se tome por error por un resultado
negativo en la prueba.
Detección del
punto final y
lectura de placas
posterior a la
PCR
5-4
Los experimentos de presencia/ausencia son experimentos de punto final, en los que
se recogen datos de fluorescencia después de completarse la PCR.
Para ayudar a solucionar los problemas de los experimentos de presencia/ausencia,
puede utilizar Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para realizar
una PCR en tiempo real. Si utiliza el sistema StepOne™ para la reacción de
amplificación, realice los procesos de lectura previa y posterior a la PCR por
separado.
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Capítulo 5 Experimentos de presencia/ausencia
Funcionamiento
de los
experimentos de
presencia/
ausencia
Durante la PCR, las sondas fluorogénicas se hibridan de manera específica con la
diana complementaria entre los emplazamientos de ambos iniciadores en el DNA
molde. Luego, durante la extensión, AmpliTaq Gold® DNA Polymerase separa las
sondas hibridadas de cada muestra que contiene la diana. La ruptura de cada sonda
complementaria separa el fluorocromo notificador del fluorocromo del apantallador,
lo que aumenta la fluorescencia del notificador.
Después la reacción de termociclado, el instrumento StepOne™ lee la fluorescencia
generada durante la reacción de amplificación. Las señales fluorescentes se utilizan
para determinar la presencia o la ausencia de la diana en cada muestra. Las señales
del notificador se normalizan con respecto a la emisión de una referencia pasiva, de
la siguiente manera:
Rn (TT)
=
Intensidad de emisión de secuencia de molde diana
Intensidad de emisión de referencia pasiva
Rn (IPC) =
Intensidad de emisión de control positivo interno
Intensidad de emisión de referencia pasiva
Incorporación de un IPC
Un IPC es un segundo conjunto de sondas y cebadores TaqMan® que se añade a la
placa de reacción para detectar un ácido nucléico presente constitutivamente con
bajo número de copias. El IPC y la diana se amplifican simultáneamente en el mismo
pocillo de reacción. Si un pocillo no tiene amplificación, el software StepOne™
utiliza la señal positiva del IPC para confirmar que el pocillo no se ha amplificado
por falta de un molde diana, y no por un error de pipeteo o inhibición.
Nota: Los experimentos de presencia/ausencia se pueden realizar sin IPC; sin
embargo, el IPC garantiza que una PCR fallida no se tome por error por un resultado
negativo en la prueba.
Flujo de trabajo
Antes de realizar experimentos de presencia/ausencia en el sistema StepOne, prepare
el experimento de la siguiente forma:
1. Seleccione el tipo de ensayo (más abajo).
2. Revise las directrices de diseño del tipo de ensayo que ha seleccionado
(Sección 5.2 en la página 5-9).
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
5-5
Capítulo 5 Experimentos de presencia/ausencia
Selección del tipo de ensayo
Para diseñar experimentos con el software StepOne, puede seleccionar los siguientes
tipos de ensayos para los experimentos de presencia/ausencia:
• En inventario/fabricados bajo pedido (página 5-6)
• Personalizados (página 5-7)
En esta sección, se enumeran los productos disponibles para cada tipo de ensayo.
Nota: Los ensayos son específicos de la diana de interés. Las mezclas de reacción
contienen los demás componentes que son necesarios para la reacción de PCR.
Nota: Los reactivos rápidos TaqMan® y los reactivos SYBR® Green no se admiten
en los experimentos de presencia/ausencia.
Ensayos en
inventario/fabrica
dos bajo pedido
Producto
Atributos
TaqMan® Gene
Expression Assays
• Conjuntos de sondas y cebadores prediseñados y
específicos de un gen para genes humanos, de ratones,
ratas, Arabidopsis, Drosophila, C. elegans, C. familiares
(perro) y Rhesus.
• Cómodo formato de un solo tubo disponible en ensayos
en inventario o fabricados bajo pedido.
TaqMan® Endogenous
Control Assays
• Ensayos de control endógeno optimizados, preformulados
y listos para ser usados.
• Cuantificación de expresión de genes económica para
humanos, ratones, ratas, Arabidopsis, Drosophila y
cualquier especie eurocariota.
• Posibilidad de elección de marcaje con fluorocromo FAM™
o VIC® (con cebador limitante).
Nota: Los TaqMan
Endogenous Control
Assays están incluidos en
los TaqMan Gene
Expression Assays en
inventario.
Custom TaqMan® Gene
Expression Assays
• Cualquier especie u organismo.
• Elección de la diana.
• Cómodo formato de un solo tubo.
TaqMan® 2✕ Universal
PCR Master Mix (con o
sin AmpErase® UNG)
• Proporciona un rendimiento óptimo para los ensayos
TaqMan® que utilizan cDNA o DNA como molde.
• Contiene componentes que garantizan un rendimiento
excelente del ensayo.
• El uso de un reactivo para todos los ensayos simplifica el
proceso de implementación de los ensayos.
¡IMPORTANTE! Applied Biosystems no recomienda el uso del fluorocromo
TAMRA™ como notificador o apantallador con el sistema StepOne.
Para conocer las directrices de diseño de experimentos con ensayos en inventario o
fabricados bajo pedido, consulte la página 5-10.
5-6
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Capítulo 5 Experimentos de presencia/ausencia
Ensayos
personalizados
Producto
Atributos
Sondas y cebadores
TaqMan® personalizados
• Cualquier especie u organismo.
• Posibilidad de elección de marcajes de fluorocromos,
apantalladores y escalas de síntesis.
• Para uso con el software Primer Express® y las directrices
de diseño de ensayos de Applied Biosystems.
Software Primer
Express®
Software que diseña cebadores y sondas para PCR en
tiempo real.
TaqMan® 2✕ Universal
PCR Master Mix (con o
sin AmpErase® UNG)
• Proporciona un rendimiento óptimo para los ensayos
TaqMan® que utilizan cDNA o DNA como molde.
• Contiene componentes que garantizan un rendimiento
excelente del ensayo.
• El uso de un reactivo para todos los ensayos simplifica el
proceso de implementación de los ensayos.
¡IMPORTANTE! Applied Biosystems no recomienda el uso del fluorocromo
TAMRA™ como notificador o apantallador con el sistema StepOne.
Para conocer las directrices de diseño de experimentos con ensayos personalizados,
consulte la página 5-15.
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
5-7
Capítulo 5 Experimentos de presencia/ausencia
5-8
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Capítulo 5 Experimentos de presencia/ausencia
Sección 5.2 Directrices de diseño
Esta sección cubre los siguientes temas:
Ensayos en inventario/fabricados bajo pedido. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-10
TaqMan® Gene Expression Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-10
Custom TaqMan® Gene Expression Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-12
TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents . . . . . . . . . . . . . . 5-13
Selección de la mezcla de reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-14
Diseño del experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-15
Ensayos personalizados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-15
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
5-9
Capítulo 5 Experimentos de presencia/ausencia
Ensayos en inventario/fabricados bajo pedido
Flujo de trabajo
Si se selecciona el tipo de ensayo Inventoried/Made to Order (En
inventario/fabricado bajo pedido) en el software StepOne™, Applied Biosystems
recomienda seguir el flujo de trabajo que se indica a continuación:
1. Seleccione el ensayo:
• TaqMan® Gene Expression Assays (más abajo).
• Custom TaqMan® Gene Expression Assays (página 5-12).
2. Utilice TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents (página 5-13).
Nota: Los experimentos de presencia/ausencia se pueden realizar sin IPC; sin
embargo, el IPC garantiza que una PCR fallida no se tome por error por un
resultado negativo en la prueba.
3. Seleccione la mezcla de reacción (página 5-14).
4. Diseñe el experimento utilizando el software StepOne (página 5-15).
TaqMan® Gene Expression Assays
Descripción del
producto
TaqMan® Gene Expression Assays son una colección completa de conjuntos de
sondas y cebadores en inventario y fabricados bajo pedido que sirven para realizar
experimentos de presencia/ausencia en genes humanos, de ratón, rata, Arabidopsis,
Drosophila, C. elegans, C. familiares (perro) y Rhesus.
Cada ensayo está diseñado con un procedimiento de diseño automatizado en el que
se ha controlado la calidad. Los ensayos en inventario ya están fabricados y en
inventario, mientras que los ensayos fabricados bajo pedido están prediseñados y se
fabrican cuando se realiza el pedido.
Propiedades del
producto
5-10
Todos los TaqMan Gene Expression Assays:
• Requieren tres componentes:
– 1 a 100 ng de muestra de cDNA (obtenido a partir de RNA) por pocillo,
teniendo todos los pocillos la misma cantidad de DNA.
– 20✕ de Gene Expression Assay Mix (específica para cada diana). Cada
mezcla de ensayo consta de dos cebadores de PCR no marcados y una sonda
MGB (ligando de unión al surco menor) TaqMan® marcada con fluorocromo
FAM™ en una mezcla preformulada de 20✕. Las concentraciones finales de
1✕ son de 250 nM para la sonda y de 900 nM para cada cebador.
– TaqMan® Universal PCR Master Mix (con o sin AmpErase® UNG).
• Están diseñadas y optimizadas para funcionar con TaqMan Universal PCR
Master Mix (con o sin AmpErase UNG), utilizando condiciones de
termociclado universales.
• Cuando sea posible, amplifique el cDNA diana sin amplificar el DNA
genómico (sufijo m en el identificador de ensayo) diseñando sondas diseñadas
sobre la unión exón-exón.
