Métodos de estudio en parasitología y micología

Dpto. Parasitología y Micología
CEFA
 En
medicina general: grupo de pruebas
diseñadas para la detección de anticuerpos
específicos (Acs dirigidos contra una Ag
conocido), reacciones de hipersensibilidad,
producción de linfoquinas, entre otras, en
respuesta a diversas patologías.
 En
parasitología clínica: cualquier técnica que
se utilice para la detección de Acs específicos
contra parásitos y hongos, constituyendo el
diagnóstico serológico.
SEROLOGÍA

La detección de anticuerpos circulantes
específicos se realiza en el Suero del
Paciente.
 Númerosas
técnicas de laboratorio se han
implementado
para
realizar
pruebas
serológicas.
 En
la Práctica Clínica el estudio se solicitica
como
Serología
para……citomegalvirus,
toxoplasmosis, leptosprosis, ….etc.
 Identificar
problemas de salud.
 Determinación de la distribución de una
enfermedad.
 Determinar la incidencia y la prevalencia de una
enfermedad.
 Medición de la inmunidad materna específica.
 Calendarios de vacunación.
 Evaluación de programas y/o campañas de
vacunación.

Diagnostico etiológico.

Establecer diagnósticos diferenciales entre diferentes
patologías infecciosas : parasitarias, fúngicas,
bacterianas.

Elección de la mejor conducta terapéutica .

Estimar reactividad .

Establecer políticas sanitarias de prevención.

Estudios epidemiológicos.
UTILIDAD EN PARASITOLOGÍA y
MICOLOGÍA
 Las
técnicas serológicas son útiles y
prácticas en las parasitosis
hemotesiduales y en las micosis
profundas.
 La
propiedad de unión de las Igs a un Ag,
que dicga unión sea específica y que
pueda ser visualizable, hacen que sean las
más utilizadas
 Agente
 Mecanismo
de transmisión
 Epidemiología
 Mecanismos inmunológicos
 Métodos de estudio
 La buena práctica médica requiere de
interconsultas.
 Los
parásitos son mosaicos antigénicos, siendo un
estímulo poderoso para el sistema inmunológico
del hospedero.
 ANTÍGENOS
PARASITARIOS
Somáticos
o
estructurales:
superficie,
citoplasmáticos
Metabólicos:
productos
de
la
actividad
fisiológica, Ags de secreción-excreción .

proteínas, glicoproteínas, polisacáridos, lipídos.
I. SEROCONVERSIÓN

El aumento del título o concentración de
anticuerpos cuatro veces o más, observado
en dos muestras separadas por un intervalo
de tiempo de 15 a 21 días.

Pasaje de no reactivo a reactivo.
II. SENSIBILIDAD: expresa la capacidad de la técnica
para detectar la menor concentración de Acs
buscados.
III. ESPECIFICIDAD:
expresa la capacidad de la
técnica para diferenciar los Acs específicos de
otros presentes en el suero problema.
IV. REACTIVIDAD CRUZADA: Acs diferentes al que se
busca, y que reaccionan con los Ags, cuando
comparten epítopes idénticos o muy similares.
1.
2.
3.
4.
CUALITATIVOS: reactivo o no reactivo
CUANTITATIVOS: miden la concentración de Acs a
estudiar.
- TÍTULO: máxima dilución del suero problema que
arroja un resultado positivo ( Ej: 1/1024 )
- UNIDADES PREDETERMINADAS: el valor obtenido de la
concentración de Acs se compara con un patrón
preestablecido de densidad óptica, fluorescencia ,
luminiscencia, que llamamos punto de corte, el cual
permite diferenciar los positivos de los negativos. El
valor se expresa en UI/ml, etc.
TAMIZAJE: Son utilizadas para estudio de grandes
poblaciones.
CONFIRMATORIAS: Para establecer el diagnóstico de
forma específica.
 Información
 Solicitud
 Obtenciónde
la muestra :
6 hrs de ayuno,
extracción de sangre
venosa,
tubo seco sin
anticoagulante, ….)
 Transporte (separada,
refrigerada…)
 Conservación (4ºC, -20ºC)
TÉCNICAS
Floculación
 Aglutinación
 Precipitación
 Fluorescencia
 Inmunoenzimoanálisis
 Radioinmunoanálisis
 Otras

