PURIFICACION Y CARACTERIZACION DE LAS PROTEINAS.

PURIFICACION Y
CARACTERIZACION DE
LAS PROTEINAS.
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METODOS GENERALES DE PURIFICACION DE PROTEINAS.
1)Ruptura del material y obtención de un extracto libre de células.
2)Precipitación (sales, pH, alta temperatura, solventes orgánicos).
3)Diálisis o ultrafiltración. Concentración.
4)Fraccionamiento cromatográfico.
Principio de separación
Forma y tamaño
Carga neta
Punto isoeléctrico
Hidrofobicidad
Función biológica
Antigenicidad
Contenido en carbohidrato
Grupos sulfhidrilos libres
Capacidad de ligar metales
Tipo de cromatografía
Filtración por gel
Cromatografía de intercambio iónico.
Cromatoenfocado
Cromatografía de interacción
hidrofóbica
Cromatografía en fase reversa
Cromatografía de afinidad
Inmunoadsorción
Cromatografía con lectinas
inmobilizadas
Cromatografía covalente
Cromatografía de quelatos metálicos
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Eliminacion de moleculas chicas por dialisis.
Se requiere, en general, despues de una precipitacion con sulfato de amonio.
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METODOS GENERALES DE PURIFICACION DE PROTEINAS.
1)Ruptura del material y obtención de un extracto libre de células.
2)Precipitación (sales, pH, alta temperatura, solventes orgánicos).
3)Diálisis o ultrafiltración. Concentración.
4)Fraccionamiento cromatográfico.
Principio de separación
Forma y tamaño
Carga neta
Punto isoeléctrico
Hidrofobicidad
Función biológica
Antigenicidad
Contenido en carbohidrato
Grupos sulfhidrilos libres
Capacidad de ligar metales
Tipo de cromatografía
Filtración por gel
Cromatografía de intercambio iónico.
Cromatoenfocado
Cromatografía de interacción
hidrofóbica
Cromatografía en fase reversa
Cromatografía de afinidad
Inmunoadsorción
Cromatografía con lectinas
inmobilizadas
Cromatografía covalente
Cromatografía de quelatos metálicos
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FILTRACION POR GEL
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CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO.
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CROMATOGRAFIA DE
AFINIDAD.
Se explota el hecho de que toda
proteina es capaz de interaccionar
con uno o mas ligandos.
Fijandolos a una matriz, se puede
purificar selectivamente a la
proteina en estudio.
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GLUTAMATO DEHIDROGENASA-NADP DEPENDIENTE
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Tabla de purificacion y determinacion de homogeneidad proteica.
Purificacion step
Cell-free extract
ConA-Sepharose
Mono Q
Mono P
Total
Protein
Total
activity
Specific
Activity
Yield
Purification
factor
mg
unitsa
unitsa/mg
%
Fold
227.5
5.6
0.67
0.36
56.00
43.75
25.95
14.70
0.246
7.81
38.73
40.83
100
78.1
46.34
26.25
1
31.75
157.44
165.97
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ELECTROFORESIS.
V=Ez/f
v: velocidad de migración de la molécula en un
campo eléctrico. E: intensidad de campo eléctrico, z: carga
neta de la proteína. f = 6πηr es el coeficiente friccional. η es la
viscosidad del medio.
Electroforesis en gel de poliacrilamida: en condiciones nativas
(PAGE) o en presencia de SDS (SDS-PAGE).
Isoelectroenfocado (IEF): Separación por punto isoeléctrico (pI).
Electroforesis bidimensional en gel de poliacrilamida (2D -PAGE):
IEF en una primera dimensión, SDS-PAGE en la segunda.
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Electroforesis bidimensional (2D-PAGE)
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DETERMINACIÓN DEL PESO MOLECULAR DE LAS
PROTEINAS.
Mr = masa molecular relativa (por ejemplo, 50,000)
Masa molecular: Por ejemplo 50,000 daltons (50 kDa).
A) Proteína nativa:
1) Ultracentrifugación.
2) Filtración por gel.
3) Espectrometría de masa.
B)
Subunidad:
1) Electroforesis en gel de poliacrilamida en
presencia de dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE).
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SECUENCIACION DE PROTEINAS Y PEPTIDOS.
Para secuenciar una proteína siempre se debe partir de
la proteína purificada. La purificación puede consistir
en obtener la proteína pura en un tubo, a través de los
métodos de purificación ya mencionados, o, aún si no
está completamente homogénea, como una banda
discreta en un gel de SDS-PAGE.
Para secuenciar una proteína siempre se la debe
fragmentar para obtener péptidos de menor tamaño,
secuenciables por distintos procedimientos.
Esta
fragmentación se hace enzimáticamente (proteasas) o
químicamente (p.ej.: BrCN).
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Luego pueden aplicarse dos métodos:
1) Método de Edman:
Previa separación de los péptidos por HPLC en fase reversa,
secuenciarlos químicamente por reacción con el reactivo de Edman,
isotiocianato de fenilo, en un secuenciador automático.
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1er.Ciclo
1er.
Ciclo
2 Ciclo
2o.