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Capítulo 5 Experimentos de presencia/ausencia
Ensayos
disponibles
Los TaqMan Gene Expression Assays están disponibles para los genes humanos, de
ratones, ratas, Arabidopsis, Drosophila, C. elegans, C. familiares (perros) y Rhesus.
Los números de referencia son:
• PN 4331182 para los ensayos en inventario
• PN 4351372 para los ensayos fabricados bajo pedido
El prefijo del nombre del ensayo indica la especie para la que se ha diseñado el
ensayo: Hs para Homo sapiens (humano), Mm para Mus musculus (ratón), Rn para
Rattus norvegicus (rata), At para Arabidopsis thaliana, Dm para Drosophila
melanogaster, Ce para C. elegans, Cf para C. familiares (perro) y Rh para Rhesus.
El sufijo del nombre del ensayo indica la colocación del ensayo, tal y como se
describe en la siguiente tabla.
Sufijo
Descripción
_m
La sonda del ensayo está diseñada sobre la unión de dos exones; el ensayo
no detecta DNA genómico.
_s
Los cebadores y las sondas del ensayo están diseñados en un solo exón; el
ensayo detecta DNA genómico.
_g
Los cebadores y las sondas del ensayo pueden estar en un solo exón; el
ensayo puede detectar DNA genómico.
_mH
_sH
_gH
_u
El ensayo se ha diseñado para una transcripción que pertenece a una familia
de genes con una homología de secuencias alta. El ensayo ofrece una
diferencia de entre 10 CT y 15 CT entre el gen diana y el gen con la homología
de secuencias más próxima. Por lo tanto, el ensayo detecta la transcripción
de la diana con una discriminación (sensibilidad) entre 1000 y 3000 veces
mayor que la transcripción homóloga más próxima, si está presente en el
mismo número de copias de una muestra.
El amplicón del ensayo está diseñada sobre la unión de dos exones y la
sonda se asienta por completo en uno de los exones expandidos.
TaqMan® Endogenous Control Assays
Los TaqMan® Endogenous Control Assays están incluidos en los TaqMan Gene
Expression Assays (PN 4331182) en inventario. Los TaqMan Endogenous Control
Assays:
• Están disponibles como un TaqMan Gene Expression Assay con una sonda
TaqMan MGB con marcaje con fluorocromo FAM™ en un solo tubo
preformulado de 20✕.
• Están disponibles para todas las especies de humano, ratón, y rata, con sondas
TaqMan MGB con marcaje con fluorocromo VIC® o FAM™. Los controles
endógenos TaqMan con marcajes de fluorocromo VIC tienen los cebadores
limitantes.
¡IMPORTANTE! Applied Biosystems no recomienda el uso del fluorocromo
TAMRA™ como notificador o apantallador con el sistema StepOne.
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
5-11
Capítulo 5 Experimentos de presencia/ausencia
Para obtener más
información
• Para obtener más información acerca de los últimos productos disponibles y los
usos específicos de los productos, consulte el sitio web de Applied Biosystems:
http://www.appliedbiosystems.com/
a. En la página de inicio, bajo TaqMan® Products (Productos TaqMan),
seleccione TaqMan® Gene Expression Assays.
b. En la página Gene Expression Assays & Arrays (Matrices y ensayos de
expresión de genes), bajo Individual Assays (Ensayos individuales),
seleccione TaqMan® Gene Expression Assays.
• Para obtener información acerca de Custom TaqMan Endogenous Control
Assays, consulte Using TaqMan® Endogenous Control Assays to Select an
Endogenous Control for Experimental Studies Application Note.
• Para obtener información acerca de la preparación de reacciones de PCR con
TaqMan Gene Expression Assays, consulte TaqMan® Gene Expression Assays
Protocol.
Custom TaqMan® Gene Expression Assays
Descripción del
producto
Custom TaqMan® Gene Expression Assays son conjuntos de sondas y cebadores de
TaqMan que ha diseñado, sintetizado y formulado el servicio Custom TaqMan®
Genomic Assays de acuerdo con la información de secuencia remitida. Los Custom
TaqMan Gene Expression Assays le permiten realizar experimentos de
presencia/ausencia en cualquier gen o variante de splicing de cualquier organismo.
Los ensayos emplean reactivos TaqMan para amplificar y detectar la diana en
muestras de cDNA. Todos los ensayos se han desarrollado utilizando software de
diseño de ensayos propio.
Propiedades del
producto
5-12
Todos los Custom TaqMan Gene Expression Assays:
• Requieren que se cree un archivo de envío (con el software gratuito File
Builder) con la secuencia de diana y que dicho archivo se envíe al servicio
Custom TaqMan Genomic Assays.
• Requieren tres componentes:
– 1 a 100 ng de muestra de cDNA (obtenido a partir de RNA) por pocillo,
teniendo todos los pocillos la misma cantidad de DNA.
– 20✕ de Gene Expression Assay o 60✕ de Gene Expression Assay (específico
para cada diana). Cada ensayo consta de dos cebadores específicos de la
diana y una sonda TaqMan MGB con marcaje del fluorocromo FAM™ en una
mezcla preformulada de 20✕ o 60✕. Las concentraciones finales de 1✕ son
de 250 nM para la sonda y de 900 nM para cada cebador.
– TaqMan® Universal PCR Master Mix (con o sin AmpErase® UNG).
• Están diseñadas y optimizadas para funcionar con TaqMan Universal PCR
Master Mix (con o sin AmpErase UNG), utilizando condiciones de
termociclado universales.
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Capítulo 5 Experimentos de presencia/ausencia
Para obtener más
información
• Para obtener más información acerca de los últimos productos disponibles y los
usos específicos de los productos, consulte el sitio web de Applied Biosystems:
http://www.appliedbiosystems.com/
a. En la página de inicio, bajo TaqMan® Products (Productos TaqMan),
seleccione TaqMan® Gene Expression Assays.
b. En la página Gene Expression Assays & Arrays (Matrices y ensayos de
expresión de genes), bajo Individual Assays (Ensayos individuales),
seleccione Custom TaqMan® Gene Expression Assays.
• Para obtener información acerca de cómo pedir Custom TaqMan Gene
Expression Assays, consulte Custom TaqMan® Genomic Assays Protocol:
Submission Guidelines.
• Para obtener información acerca de la preparación de reacciones de PCR con
Custom TaqMan Gene Expression Assays, consulte Custom TaqMan® Gene
Expression Assays Protocol.
TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents
Descripción del
producto
Los Applied Biosystems TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents
contienen:
• Un control positivo interno (IPC) con cebadores y sonda prediseñados
• Molde de DNA de IPC
• Control de bloqueo del IPC
Los reactivos están diseñados para:
• Distinguir tipos de resultados negativos:
– Una llamada negativa para la diana y una positiva para el IPC indica que no
hay ninguna diana.
– Una llamada negativa para la diana y una llamada negativa para el IPC
sugieren una inhibición de la PCR.
• Evitar la amplificación de los controles endógenos.
• Permitir la coamplificación del IPC y la diana sin comprometer la amplificación
de la diana.
• Detectar el IPC con una sonda marcada con fluorocromo VIC®.
• Detectar la diana con una sonda marcada con fluorocromo FAM™.
Propiedades del
producto
Los kits TaqMan Exogenous Internal Positive Control Reagents:
• Requieren los siguientes componentes:
– Muestra de DNA
– Ensayo TaqMan para la diana de interés
– TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix
• Están diseñadas y optimizadas para funcionar con TaqMan 2✕ Universal PCR
Master Mix utilizando condiciones de termociclado universales.
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
5-13
Capítulo 5 Experimentos de presencia/ausencia
Kits disponibles
Applied Biosystems dispone de los siguientes kits de TaqMan Exogenous Internal
Positive Control Reagents:
Kits
Número de
referencia
TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents con
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix (con fluorocromo VIC®)
4308320
TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents
4308323
Nota: Si utiliza este kit, deberá adquirir uno de los siguientes reactivos
TaqMan® por separado:
• TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix (PN 4304437)
• TaqMan® PCR Core Reagents Kit (PN N808-0228)
Para obtener más
información
Para obtener información acerca de la preparación de reacciones de PCR con
TaqMan Exogenous Internal Positive Control Reagents, consulte TaqMan®
Exogenous Internal Positive Control Reagents Protocol.
Selección de la mezcla de reacción
Mezclas de
reacción
disponibles
Los ensayos en inventario/fabricados bajo pedido de Applied Biosystems para
experimentos de presencia/ausencia están diseñados para las siguientes mezclas de
reacción TaqMan®:
Mezcla de reacción
Número de
referencia
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix, 200 reacciones
4304437
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix, 2000 reacciones
4326708
Pack de 10, TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix
4305719
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix, No AmpErase® UNG, 200
reacciones
4324018
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix, No AmpErase® UNG, 2000
reacciones
4326614
Pack de 10, TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix, No AmpErase®
UNG
4324020
TaqMan® PCR Core Reagents Kit
N808-0228
Nota: Si adquiere TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents con el kit
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix (PN 4308320), no es necesario que
adquiera la mezcla de reacción por separado.
Nota: No se pueden realizar experimentos de presencia/ausencia con TaqMan® Fast
Universal PCR Master Mix.
5-14
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Capítulo 5 Experimentos de presencia/ausencia
Para obtener más
información
Para obtener información acerca del uso de reactivos TaqMan, consulte TaqMan®
Universal PCR Master Mix Protocol.