 Técnicas
de aglutinación: Cuando el Ag se encuentra
unido o formando parte de células, parásitos o partículas,
la reacción Ag-Ac se puede detectar y cuantificar por el
aglutinado formado.  Técnicas
de fluorescencia: Para la realización de estas
técnicas el anticuerpo se marca con un fluorocromo,
detectándose la formación del complejo Ag-Ac por la
fluorescencia emitida.
 Inmunoprecipitación
e inmunoblotting: Permite detectar
la presencia y cantidad de antígenos y anticuerpos
específicos.
 Sencillas.
 Dependen
de la fijación inicial de antígenos
específicos sobre eritrocitos o partículas.
 Luego se incuban con el suero y las partículas
aglutinan si el Ac se encuentra presente.
 Detectan Acs totales de tipo IgG e IgM.
 En general deben ser confirmadas por medio de
otras, debido a que puede haber reacciones
inespecíficas.
 En
estas técnicas se hacen visibles los
complejos Ag-Ac por la aglutinación que
producen los Acs cuando el Ag forma parte o se
ha unido artificialmente a la superficie de
glóbulos rojos, plaquetas, leucocitos, partículas
de látex, etc. Normalmente se utilizan glóbulos
rojos (hemaglutinación) o partículas de látex.
• Aglutinación directa
Y
Y
Y
Y
Suspensiones de parásitos enteros
son enfrentadas a sueros de pacientes.
Los Ac (Y) presentes aglutinan los
parásitos, formando acúmulos
consistentes.
Y
•Aglutinación de partículas
Y
Y
Y
Y
Y
Y
látex, carbón, etc
Suspensiones de partículas inertes, con su
superficie cubiertas de Ag parasitarios,
son enfrentadas a sueros de pacientes.
Los Ac presentes aglutinan estas
partículas, formando acúmulos.
Y
Positivo
Negativo
-
+
 Para
la realización de estas técnicas se requiere que
tanto el Ac como el Ag se encuentren en un medio
adecuado en el que sea posible la precipitación de
los inmunocomplejos.

Existen diferentes modalidades:
- Técnica de precipitación en gel o difusión simple.
- Técnica de difusión radial de Ouchterlony.
- Técnica de inmunoelectroforesis.
- Otras.
TÉCNICAS DE PRECIPITACIÓN
 Es
una técnica que se realiza en dos fases.
 Primero se separa la mezcla de Ags por electroforesis y
posteriormente el Ag que se desea detectar se hace
reaccionar con un Ac específico colocado en un pocillo
lateral.
 Por difusión llegan a encontrarse los Ags y el antisuero,
apareciendo el complejo Ag-Ac visible en forma de
líneas de precipitación que pueden ser estudiadas por
comparación con un sistema estándar 3.
INMUNOELECTROFORESIS (IEF)
Separación de moléculas por campo eléctrico
 La
identificación de Acs en una muestra de suero problema,
se realiza en fase sólida, para ello el Ag se encuentra fijo a
un soporte (placa de plástico).
 El
marcado de la reacción se hace mediante el empleo
anti-Igs marcadas con una enzima (peroxidasa) lo que se
conoce con el nombre de conjugado.
 Los
anticuerpos conjugados suelen ser
monoclonales o anti-Igs especificas.
 Se les llama sistemas competitivos.
 Se establece competencia por los sitos de unión
disponibles entre el reactivo conocido, (Ag)
añadido al ensayo a concentración limitada, y
el elemento a investigar Ac.
 La
identificación de Acs en una muestra de suero
problema, se realiza en fase sólida, para ello el Ag
se encuentra fijo a un soporte (placa de plástico).
 El
marcado de la reacción para que sea visible y
detectable, se hace mediante el empleo anti-Igs
marcada con una enzima (peroxidasa) lo que se
conoce con el nombre de conjugado.
1
2
lavado
Ag en pocillo
lavado
Ac específico
en muestra
4
3
lavado
enzima conjugada (E)
Sustrato (S)
 Enzimáticos
 Fluorescentes
(Fluoroinmunoensayo)
 Ligandos (biotina, Avidina)
 Luminiscentes
(Luminoinmunoensayo)
 Espectrofotometría
 Fluorescencia
 Quimioluminiscencia
 Electro-química
CUANTITATIVO
1
1/2
1/4
1/16
1/32
1/64
1/128
BUFFER
1/8
DILUCIÓN
1
RESULTADO
1
1/2
+
1/4
+
1/8
+
1/16
1/32
1/64
1/128
+
+
+
-
AUTOMATIZACIÓN

Existen equipos electrónicos, que permiten la
automatización de los procedimientos y el análisis
computacional de los resultados.

La lectura y medida de la [ Acs-Ag ] se hace mediante
colorímetros, fluorómetros, fotómetros, etc.,

Facilitando la padronización y reproducibilidad de las
técnicas, mayor precisión y registro de resultados,
mejor cuantificación y valoración de los mismos.

Disminuye los errores y permite un mejor control de
calidad.
Cono fase sólida y pipeteo
Tira
Buffer lavado
Substrato
45
0
nm
Muestra Diluyente
Conjugado
REACCION INMUNOLOGICA
nm
0
photodiodo
7
3
REACCION ENZIMATICA
INMUNOFLUORESCENCIA
(I.F.I)
 Se
basa en la unión de Acs presentes en el suero , a los
Ags parasitarios de membrana, que han sido fijados a un
portaobjeto de vidrio.

Se incuba el suero del paciente con el Ag.

Lavado con PBS.

Posteriormente se agrega un Ac anti IgG
conjugada con isotiocianato de fluoresceína.

Esta sustancia se vuelve fluorescente al ser expuesta a la luz
ultravioleta , emitiendo una luz verde .

Fluorescencia en el citoplasma del parásito.
o IgM humana
Toxoplasma gondii
Trypanosoma cuzi
Echinococcus granulosus