DEGRADACI
ON DE
EDMAN
REACCION DEL
Secuenciación
RESIDUOpor
Nautomática
TERMINAL CON
el
Método de
ISOTIOCIANATO
Edman
DE
FENILO
3er.
Ciclo
3er.
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2)Espectrometría de masa (MS):
2a) Sin separar los péptidos, determinar las masas de un cierto
número de los mismos por MS e identificar a la proteína en los bancos
de datos por comparación con las masas de digeridos virtuales de
todas las proteínas ya secuenciadas. Optimo cuando el genoma del
organismo del cual proviene la proteína está completamente
secuenciado.
2b) Seleccionar un péptido determinado por MS y fragmentarlo,
obteniendo su secuencia a partir de las masas de los fragmentos
resultantes (MS/MS, espectrometría de masa en tandem con cámara
de colisión, o PSD, decaimiento después de la fuente , Post Source
Decay).
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Espectrometría de Masa
• La Espectrometría de Masa es una técnica que
permite determinar la masa de moléculas por medio
de la medida de la relación masa/carga (m/z).
• La medida de masas moleculares involucra la
producción, separación y detección de iones
moleculares en fase gaseosa.
• Cada molécula puede originar iones moleculares
con distinto número de cargas ( y distintas m/z).
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Un espectrómetro de masa consiste de tres módulos:
1) Fuente de iones.
2) Analizador de masas.
3) Sistema de detección y adquisición de datos.
Técnicas actuales para trabajo biológico:
1) MALDI-ToF MS (desorción/ionización por laser asistida por
matriz, combinada con análisis de masas por tiempo de vuelo)
2) ES/MS (ionización por electrospray combinada con análisis
de masas por cuadrupolo)
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Espectrometro
de masa,
MALDI-ToF
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DETERMINACION DE LA ESTRUCTURA TERCIARIA.
La estructura terciaria de las proteínas puede determinarse por dos
métodos principales:
Cristalografía de rayos X.
Espectroscopía de resonancia magnética nuclear (NMR).
Cristalografía de rayos X: Requiere la obtención de cristales de la
proteína, de calidad suficiente como para que, al irradiarlos con rayos
X, se pueda obtener la información suficiente para reconstruir
matemáticamente la estructura tridimensional de la proteína, aplicando
la transformada de Fourier. Actualmente se utiliza fundamentalmente
la radiación X generada en un sincrotrón, que tiene un espectro amplio
de logitudes de onda y acorta mucho el tiempo de exposición de los
cristales a la radiación. Además se los enfría durante la irradiación, lo
cual aumenta su estabilidad.
Cuello de botella: la obtención de
cristales adecuados.
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DIFRACCION
DE RAYOS X.
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(A) Fotografia de un cristal de
mioglobina.
(B) Fotografia de la difraccion
de un cristal de mioglobina.
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(A) Fotografia del Partenon; (B) esquema de difraccion optica del Partenon; (C y D)
imagenes reconstruidas del Partenon a partir de (B). En (D) se usaron mas datos y eso
mejora la calidad de la imagen.
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2) NMR de proteínas: Se basa en las propiedades
magnéticas de átomos como el 1H o el 13C. Requiere
el uso de aparatos de NMR de alta potencia (hasta 800
MHz). Utiliza proteínas en solución concentrada, por lo
que no se requiere su cristalización. Pero es aplicable
a proteínas de tamaño relativamente pequeño, hasta
unos 30 kDa.
En los casos en que se ha hecho la comparación
experimental, la estructura de una proteína
determinada por ambos métodos es muy similar. Ello
se debe a que lo cristales tienen una alto contenido de
agua, y la conformación que adopta la proteína será
muy similar a la que tiene en solución.
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PROPIEDADES MAGNETICAS DE ISOTOPOS NUCLEARES
Isótopo
Spin
Abundancia natural
1H
1/2
13C
1/2
1.108 %
15N
1/2
0.37 %
31P
1/2
99.98 %
100 %
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LAS INTERACCIONES INTERNUCLEARES (COUPLINGS)
PROVEEN INFORMACION ESTRUCTURAL.
Pueden ser:
1) Dipolares (a través del espacio):
Dan distancias internucleares.
2) Escalares (a través de uniones químicas):
3) Dan los ángulos dihedros.
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ESPECTROS DE NMR UNIDIMENSIONAL.
(A) Espectro de 1H-NMR del etanol. (B) Espectro de 1H-NMR
de un fragmento (55 residuos de aminoacidos) de una proteina.
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El efecto nuclear Overhauser (NOE) permite identificar pares de
protones que se encuentran muy cercanos. (B) Espectro NOESY
(Nuclear Overhauser enhancement spectroscopy). Los picos fuera de la diagonal
indican que los protones 2 y 5 estan cercanos (a menos de 4 A de distancia).
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Espectro NOESY
para un dominio de
55 residuos de
aminoacidos.
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Modificacion post-traduccional de las proteinas.
Muchas proteinas sufren modificaciones, ya sea por proteolisis parcial, o por modificacion
quimica de residuos de aminoacidos. Como el DNA solo predice el aminoacido original,
las modificaciones solo se detectan por quimica de proteinas.
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