Diseño del experimento
Uso del software
StepOne
Para los ensayos en inventario/fabricados bajo pedido de Applied Biosystems, utilice
el software StepOne para diseñar sus experimentos de presencia/ausencia. El
software StepOne calcula automáticamente volúmenes para:
• Componentes de la mezcla de la reacción
• Controles y muestras
• Diluciones de muestras
Nota: Cuando seleccione el tipo de ensayo Inventoried/Made to Order (En
inventario/fabricado bajo pedido) en el software StepOne, vaya a la pantalla Reaction
Setup (Configuración de reacción) en el flujo de trabajo del asistente de diseño o
Advanced Setup (Configuración avanzada) y, a continuación, seleccione
Inventoried/Made to Order (En inventario/fabricado bajo pedido) en el menú
desplegable Assay Type (Tipo de ensayo).
Para obtener más
información
Para obtener información acerca del diseño y la realización de experimentos de
presencia/ausencia en el sistema StepOne, consulte Applied Biosystems StepOne™
Real-Time PCR System Getting Started Guide for Presence/Absence Experiments.
Ensayos personalizados
Flujo de trabajo
Si selecciona el tipo de ensayo Custom (Personalizado) en el software StepOne™
para realizar un experimento de presencia/ausencia (es decir, si va diseñar sus
propios cebadores y sondas), Applied Biosystems recomienda seguir el flujo de
trabajo de las directrices de diseño de ensayos de Applied Biosystems:
1. Diseñe los cebadores y las sondas con el software Primer Express®
(página 3-23).
2. Seleccione los reactivos adecuados (página 3-26).
¡IMPORTANTE! Applied Biosystems no recomienda el uso del fluorocromo
TAMRA™ como notificador o apantallador con el sistema StepOne.
Nota: Los reactivos rápidos TaqMan® y los reactivos SYBR® Green no se
admiten en los experimentos de presencia/ausencia.
3. Utilice las condiciones de ciclos térmicos recomendadas (página 3-28).
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
5-15
Capítulo 5 Experimentos de presencia/ausencia
4. Comience con las concentraciones de cebadores y sondas predeterminadas. Si
es preciso, optimice las concentraciones de cebador (página 3-31) y las
concentraciones de sonda (página 3-35).
¡IMPORTANTE! Estos pasos son un sistema rápido y fiable para diseñar y optimizar
los ensayos únicamente si se siguen de principio a fin. Utilice el sistema en su
totalidad para lograr los mejores resultados. Para leer una descripción más detallada
de las directrices de diseño de ensayos de Applied Biosystems, consulte el
Apéndice C.
Nota: Cuando seleccione el tipo de ensayo Custom (Personalizado) en el software
StepOne, vaya a la pantalla Reaction Setup (Configuración de reacción) en el flujo
de trabajo del asistente de diseño o Advanced Setup (Configuración avanzada) y, a
continuación, seleccione Custom (Personalizado) en el menú desplegable Assay
Type (Tipo de ensayo).
5-16
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Fórmula
A
A
Fórmula para experimentos de CT comparativos (∆∆CT)
Fórmula
La cantidad de diana, normalizada para un control endógeno y relativa a una muestra
de referencia, se calcula mediante:
2–∆∆CT
Derivación de la
fórmula
La ecuación que describe la amplificación exponencial de la PCR es:
Xn = Xo × ( 1 + EX )n
donde:
•
•
•
•
•
xn = número de moléculas de diana en el ciclo n
xo = número inicial de moléculas de diana
Ex = eficiencia de la amplificación de la diana
n = número de ciclos
Xo =número inicial de moléculas de diana
El ciclo umbral (CT) indica el número de ciclo fraccional en el cual la cantidad de
diana amplificada alcanza un umbral específico. De esta forma,
X T = X o × ( 1 + E X ) C T, X = K X
donde:
• xT = número umbral de moléculas de diana
• CT, X = ciclo umbral para la amplificación de diana
• KX = constante
Una ecuación similar para la reacción del control endógeno es:
R T = R o × ( 1 + E R ) CT, R = K R
donde:
•
•
•
•
•
RT = número umbral de moléculas de referencia
Ro = número inicial de moléculas de referencia
ER = eficiencia de la amplificación de la referencia
CT, R = ciclo umbral para la amplificación de la referencia
KR = constante
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
A-1
Apéndice A Fórmula
Si se divide XT entre RT, se obtiene la siguiente expresión:
C
X o × ( 1 + E X ) T, X K X
XT
= ------ = K
------ = ---------------------------------------C
RT
R o × ( 1 + E R ) T, R K R
Los valores exactos de XT y RT dependen de una serie de factores, incluidos:
• Fluorocromo notificador utilizado en la sonda
• Efectos del contexto de la secuencia en las propiedades de fluorescencia de la
sonda
• Eficiencia de la ruptura de la sonda
• Pureza de la sonda
• Ajuste del umbral de fluorescencia
Por lo tanto, la constante K no tiene que ser igual a 1.
Suponiendo que las eficiencias de la diana y la referencia sean las mismas:
E X = ER = E
C –C
X
-----o × ( 1 + E ) T, X T, R= K
Ro
O
XN × ( 1 + E )
∆C T
=K
donde:
• XN = XO/RO, la cantidad normalizada de diana
• ∆CT = CT, X – CT, R, la diferencia en ciclos umbral de la diana y la referencia
Al reorganizar, se obtiene la siguiente expresión:
XN = K × ( 1 + E )
– ∆C T
El último paso es dividir XN de cualquier muestra (q) por XN de la muestra de
referencia (cb):
– ∆C
X N, q
– ∆ ∆C T
K × ( 1 + E ) T, q
- == ( 1 + E )
------------ = ----------------------------------------–
∆
C
T
,
cb
X N, cb
K × (1 + E )
A-2
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Apéndice A Fórmula
donde:
• ∆∆CT = ∆CT, q – ∆CT, cb
Para los amplicones diseñados y optimizados de acuerdo con las directrices de diseño
de ensayos de Applied Biosystems (tamaño de amplicón <150 bp), la eficiencia se
aproxima a 1. Por lo tanto, la cantidad de diana, normalizada para un control
endógeno y relativa a una muestra de referencia, se obtiene mediante:
2–∆∆CT
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
A-3
Apéndice A Fórmula
A-4
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Limitación del cebador en la PCR en multiplex
B
B
Para generar un ensayo en multiplex preciso, es importante que la amplificación de
una especie no domine a la otra. De lo contrario, la amplificación de una especie
muy abundante puede impedir que la especie menos abundante se amplifique
eficientemente. Si la especie menos abundante no se amplifica eficientemente, el
experimento puede dar lugar a resultados imprecisos. O, en los casos más graves, se
puede inhibir por completo la detección de la especie menos abundante. Para evitar
este problema, limite las concentraciones de los cebadores que se utilizan para
amplificar la especie más abundante, de manera que la amplificación se “desactive”
poco después de establecer el CT.
La limitación del cebador hace que los componentes de la reacción comunes a ambos
ensayos no se agoten, lo que permite que la amplificación de la especie menos
abundante se realice con una gran eficiencia. Si no se conoce cuál es la especie más
abundante, debería determinarla antes de realizar la PCR en multiplex procesando
ambas dianas en tubos separados. Las dos amplificaciones deberían tener el cebador
limitante si ninguna de las especies abunda más que la otra.
Consideración de
la abundancia
relativa de la
diana y la
referencia
Hay que tener en cuenta la abundancia relativa del gen diana y del control endógeno
al limitar la cantidad de cebadores de estas dos especies a amplificar, hay que tener
en cuenta la abundancia relativa de las dos especies. Para los experimentos de
cuantificación, es posible utilizar rRNA como control endógeno. La concentración
de rRNA en el RNA total siempre es mayor que la concentración de cualquier mRNA
de diana. Por lo tanto, en las reacciones en multiplex en las que se amplifica la diana
y el rRNA, sólo hay que limitar las concentraciones de los cebadores del rRNA.
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
B-1
Apéndice B Limitación del cebador en la PCR en multiplex
Limitación de la
matriz de los
cebadores
Para definir concentraciones de cebador limitante, procese una matriz de
concentraciones de cebador reverso y directo utilizando el valor de molde mínimo. El
objetivo es identificar las concentraciones de cebador que reducen el valor ∆Rn del
ensayo sin afectar al valor CT. La siguiente tabla ilustra una matriz recomendada de
cebadores directos y reversos cuya concentración varía entre 20 y 100 nM.
Nota: Aunque si se siguen todos los criterios de diseño, es más fácil identificar
concentraciones de cebador limitante, puede que no sea posible para todos los
ensayos. Si un experimento de matriz de cebador limitante no permite identificar las
concentraciones de cebador limitante, será necesario volver a diseñar al menos un
cebador o procesar las reacciones en tubos diferentes.
Directo:
Reverso:
100 nM
100 nM
100 nM
80 nM
100 nM
60 nM
100 nM
40 nM
100 nM
20 nM
Directo:
Reverso:
80 nM
100 nM
80 nM
80 nM
80 nM
60 nM
80 nM
40 nM
80 nM
20 nM
Directo:
Reverso:
60 nM
100 nM
60 nM
80 nM
60 nM
60 nM
60 nM
40 nM
60 nM
20 nM
Directo:
Reverso:
40 nM
100 nM
40 nM
80 nM
40 nM
60 nM
40 nM
40 nM
40 nM
20 nM
Directo:
Reverso:
20 nM
100 nM
20 nM
80 nM
20 nM
60 nM
20 nM
40 nM
20 nM
20 nM
Ejemplo
Los resultados de un experimento de matriz de cebador limitante se muestran en la
Figura B-1 en la página B-3:
• La Figura B-1a muestra que sólo cuando las concentraciones de cebador se
reducen por debajo de aproximadamente 50 nM, el valor CT sufre efectos
importantes. El área llana muestra la región en la que se encuentran las
concentraciones de cebador limitante adecuadas. En esta área, el CT (y, por lo
tanto, el valor de cuantificación correspondiente) no cambia, mientras que el
valor ∆Rn y el producto resultante correspondiente se reducen
significativamente.
