Elemento P
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BIOLOGÍA EXPERIMENTAL APLICADA: LA EXPERIENCIA DE UNA ASIGNATURA PILOTO DESDE LOS PLANES DE ESTUDIO DE 1992 Y 2000 Alberto Guillén, Rosa María Arahuetes, Carmen Callejas, María Helena Cantarino, Begoña Gómez, Yasmina Juarranz, Rosario Linacero, Domingo Marquina, María del Carmen Moreno, Juana María Navarro, Agustin Ortiz, Rosa Perez Gomáriz, Julia Rueda, Trinidad Soto, Ana Vázquez y Covadonga Vázquez BIOLOGIA EXPERIMENTAL APLICADA ELEMENTOS P MODIFICADOS: UNA HERRAMIENTA EN EL CLONAJE DE GENES DE DROSOPHILA Duración 90 horas = 9 créditos ECTS Æ 6 créditos presenciales Æ 3 créditos seminarios + tutorías Horario : 9,30h - 13,30h • Número de Profesores = 16 • Número de Departamentos = 5 • Número de Alumnos = 150 - 180 • Número de Laboratorios = 5 • Números de Turnos = 3 • Ratio profesor/alumno = 10 -12 Especialidades : - Biotecnología - Biología Sanitaria - Neurobiología - Genética Grupo Piloto : Evaluación Tutorías 20% Trabajo 30% Examen 50% - Evaluación continuada del trabajo del alumno en el laboratorio. Se valorarán: . aptitud para el trabajo de laboratorio, . capacidad de trabajo en grupo, . comprensión y seguimiento de los protocolos experimentales, . interpretación y discusión de resultados científicos, . evaluación de un trabajo individual (20%). - Evaluación de un informe realizado en grupo sobre los resultados experimentales obtenidos, presentado en formato de publicación científica (30%). - Prueba final escrita sobre el conocimiento de los contenidos teórico-prácticos de la asignatura (50%). Objetivos : Adquisición de destrezas y aptitudes con distintas técnicas biológicas - Inmunología - Genética Molecular - Ingeniería Genética Integración de las mismas - Microbiología Diseño de un experimento Conclusiones Obtención y discusión de resultados Elaboración de un artículo científico Técnicas utilizadas : 9 Inmunodetección indirecta sobre embriones de moscas modificadas con elemento-P 9 Aislamiento y purificación de ácidos nucléicos 9 Electroforesis de ácidos nucléicos 9 Circularización de los fragmentos de ADN obtenidos 9 Transformación bacteriana con los fragmentos circularizados 9 Obtención y marcaje de sondas de ADN con digoxigenina 9 Hibridación “in situ” sobre embriones de moscas salvajes Material : Drosophila melanogaster - Modelo de eucariota superior - Se conoce bien su genética - Reproducción fácil - Desarrollo rápido Drosophila melanogaster Transformada con un elemento P modificado P es un elemento móvil tipo II, un transposón ¿ Que es un transposón? T A B C D E A B C D E Transposasa Escisión T Inserción Transposasa A B C T D E Elemento P Exón 0 Exón 1 Exón 2 Exón 3 AUG AUG mRNA de la línea somática, codifica para un represor de 66kDa UAA UGA AAAA AAAA mRNA de la línea germinal, codifica para la transposasa 87kDa Elemento P modificado P-lacW Sma I Eco RI 5’ P lac Z PL1 B: Bam HI Bg: Bgl II Eco RI Sac II mini-White H: Hind III P: Pst I PL2 S: Sal I X: Xba I H X Bg P S B pMT21 PL3 3’ P Transformación Célula germinal Células foliculares Estado folicular temprano Células nutricias Estado folicular tardío Oocito Microinyección de P Membrana vitelina Huevo Estado multinucleado Membrana de oocito Células polares (futuras células germinales) Núcleos embrionarios Formación de membranas celulares Células Vitelo Cruzamientos ojos blancos, quetas normales ojos blancos, quetas cortas w-, P, Sb- (transposasa -) w-, Sb+ (transposasa +) x Elemento P circularizado y no integrado Stubble marcador fenotípico dominante de quetas Todas las moscas aparecen con los ojos blancos y con el elemento P circularizado y no integrado ojos blancos, quetas cortas P integrado (linea germinal) x ojos blancos, quetas normales w-, Sb- (transposasa -) w-, P, Sb+ (transposasa +) Linea germinal w+ P integrado: w+ ojos rojos, quetas normales w-, P, Sb- (transposasa -) ... P se inserta al azar Cada mosca origina una LÍNEA Cada línea tiene insertado P en el mismo punto en el genoma ... ... ... ... ... ... ... ¿Dónde se ha insertado P en nuestra línea? P-lacW 5’ P lac Z PL1 miniwhite PL2 pMT21 PL3 3’ P INMUNODETECCIÓ N Desarrollo embrionario INMUNODETECCIÓ N Promotor Exón Intrón Exón Expresión en sistema nervioso Promotor Exón Lac Z Transcripción mRNA Traducción ß-galactosidasa Intrón Exón ¿Cómo podemos clonar el gen bajo cuyo promotor se expresa ß-galactosidasa? 5’ P lac Z PL1 miniwhite PL2 pMT21 PL3 3’ P pMT21 Fragmento genómico Resistencia a ampicilina Elemento P Secuencia genómica 3´ 5´ 5´ 3´ pMT21 Diana para la enzima de restricción A Diana para la enzima de restricción A 3´ 5´ 5´ 3´ Cortar con A y ligar Diana para la enzima de restricción A DNA genómico resistencia a ampicilina digestión selección ligamiento transformación clon Análisis de los clones PC R 3´ 3´ clon aislamiento del plasmido doble digestión Estudiar expresión del gen SONDA Hibridación in situ Elementos P modificados: una herramienta en el clonaje de genes de Drosophila Comprobar la expresión del gen clonado Hibridación DNA-RNA Hibridación in situ Embriones normales Elementos P modificados: una herramienta en el clonaje de genes de Drosophila ¿Cuál es la secuencia del gen aislado? Se secuencia el DNA clonado Se compara la secuencia con las existentes en los bancos de genes Caracterización de la línea de D. melanogaster INMUNODETECCION Obtención de una sonda de DNA genómico CLONAJE DEL FRAGMENTO EN 3’ DE P Estudio de la expresión del gen clonado HIBRIDACIÓN IN SITU Secuenciación del gen BÚSQUEDA DE LA SECUENCIA EN LOS BANCOS DE GENES