• La Figura B-1b muestra la relación correspondiente entre las concentraciones de
cebador y ∆Rn. La figura demuestra que se puede lograr menos producto
disminuyendo las concentraciones de cebador directo y reverso.
En este ejemplo, la selección apropiada de concentraciones de cebador limitante
serían al menos de 50 nM de cebador directo y reverso. La concentración de sonda se
debería mantener a un nivel óptimo cuando el cebador esté en cantidades limitantes
para garantizar que la señal producida sea lo suficientemente grande para que el
software realice un análisis preciso de multicomponente.
B-2
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Apéndice B Limitación del cebador en la PCR en multiplex
Figura B-1 Resultados del experimento de la matriz de cebador limitante
(a) Muestra cómo al valor CT le afecta la variación de concentraciones de
cebador directo y reverso. La región llana indicada muestra el área en la que el
valor CT permanece constante.
(b) Muestra una reducción de los ∆Rn valores a medida que la concentración de
cebador disminuye.
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
B-3
Apéndice B Limitación del cebador en la PCR en multiplex
B-4
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Directrices de diseño de ensayos
Acerca de las
directrices de
diseño de
ensayos
C
C
Si va diseñar sus propios ensayos (cebadores y sondas), Applied Biosystems
recomienda seguir las directrices de diseño de ensayos de Applied Biosystems. Las
directrices de diseño de ensayos especifican que:
1. Los cebadores y las sondas se deben diseñar con el software Primer
Express®: el software Primer Express utiliza un conjunto de parámetros
predeterminados cuando seleccione automáticamente conjuntos de cebadores y
sondas.
2. Se deben seleccionar los reactivos apropiados: hay disponibles muchos
reactivos TaqMan® y SYBR® Green. Los reactivos que se utilizan dependen del
tipo de ensayo.
3. Se deben utilizar las condiciones de termociclado recomendadas: utilice las
condiciones de termociclado recomendadas para la muestra (DNA/cDNA, RNA
para PCR de 1 paso y RNA para PCR de 2 pasos).
Nota: Las condiciones del termociclado de los reactivos rápidos son diferentes
a las condiciones del termociclado de los reactivos estándar.
4. Se deben utilizar las concentraciones de cebadores y sondas
predeterminadas u optimizar dichas concentraciones: si sigue las directrices
de diseño de ensayos de Applied Biosystems, puede utilizar las concentraciones
de cebadores y sondas predeterminadas para ensayos no en multiplex y
optimizados, o bien puede optimizar dichas concentraciones.
¡IMPORTANTE! Estos pasos son un sistema rápido y fiable para diseñar y optimizar
los ensayos únicamente si se siguen de principio a fin. Utilice el sistema en su
totalidad para lograr los mejores resultados.
Nota: Las directrices de diseño de ensayos de Applied Biosystems no garantizan el
mismo nivel de rendimiento y sensibilidad en todos los ensayos. Incluso los
parámetros de diseño más escrupulosos son incapaces de tener en cuenta todas las
variaciones posibles entre dos sistemas de ensayo diferentes.
Conclusiones de
los experimentos
de cuantificación
En general, se pueden extraer las siguientes conclusiones a la hora de utilizar las
directrices de diseño de ensayos para los experimentos de cuantificación:
• Para la mayoría de los ensayos TaqMan, una concentración de cebadores de
900-nM y de sondas de 250-nM produce un ensayo altamente reproducible y
sensible si se utiliza DNA o cDNA como molde.
• Dada la naturaleza no específica de su detección, la optimización del cebador de
fluorocromo SYBR® Green I sólo se debería omitir con precaución. Sin
embargo, si se siguen todas las directrices, las concentraciones de 50-nM de
cebadores directos y reversos suelen proporcionar una amplificación robusta
con un buen nivel de especifidad cuando se utiliza DNA o cDNA como molde.
Para verificar esta afirmación, compruebe si se forma un producto no específico
con un análisis de curva de disociación o de gel.
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
C-1
Apéndice C Directrices de diseño de ensayos
• La mayoría de los ensayos TaqMan deberían permitir detectar y cuantificar con
precisión hasta <50 copias de una diana, con la mayor sensibilidad posible.
• Los ensayos SYBR Green son capaces de ofrecer un rendimiento similar; sin
embargo, la formación de productos no específicos puede aumentar el límite de
detección mínimo.
Conclusiones
de los
experimentos de
genotipado
C-2
En general, se pueden extraer las siguientes conclusiones a la hora de utilizar las
directrices de diseño de ensayos para los experimentos de genotipado:
Se puede utilizar 900-nM de cebadores, una sonda de 200-nM y entre 1 y 20 ng de
DNA genómico para lograr unos resultados reproducibles y sensibles en el ensayo.
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Bibliografía
Afonina, I., Zivarts, M., Kutyavin, I., et al. 1997. Efficient priming of PCR with
short oligonucleotides conjugated to a minor groove binder. Nucleic Acids Res.
25:2657–2660.
Förster, V. T. 1948. Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Ann.
Physics (Leipzig) 2:55–75.
Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P.S., and Griffith, R. 1992. Simultaneous
amplification and detection of specific DNA sequences. Biotechnology 10:413–417.
Higuchi, R., Fockler, C., Dollinger, G., and Watson, R. 1993. Kinetic PCR:Real time
monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology 11:1026–1030.
Kutyavin, I.V., Lukhtanov, E.A., Gamper, H.B., and Meyer, R.B. 1997.
Oligonucleotides with conjugated dihydropyrroloindole tripeptides: base
composition and backbone effects on hybridization. Nucleic Acids Res.
25:3718–3723.
Kwok, S. and Higuchi, R. 1989. Avoiding false positives with PCR. Nature
339:237–238.
Livak, K.J., and Schmittgen, T.D. 2001. Analysis of Relative Gene Expression Data
Using Real-Time Quantitative PCR and the 2–∆∆CT Method. Methods 25:402–408.
Longo, M.C., Berninger, M.S., and Hartley, J.L. 1990. Use of uracil DNA
glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions. Gene
93:125–128.
Saiki, R.K., Scharf, S., Faloona, F., et al. 1985. Enzymatic amplification of β-globin
genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia.
Science 230:1350–1354.
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Bibliography-1
Bibliografía
Bibliography-2
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Glosario
AIF
Abreviatura de archivo de información de ensayo (Assay Information File).
alelo
Para una diana determinada, cualquiera de las variantes de secuencias que se
encuentran en la población.
amplicón
Segmento de DNA amplificado durante la PCR.
amplificación
Etapa del protocolo de termociclado, durante el cual se produce la generación del
amplicón. En los experimentos de cuantificación, los datos de fluorescencia recogidos
durante la amplificación se muestran en una gráfica de amplificación y se utilizan
para calcular los resultados. Si la amplificación está incluida en el proceso del
instrumento StepOne™ para experimentos de genotipado o presencia/ausencia, los
datos de fluorescencia recogidos durante la amplificación se muestran en una gráfica
de amplificación y se pueden utilizar para solucionar problemas.
apantallador
Molécula unida al extremo 3′ de las sondas TaqMan® que evita que el notificador
emita fluorescencia mientras la sonda está intacta. Con los reactivos TaqMan®, se
puede utilizar un apantallador no fluorescente ligando de surco menor (NFQ-MGB)
como apantallador. Con reactivos SYBR® Green, no se utiliza ningún apantallador.
¡IMPORTANTE! Applied Biosystems no recomienda el uso del fluorocromo
TAMRA™ como notificador o apantallador con el sistema StepOne™.
apantallador no
fluorescenteligando de unión al
surco menor (NFQMGB)
Moléculas que están unidas al extremo 3′ de las sondas TaqMan®. Si la sonda está
intacta, el apantallador no fluorescente (NFQ) evita que el fluorocromo notificador
emita fluorescencia. Dado que el NFQ no emite ninguna fluorescencia, produce
señales de fondo más bajas, lo que se deriva en una mayor precisión en la
cuantificación. El ligando de unión al surco menor (MGB) aumenta la temperatura de
desnaturalización (Tm) sin aumentar la longitud de la sonda. También permite el
diseño de sondas más cortas.
archivo de
información de
ensayo (AIF)
Archivo de datos del CD que se incluye con cada pedido de ensayo. El nombre de
archivo incluye el número del código de barras de la placa de reacción. La
información del AIF se incluye en un formato de texto delimitado por tabuladores.
asistente de diseño
Función del software StepOne™ que le ayuda a configurar el experimento guiándole
a través de los procedimientos óptimos para comenzar el diseño del experimento.
Auto∆
Opción para aumentar o reducir la temperatura y/o el tiempo en los ciclos
subsiguientes de la reacción de PCR. Cuando Auto∆ está habilitado, las opciones se
indican por medio de un icono en el perfil térmico:
• Auto∆ activado:
• Auto∆ desactivado:
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Glosario-1
Glosario
biblioteca de
dianas
Recogida de dianas en el software StepOne™.
biblioteca de
ensayos SNP
Recogida de ensayos SNP en el software StepOne™.
biblioteca de
muestras
Recogida de muestras en el software StepOne™. La biblioteca de muestras contiene el
nombre de la muestra y el color de la muestra.
calibración
espacial
Tipo de calibración del sistema StepOne™ en el que el sistema asigna las posiciones
de los pocillos en el bloque de muestras. Los datos de la calibración espacial se
utilizan para que el software pueda asociar aumentos de la fluorescencia durante un
proceso con pocillos específicos de la placa de reacción.
calibrador
Véase muestra de referencia.
cantidad
En los experimentos de cuantificación, la cantidad de diana en las muestras. La
cantidad absoluta puede referirse al número de copias, la masa, la molaridad o la carga
viral. La cantidad relativa se refiere a la diferencia entre la cantidad de diana
normalizada en la muestra y la cantidad de diana normalizada en la muestra de
referencia.
cantidad estándar
Cantidad conocida de la reacción de PCR.
• En los experimentos de curva estándar, la cantidad conocida de diana. Las
unidades de la cantidad estándar pueden ser la masa, el número de copias, la
carga viral u otras unidades para medir la cantidad de la diana.
• En los experimentos de curvas estándar relativas, cantidad conocida en el
estándar. Por ejemplo, la cantidad estándar puede referirse a la cantidad de
cDNA o la cantidad mayor o menor de solución de partida. Las unidades no son
relevantes en los experimentos de curvas estándar relativas, porque se
compensan en los cálculos.
cantidad inicial
Cuando se define una curva estándar o una dilución seriada de estándar, se
corresponde con la cantidad mayor o menor.
cantidad
normalizada
Cantidad de diana dividida por la cantidad de control endógeno.
cebador directo
Oligonucleótido que flanquea el extremo 5′ de la diana. El cebador reverso y el
cebador directo se utilizan juntos en las reacciones de PCR para amplificar la diana.
cebador reverso
Oligonucleótido que flanquea el extremo 3′ de la diana. El cebador reverso y el
cebador directo se utilizan juntos en las reacciones de PCR para amplificar la diana.
ciclo umbral (CT)
Número del ciclo de la PCR en el que ∆Rn corta el umbral en la gráfica de
amplificación.
Glosario-2
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Glosario
coeficientes de
regresión
Valores calculados a partir de la línea de regresión de las curvas estándar, incluido el
valor R2, la pendiente y el punto de intersección y. Los valores del coeficiente de
regresión se pueden utilizar para evaluar la calidad de los resultados a partir de los
estándares. Véase también curva estándar.
color de diana
Color asignado a una diana para identificarla en la disposición de la placa y las
gráficas de análisis.
Concentración de
muestra diluida
(10X para la mezcla
de reacción)
Campo del software que aparece en la ficha Sample Dilution Calculations (Cálculos
de dilución de muestras) de la pantalla Reaction Setup (Configuración de reacción).
En este campo, escriba la concentración de la muestra que desea utilizar para añadirla
a la mezcla de reacción de todas las muestras del experimento. "10✕for Reaction Mix"
(10X para la mezcla de reacción) significa que el software asume que la muestra o el
componente estándar de la mezcla de reacción tiene una concentración del 10✕. Por
ejemplo, si la concentración de las muestras diluidas es 50,0 ng/µL (10✕), la
concentración de la muestra final de la reacción es 5 ng/µL (1✕).
configuración
avanzada
Función del software StepOne™ que permite configurar el experimento de acuerdo
con el diseño de dicho experimento.
control endógeno
Diana que debería existir a niveles similares en todas las muestras que se están
probando. Se utiliza en experimentos de cuantificación relativa (∆∆CT) para
normalizar las señales de fluorescencia de la diana que se está cuantificando. También
se conoce como gen de mantenimiento.
control interno
positivo (IPC)
En los experimentos de presencia/ausencia, un molde de DNA sintético corto que se
añade a las reacciones de PCR. Se puede utilizar el IPC para distinguir los resultados
falsos negativos en las reacciones afectadas por los apantalladores de PCR, una
configuración incorrecta del ensayo o un fallo del reactivo o el instrumento.
control negativo
(NC)
En los experimentos del sistema StepOne™, tarea asignada a las dianas o los ensayos
de SNP en los pocillos que contienen agua o tampones en lugar de una muestra. En
los pocillos de control negativo, no se debería producir ninguna amplificación de la
diana.
control positivo
En los experimentos de genotipado, la tarea del ensayo de SNP en pocillos que
contienen una muestra con un genotipo conocido.
control sin
amplificación
(NAC)
Véase también pocillos de IPC de control negativo bloqueado.
CT
Abreviatura de ciclo umbral (Threshold Cycle).
CT automático
Opción de análisis en la que el software calcula de manera automática el umbral y la
línea basal de la gráfica de amplificación. El software utiliza la línea basal y el umbral
para calcular el ciclo umbral (CT).
CT manual
Opción de análisis en la que se introduce el valor del umbral y se selecciona si se
desean utilizar cálculos de línea basal automáticos o manuales. El software utiliza el
valor del umbral que se introduce y la línea basal para calcular el ciclo umbral (CT).
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Glosario-3
Glosario
curva de
disociación
Visualización de los datos recogidos durante la fase de la curva de disociación. Los
picos de la curva de disociación pueden indicar la temperatura de desnaturalización
(Tm) de la diana o pueden identificar la presencia de amplificaciones no específicas.
La curva de disociación se puede ver como fluorescencia del notificador normalizado
(Rn) frente a la temperatura o como la derivada de la fluorescencia del notificador
normalizada (−Rn′) frente a la temperatura.
curva estándar
En los experimentos de curva estándar y curva estándar relativa:
• La línea con un ajuste óptimo que resulta al representar los valores CT a partir
de las reacciones estándar frente a las cantidades conocidas del estándar. Véase
también línea de regresión.
• Conjunto de estándares que contiene una serie de cantidades conocidas. Los
datos de las reacciones de la curva estándar se utilizan para generar la curva
estándar. La curva estándar se define por el número de puntos de la serie, el
número de réplicas de estándar, la cantidad inicial y el factor de dilución. Véase
también dilución seriada de estándar.
delta Rn (∆Rn)
Abreviatura de notificador normalizado con línea basal corregida (baseline-corrected
normalized reporter).
desconocidos
En los experimentos de cuantificación, la tarea de la diana en pocillos que contienen
una muestra con cantidades de diana desconocidas.
En los experimentos de genotipado, la tarea del ensayo de SNP en pocillos que
contienen una muestra con un genotipo desconocido.
En los experimentos de presencia/ausencia, la tarea de la diana en pocillos que
contienen una muestra en la que no se conoce la presencia de la diana.
diana
La secuencia de ácido nucleico que se desea amplificar y detectar.
dilución seriada de
estándar
En los experimentos de curvas estándar y curvas estándar relativas, conjunto de
normas que contienen una serie de cantidades conocidas. La dilución seriada de
estándar se prepara por medio de estándares de dilución de dilución. Por ejemplo, la
solución de partida de estándar se utiliza para preparar el primer punto de dilución, el
primer punto de dilución se utiliza para preparar el segundo punto de dilución, etc. Los
volúmenes necesarios para preparar una dilución seriada de estándar se calculan
mediante el número de puntos de dilución, el número de réplicas de estándar, la
cantidad inicial, el factor de dilución y la concentración estándar en la solución de
partida. Véase también curva estándar.
diluyente
Reactivo utilizado para diluir una muestra o estándar antes de añadirlo a la reacción
de PCR. El diluyente puede ser agua o un tampón.
disposición
autónoma
Disposición del sistema en la que el instrumento StepOne™no está conectado a un
ordenador por medio del cable amarillo del sistema StepOne ™. En su lugar, se utiliza
una unidad USB ( ) para transferir datos entre los componentes del sistema
StepOne™. En esta disposición, el instrumento StepOne™ se controla por medio de la
pantalla táctil del instrumento.
Glosario-4
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Glosario
disposición
conectada
Disposición del sistema en la que el instrumento StepOne™ está conectado
directamente a un ordenador conectado por medio del cable del sistema StepOne™
amarillo. En esta disposición, el instrumento StepOne™ está controlado por medio del
software StepOne™ del ordenador conectado.
disposición de
placa
Ilustración de la rejilla de 6 × 8 pocillos y contenido asignado a la placa de reacción.
En el software, puede utilizar la disposición de la placa como una herramienta de
selección para asignar el contenido de los pocillos, ver las asignaciones de los pocillos
y ver los resultados. La disposición de la placa se muestra en las pantallas Design
Wizard (Asistente de diseño), Advanced Setup (Configuración avanzada), de proceso
y de análisis. La disposición de la placa se puede imprimir, incluir en un informe,
exportar y guardar como una diapositiva para una presentación.
DNA de la muestra
(10✕)
Componente de reacción que se muestra en la pantalla Reaction Setup (Configuración
de la reacción). El software asume que el DNA de la muestra que se añade a la mezcla
de la reacción está en una concentración del 10✕. Por ejemplo, si el volumen de la
reacción es de 20 µL, el volumen calculado de la muestra de la reacción 1 es 2 µL.
EFF%
Véase eficiencia de amplificación (EFF%).
eficiencia de
amplificación
(EFF%)
Cálculo de la eficiencia de la amplificación de la PCR. La eficiencia de la
amplificación se calcula utilizando la pendiente de la línea de regresión en la curva
estándar. Una pendiente próxima a
−3,3 indica una eficiencia de amplificación de la PCR óptima del 100%. Factores que
afectan a la eficiencia de la amplificación:
• Rango de cantidades estándar: para obtener medidas de la eficiencia más
exactas y precisas, utilice un amplio rango de cantidades estándar, de 5 a 6
registros (multiplicado por 105 a 106).
• Número de réplicas de estándar: para obtener mediciones de la eficiencia más
precisas, incluya réplicas para reducir los efectos de las imprecisiones del
pipeteo.
• Apantalladores de la PCR: los apantalladores de la PCR en la reacción pueden
reducir la eficiencia de la amplificación.
ensayo
En el sistema StepOne™, reacción de PCR que contiene cebadores para amplificar una
diana y una sonda para detectar la diana amplificada.
ensayo SNP
Se utiliza en los experimentos de genotipado. Es una reacción de PCR que contiene
cebadores para amplificar el SNP y dos sondas para detectar diferentes alelos.
ensayos bajo
pedido
Los ensayos TaqMan® que se fabrican cuando se solicitan. Sólo se envían los ensayos
que cumplen las especificaciones de control de calidad tras la fabricación.
ensayos
inventoriados
Ensayos TaqMan® fabricados previamente, que cumplen las especificaciones de
control de calidad y que se guardan en inventario.
estándar
Muestra que contiene cantidades estándar conocidas. Las reacciones estándar se
utilizan en experimentos de cuantificación para generar curvas estándar. Véase
también curva estándar y dilución seriada de estándar.
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Glosario-5
Glosario
experimento
Se refiere al proceso completo de realización de un proceso con el sistema StepOne™,
incluida la configuración, el proceso y el análisis. Tipos de experimentos que se
pueden realizar con el sistema StepOne™ :
•
•
•
•
•
•
Cuantificación : curva estándar
Cuantificación : curva estándar relativa
Cuantificación: CT comparativos (∆∆CT)
Curva de disociación
Genotipado
Presencia/ausencia
experimento de
punto final
Experimento en el que los datos de fluorescencia que se recogen en una lectura
posterior a la PCR se utilizan para calcular resultados para experimentos de
genotipado o presencia/ausencia.
factor de dilución
Valor numérico que define la secuencia de cantidades en la curva estándar. El factor
de dilución y la cantidad inicial sirven para calcular la cantidad estándar de cada punto
de la curva estándar. Por ejemplo, si la curva estándar se define con un factor de
dilución de 1:10 o 10, la diferencia entre 2 puntos adyacentes cualquiera en la curva
se multiplica por 10.
fase
Componente del perfil térmico. Una fase consta de uno o varios pasos.
fase cíclica
Fase del perfil térmico que se repite. Si la fase cíclica se utiliza para realizar la PCR,
se denomina fase de amplificación.
fase de curva de
disociación
Fase del perfil térmico con un incremento de temperatura para generar una curva de
disociación.
fase de espera
Fase del perfil térmico que incluye uno o varios pasos. Por ejemplo, puede añadir una
fase de espera al perfil térmico para activar enzimas, para desactivar enzimas o para
incubar una reacción.
fluorocromo del
sistema
Fluorocromo fabricado por Applied Biosystems y precalibrado en el sistema
StepOne™. Fluorocromos del sistema:
Fluorocromo FAM™
Fluorocromo JOE™
Fluorocromo ROX™
Fluorocromo SYBR® Green
Fluorocromo VIC®
¡IMPORTANTE! Applied Biosystems no recomienda el uso del fluorocromo
TAMRA™ como notificador o apantallador con el sistema StepOne™.
•
•
•
•
•
Glosario-6
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Glosario
fluorocromo
personalizado
Fluorocromo que no fabrica Applied Biosystems. Puede utilizar fluorocromos
personalizados para realizar experimentos de PCR en tiempo real en el sistema
StepOne™. Antes de utilizar fluorocromos personalizados, realice una calibración
espectral de los mismos.
¡IMPORTANTE! Applied Biosystems no recomienda el uso del fluorocromo
TAMRA™ como notificador o apantallador con el sistema StepOne™.
fluorocromo puro
Reactivo que contiene el fluorocromo. Los fluorocromos puros se utilizan para
realizar una calibración espectral en el sistema StepOne™. Véase también
fluorocromo del sistema.
gen de
mantenimiento
Véase control endógeno.
gráfica de
amplificación
Visualización de los datos recogidos durante la fase cíclica de la amplificación de la
PCR. Se puede ver como:
• Notificador normalizado con línea basal corregida (∆Rn) frente al ciclo
• Notificador normalizado (Rn) frente al ciclo
• Ciclo umbral (CT) frente al pocillo
gráfica de datos
brutos
Visualización del incremento de la fluorescencia de los pocillos seleccionados de
todos los filtros. Muestra el incremento de la fluorescencia de todos los puntos de
recogida de datos del proceso.
gráfica de
discriminación
alélica
Visualización de los datos recogidos durante la lectura posterior a la PCR. La gráfica
de discriminación alélica es una gráfica de la fluorescencia normalizada del
notificador de la sonda del alelo 1 frente a la fluorescencia normalizada del
notificador de la sonda del alelo 2.
gráfica de
temperatura
Visualización de temperaturas de la muestra, la cubierta del instrumento y el bloque
de instrumento durante el proceso del instrumento.
gráfica
multicomponente
Visualización de los datos recogidos durante la fase cíclica de la PCR en tiempo real.
La gráfica multicomponente muestra la fluorescencia de todos los ciclos del proceso.
grupo de réplicas
Conjunto de reacciones idénticas de un experimento.
identificador de
ensayo
Valor asignado por Applied Biosystems a los TaqMan® Gene Expression Assays y los
TaqMan® SNP Genotyping Assays.
identificador
refSNP
Número de identifiación del SNP (refSNP). Lo genera dbSNP (Single Nucleotide
Polymorphism Database of Nucleotide Sequence Variation o Base de datos de
polimorfismos nucleótidos únicos de variación de secuencia nucleótida). Se puede
utilizar para buscar en el almacén de Applied Biosystems un Applied Biosystems SNP
Genotyping Assay. También se denomina número rs.
inhibidor del IPC
Reactivo añadido a las reacciones de PCR para bloquear la amplificación del control
positivo interno (IPC).
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Glosario-7
Glosario
intersección y
Coeficiente de regresión calculado a partir de la línea de regresión en la curva
estándar. La intersección y de esta línea es el valor de y en el punto en el que la línea
cruza el eje y.
IPC
Abreviatura de control positivo interno (Internal Positive Control). Además, en los
experimentos de presencia/ausencia, es la tarea de la diana de IPC en pocillos que
contienen el molde del IPC.
IPC bloqueado
En los experimentos de presencia/ausencia, tarea asignada a la diana de IPC en los
pocillos que contienen un inhibidor de IPC en lugar de una muestra. Véase también
pocillos de IPC bloqueados por control negativo.
IPC+
Llamada de presencia/ausencia cuando el control interno positivo (IPC) es correcto.
lectura de punto
final
Véase lectura posterior a la PCR.
lectura posterior a
la PCR
Se utiliza en los experimentos de genotipado y presencia/ausencia. Es la parte del
proceso del instrumento que se produce después de la amplificación. En los
experimentos de genotipado, los datos de fluorescencia que se recogen durante la
lectura posterior a la PCR se muestran en la gráfica de discriminación alélica y se
utilizan para asignación de alelos. En los experimentos de presencia/ausencia, los
datos de fluorescencia que se recogen durante la lectura posterior a la PCR se
muestran en la gráfica de presencia/ausencia, y se utilizan para la detección. También
se denomina lectura de punto final.
lectura previa a la
PCR
Se utiliza en los experimentos de genotipado y presencia/ausencia. Es la parte del
proceso del instrumento que se produce antes de la amplificación. Los datos de
fluorescencia que se recogen durante la lectura previa a la PCR se utilizan para
normalizar los datos de fluorescencia posteriores a la lectura.
línea basal
En la gráfica de amplificación, línea ajustada a los niveles de fluorescencia de un
rango de ciclos definido. Si se utiliza una opción de análisis de línea basal manual,
Applied Biosystems recomienda seleccionar los primeros ciclos de la PCR para
determinar la línea basal.
línea basal
automática
Opción de análisis en la que el software calcula los valores de inicio y fin de la línea
basal para la gráfica de amplificación. El software utiliza la línea basal y el umbral
para calcular el ciclo umbral (CT).
línea basal manual
Opción de análisis en la que se introducen los valores de inicio y fin de la línea basal
para la gráfica de amplificación. El software utiliza la línea basal y el umbral para
calcular valores CT.
línea de regresión
En los experimentos de curva estándar y curva estándar relativa, la línea que mejor se
ajusta a partir de la curva estándar. Fórmula de la línea de regresión:
CT = m [registro (Cant)] + b
donde m es la pendiente, b es el punto de intersección y, y Cant es la cantidad estándar.
Véase también coeficientes de regresión.
Glosario-8
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Glosario
método CT
comparativos
(∆∆CT)
Método de cuantificación para experimentos de cuantificación. Con el método CT
comparativos (∆∆CT), se utilizan los resultados de una muestra de referencia y un
control endógeno para determinar cantidades relativas de una diana en las muestras.
método de
cuantificación
En los experimentos de cuantificación, el método que se utiliza para determinar la
cantidad de diana en las muestras. En los experimentos de cuantificación, hay tres
tipos de métodos de cuantificación disponibles: curva estándar, CT comparativos
(∆∆CT) y curva estándar relativa.
método de curva
estándar
Método de cuantificación para experimentos de cuantificación. Con el método de
curva estándar, los resultados de los estándares se utilizan para determinar cantidades
absolutas de una diana en las muestras.
método de la curva
estándar relativa
Método de cuantificación para experimentos de cuantificación. Con el método de la
curva estándar relativa, se utilizan los resultados de los estándares, una muestra de
referencia y un control endógeno para determinar las cantidades relativas de una diana
en las muestras.
método de proceso
Definición del volumen de reacción y el perfil térmico del proceso del instrumento.
mezcla de cebador
Componente de reacción de PCR que contiene el cebador directo y el cebador reverso
diseñados para amplificar la diana.
mezcla de
cebador/sonda
Componente de reacción de PCR que consta de cebadores diseñados para amplificar
la diana y una sonda TaqMan® diseñada para detectar la amplificación de la diana.
mezcla de ensayos
Componente de reacción de PCR de los Applied Biosystems TaqMan® Gene
Expression Assays y los TaqMan® SNP Genotyping Assays que consta de cebadores
diseñados para amplificar una diana y una sonda TaqMan® diseñada para detectar la
amplificación de la diana.
mezcla de la sonda
Componente de reacción de PCR que contiene una sonda TaqMan® diseñada para
detectar la amplificación de la diana.
mezcla de reacción
Solución que contiene todos los componentes necesarios para procesar la reacción de
PCR, excepto el molde (de muestra, de estándar o de control).
molde
Tipo de ácido nucleico que se añade a la reacción de PCR. El tipo de molde
recomendado varía en función del tipo de experimento.
monitorización
remota
Función del software que permite ver el estado de un instrumento en red, enviar
experimentos al instrumento y descargar experimentos de procesos en el ordenador.
muestra
El molde a ensayar.
muestra de
referencia
En experimentos de cuantificación relativa (∆∆CT), la muestra que se utiliza como
base de los resultados cuantitativos relativos. También se denomina calibrador.
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Glosario-9
Glosario
Muestra o estándar
(10✕)
Componente de reacción que se muestra en la ficha Reaction Mix Calculations
(Cálculos de la muestra de reacción) de la pantalla Reaction Setup (Configuración de
la reacción). El software asume que la muestra o el estándar que se añade a la mezcla
de la reacción está en una concentración del 10✕. Por ejemplo, si el volumen de la
reacción es de 20 µL, el volumen calculado de la muestra o estándar de la reacción 1
es 2 µL.
nombre de
experimento
Introducido durante la configuración del experimento, es el nombre que se utiliza para
identificarlo. Los nombres de los experimentos no pueden superar los 100 caracteres
y no pueden incluir ninguno de los siguientes caracteres: barra inclinada hacia delante
(/), barra inclinada hacia atrás (\), signo mayor que (>), signo menor que (<), asterisco
(*), signo de interrogación (?), comillas ("), línea vertical (|), dos puntos (:) o punto y
coma (;).
notificador
Fluorocromo que se utiliza para detectar la amplificación. Si se utilizan reactivos
TaqMan®, el notificador se une al extremo 5′. Si se utilizan reactivos SYBR® Green,
el notificador es SYBR® Green.
notificador
derivado (−Rn′)
Se muestra en el eje y de la curva de disociación. La señal del notificador derivado es
el opuesto de la primera derivada de la fluorescencia normalizada del notificador.
notificador
normalizado (Rn)
Señal de fluorescencia que emite el notificador normalizado con la señal de
fluorescencia de la referencia pasiva.
notificador
normalizado con
línea basal
corregida (∆Rn)
La magnitud de la señal de fluorescencia normalizada que genera el notificador
durante la amplificación de la PCR.
∆Rn = Rn (punto final) − Rn (línea basal), donde Rn = notificador normalizado.
número rs
Véase identificador refSNP.
omitir pocillo
Acción que se realiza después del análisis para omitir uno o varios pocillos de todos
los análisis antes de volver a analizar los datos.
pantalla táctil
Visor del instrumento que se toca para controlarlo.
paso
Componente del perfil térmico. Los pasos se definen por la temperatura, el tiempo, la
rampa y el estado de recogida de datos. En las fases cíclicas, los pasos también se
definen por medio del estado Auto∆.
PCR en tiempo real
Proceso de recogida de datos de fluorescencia durante la amplificación de la PCR. Los
datos de la PCR en tiempo real sirven para calcular los resultados de los experimentos
de cuantificación o para solucionar los problemas de los resultados de los
experimentos de genotipado o presencia/ausencia.
pendiente
Coeficiente de regresión calculado a partir de la línea de regresión en la curva
estándar. La pendiente indica la eficiencia de la amplificación de la PCR para el
ensayo. Una pendiente de −3,3 indica una eficiencia de amplificación del 100%.
Véase también eficiencia de amplificación (EFF%).
Glosario-10
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Glosario
perfil térmico
Parte de un método de proceso que especifica la temperatura, el tiempo, la rampa y
los puntos de recogida de datos de todos los pasos y fases del proceso del instrumento.
pocillos de IPC de
control negativo
En los experimentos de presencia/ausencia, pocillos que contienen un molde de IPC
y un tampón o agua en lugar de una muestra en la reacción de PCR. El molde IPC es
lo único que se debería amplificar en los pocillos de IPC de control negativo, porque
la reacción no contiene ninguna muestra. Véase también IPC+.
pocillos de IPC de
control negativo
bloqueado
En los experimentos de presencia/ausencia, pocillos que contienen un inhibidor del
IPC en lugar de una muestra en la reacción DE PCR. No se debería producir ninguna
amplificación en los pocillos de IPC de control negativo bloqueado, porque la
reacción no contiene ninguna muestra y la amplificación del IPC está bloqueada.
También se denomina "control sin amplificación” (NAC).
punto
Un estándar en una curva estándar. La cantidad estándar de cada punto de la curva
estándar se calcula en base a la cantidad inicial y el factor de dilución.
QuickStart (Inicio
rápido)
Función del sistema StepOne™ que permite realizar el experimento sin introducir la
información de configuración de la placa.
química
Véase reactivos.
rampa
La velocidad a la que cambia la temperatura durante el proceso del instrumento.
Excepto en el el caso de la curva de disociación, la rampa se define como un
porcentaje. En el caso del paso de la curva de disociación, la rampa se define como
un incremento de la temperatura. En el gráfico del perfil térmico, la rampa se indica
por medio de una línea diagonal.
reacción de la
muestra/diana
Combinación de la muestra y el ensayo diana en una reacción de PCR. En el asistente
de diseño, cada reacción de PCR sólo puede contener una muestra y un ensayo diana.
reacción del
ensayo
SNP/muestra
Combinación de la muestra y el ensayo SNP en una reacción de PCR. Cada reacción
de PCR sólo puede contener una muestra y un ensayo SNP.
reactivos
Los componentes de la reacción de PCR que se está utilizando para amplificar la diana
y detectar la amplificación. Tipos de reactivos utilizados en el sistema StepOne™:
• Reactivos TaqMan®
• Reactivos SYBR® Green
• Otros reactivos
reactivos SYBR®
Green
Componente de reacción de PCR que consta de dos cebadores que están diseñados
para amplificar la diana y el SYBR® Green para detectar DNA de doble cadena.
reactivos TaqMan®
Componentes de reacción de PCR que constan de cebadores diseñados para
amplificar la diana y una sonda TaqMan® diseñada para detectar la amplificación de
la diana.
rechazar pocillo
Acción que realiza el software durante el análisis para quitar uno o varios pocillos de
un análisis posterior si se aplica un aviso específico al pocillo.
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Glosario-11
Glosario
recogida de datos
Proceso durante la utilización del instrumento en el que un componente del
instrumento detecta datos de fluorescencia en cada pocillo de la placa de reacción. El
instrumento transforma la señal en datos electrónicos y los datos se guardan en el
archivo del experimento. Los puntos de recogida de datos se indican por medio de un
icono en el perfil térmico:
• Recogida de datos activada:
• Recogida de datos desactivada:
referencia pasiva
Fluorocromo que produce una señal de fluorescencia. Dado que la señal de referencia
pasiva debería ser uniforme en todos los posillos, se utiliza para normalizar la señal
del fluorocromo notificador para justificar las fluctuaciones de fluorescencia
causadas por diferencias menores entre pocillos en concentraciones o en volumen. La
normalización de la señal de referencia pasiva permite obtener datos de gran
precisión.
réplicas
Número total de reacciones idénticas que contienen componentes idénticos y
volúmenes idénticos.
Rn
Abreviatura de notificador normalizado (Normalized Reporter).
serie
Véase dilución seriada de estándar.
sin ácido nucleico
molde (NTC)
Véase control negativo (NC).
SNP
Abreviatura de polimorfismo nucleótido único (Single Nucleotide Polymorphism). El
SNP puede constar de una diferencia de una base o una indel (inserción/deleción).
tarea
Tipo de reacción realizada en el pocillo para la diana o el ensayo SNP. Tareas
disponibles en los experimentos del sistema StepOne™:
•
•
•
•
•
•
temperatura de
desnaturalización
(Tm)
Glosario-12
Desconocida
Control negativo
Estándar (experimentos de curvas estándar y curvas estándar relativas)
Control positivo (experimentos de genotipado)
IPC (experimentos de presencia/ausencia)
IPC bloqueado (experimentos de presencia/ausencia)
Punto en la curva de disociación en el que se produce un pico en los niveles de
fluorescencia que sirve para indicar que el DNA de doble cadena amplificado se
disocia en DNA de cadena sencilla.
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Glosario
tipo de
experimento
El tipo de experimento que se realiza con el sistema StepOne™:
• Curva estándar
• CT comparativos (∆∆CT)
• Curva estándar relativa
• Curva de disociación (no disponible en el asistente de diseño)
• Genotipado
• Presencia/ausencia
El tipo de experimento que seleccione afecta a las pantallas de configuración, proceso
y análisis.
Tm
Abreviatura de temperatura de desnaturalización (Tm o Melting Temperature).
transcriptasa
reversa
Componente de reacción de PCR que convierte el RNA en cDNA. La transcriptasa
reversa se añade a la reacción de PCR para realizar un RT-PCR de 1 paso.
umbral
Nivel de fluorescencia por encima de la línea basal y dentro de la región de
crecimiento exponencial de la gráfica de amplificación. El umbral se puede
determinar automáticamente (véase CT automático) o se puede ajustar manualmente
(véase CT manual).
umbral del ciclo
Véase ciclo umbral (CT).
valor atípico
Para un conjunto de datos, un punto que es significativamente más pequeño o grande
que los demás.
valor R2
Coeficiente de regresión calculado a partir de la línea de regresión en la curva
estándar. El valor R2 indica la proximidad del ajuste entre la línea de regresión de la
curva estándar y los datos de CT individuales de las reacciones estándar. El valor 1,00
indica un ajuste perfecto entre la línea de regresión y los puntos de datos.
velocidad de la
rampa
Velocidad a la que se produce la rampa de temperatura durante el proceso del
instrumento. Las velocidades de rampa disponibles son rápida y estándar.
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Glosario-13
Glosario
Glosario-14
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Índice
A
amplicones, seleccionar pequeños 3-24
arrastre, UNG para reducir al mínimo 2-7
seleccionar reactivos 3-26
diseñar experimentos
cuantificación 3-22
genotipificación 4-14, 4-17
presencia/ausencia 5-15
C
cebadores
concentraciones predeterminadas 3-31
estructuras en horquilla 3-9
resumen de directrices de diseño 3-25
RT-PCR de 1 paso 3-9
RT-PCR de 2 pasos 3-9
condiciones de ciclo térmico
cuantificación de DNA/cDNA 3-29
cuantificación de RNA 3-29
RT-PCR de 1 pasos 3-29
RT-PCR de 2 pasos 3-30
consumibles, admitidos 1-3
contaminación de DNA, reducción al mínimo 2-7
contenido de G/C, y emplazamientos de amplicones 3-24
control endógeno 3-6
controles negativos 3-5, 3-6, 4-4, 5-4
controles positivos 4-4
cuantificación de DNA/cDNA, condiciones de ciclo
térmico 3-29
cuantificación de RNA
condiciones de ciclo térmico 3-29, 3-30
RT-PCR de 1 paso 3-27
RT-PCR de 2 pasos 3-27
Custom TaqMan Gene Expression Assays 3-20, 5-12
Custom TaqMan SNP Genotyping Assays 4-15
D
dilución seriada de estándar 3-5
Directrices de diseño de ensayos
acerca de C-1
experimentos de cuantificación C-1
experimentos de genotipificación C-2
experimentos de presencia/ausencia 5-15
optimizar concentración de sonda 3-35
directrices de diseño de ensayos
cebador y sonda 3-23, 3-25
condiciones de ciclo térmico 3-28
experimentos de cuantificación 3-22
optimizar concentraciones de cebador 3-31
E
emplazamientos de amplicones
contenido de G/C 3-24
cribar 3-23
entremo de 3’ de cebadores 3-25
entremo de 5’ de sondas 3-24
selección 3-23
temperatura de fusión 3-24
estándares 3-5
estructuras en horquilla, y elección de cebador 3-9
experimentos de CT comparativo
acerca de 3-6
componentes 3-6
Véase también experimentos de cuantificación 3-6
experimentos de cuantificación
comparar 3-7
conclusiones para las directrices de diseño de
ensayos C-1
CT comparativo 3-6
curva estándar 3-5
curva estándar relativa 3-5
directrices de diseño de ensayos para tipos de ensayos
personalizados 3-22
diseñar 3-22
explicados 3-4
PCR en tiempo real 3-4
reactivos SYBR Green 2-4, 3-33
reactivos TaqMan 2-2
seleccionar mezcla maestra 3-21
seleccionar reactivos para tipo de ensayo
personalizado 3-26
seleccionar tipo de reactivo 3-13
seleccionar un método de cuantificación 3-5
tipos de ensayos 3-13
experimentos de curva estándar
acerca de 3-5
componentes 3-5
Véase también experimentos de cuantificación 3-5
experimentos de curva estándar relativa
acerca de 3-5
componentes 3-5
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Índice-1
Índice
Véase también experimentos de cuantificación 3-5
experimentos de genotipificación
componentes 4-4
conclusiones para las directrices de diseño de
ensayos C-2
descritos 4-4
diseñar 4-14, 4-17
funcionamiento 4-4
instrumentos 4-4
no coincidencias 4-5
reactivos TaqMan 2-2
seleccionar mezcla maestra 4-13, 4-17
tipos de ensayos 4-6
experimentos de presencia/ausencia
componentes 5-4
definidos 5-4
Directrices de diseño de ensayos para tipos de ensayos
personalizados 5-15
diseñar 5-15
funcionamiento 5-5
incorporar un IPC 5-5
reactivos TaqMan 2-2
realización sin un IPC 5-4
seleccionar mezcla maestra 5-14
seleccionar reactivos para tipo de ensayo
personalizado 3-26
tipos de ensayos 5-6
experimentos de punto final
genotipificación 4-4
presencia/ausencia 5-4
F
flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración
avanzada) 1-6, 1-7, 1-8
flujo de trabajo del asistente de diseño 1-6, 1-7, 1-8
I
IPC 5-4, 5-5
L
limitación de cebador, ensayos multiplexados 3-10
M
matriz de cebadores
cómo utilizar 3-31
definir límites B-2
ejemplo de limitador B-2
mezcla maestra
seleccionar para experimentos de cuantificación 3-21
seleccionar para experimentos de
genotipificación 4-13, 4-17
seleccionar para experimentos de
presencia/ausencia 5-14
muestra 3-5, 3-6, 4-4, 5-4
Índice-2
muestra de referencia 3-5, 3-6
MultiScribe reverse transcriptase, definición 3-28
N
no coincidencia, en experimentos de genotipificación 4-5
O
optimización 3-35
otros reactivos basados en fluorescencia 1-6
P
PCR en tiempo real
experimentos de cuantificación 3-4
proceso de detección de TaqMan 2-2
PCR multiplexada
cebadores de rRNA B-1
comparación con uniplexada 3-10
descrita 3-10
limitación de cebador 3-10
PCR, prácticas generales 2-8
pequeños amplicones, seleccionar 3-24
producto no específico, contaminación con colorante
SYBR Green 2-7
R
reactivos
consideraciones 2-6
otros basados en fluorescencia 1-6
reactivos SYBR Green 1-6
reactivos TaqMan 1-6, 2-2
seleccionar 1-6, 2-5
seleccionar para tipo de ensayo personalizado 3-26
reactivos SYBR Green
consideraciones para seleccionar 2-6
desarrollo 2-4
funcionamiento 2-5
optimizar experimentos de cuantificación 3-33
reactivos TaqMan
consideraciones para seleccionar 2-6
desarrollo 2-2
funcionamiento 2-2
tipos de experimentos 2-2
reactivos Universal Master Mix
ventaja de la polimerasa 3-28
recopilación de datos 1-2
réplicas 3-5, 3-6, 4-4, 5-4
RT-PCR
1 paso 3-8
2 pasos 3-8
comparación de métodos 3-7, 3-10
RT-PCR de 1 paso
acerca de 3-8
cebadores utilizados 3-9
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Índice
cuantificación de RNA 3-27
RT-PCR de 2 pasos
acerca de 3-8
cebadores utilizados 3-9
cuantificación de RNA 3-27
S
sistema StepOne
consumibles 1-3
recopilación de datos 1-2
tipos de ensayos 1-7
tipos de experimentos 1-5
tipos de reactivos 1-6
software Primer Express
amplicones pequeños 3-24
ensayos de SNP 1-9
experimentos de cuantificación 3-22
experimentos de presencia/ausencia 5-15
sondas
optimizar concentración de sonda 3-35
resumen de directrices de diseño 3-25
sondas MGB TaqMan disponibles 2-4
Sondas MGB TaqMan 2-3
T
TaqMan Drug Metabolism Genotyping Assays 4-11
TaqMan Endogenous Control Assays 3-19
TaqMan Exogenous Internal Positive Control
Reagents 5-13
TaqMan Gene Expression Assays 3-18, 5-10
TaqMan PDARs for AD 4-12
TaqMan SNP Genotyping Assays 4-10
temperatura de fusión, y emplazamientos de
amplicones 3-24
tipo de ensayo en inventario 1-7
tipo de ensayo fabricado bajo pedido 1-7
tipo de ensayo personalizado 1-8, 1-9
experimentos de cuantificación 3-22
experimentos de presencia/ausencia 5-15
tipo de ensayo prediseñado/validado 1-8
tipos de ensayos
ensayos en inventario/fabricados bajo pedido 1-7
ensayos personalizados 1-8, 1-9
ensayos prediseñados/validados 1-8
experimentos de cuantificación 3-13
experimentos de genotipificación 4-6
experimentos de presencia/ausencia 5-6
seleccionar 1-7
U
UNG, y reducción al mínimo de arrastre 2-7
unión de colorante, métodos de 2-4
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Índice-3
Índice
Índice-4
Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
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