papel de los receptores tipo nmda en el vestibulo del ajolote

PAPEL DE LOS RECEPTORES TIPO NMDA EN
EL VESTIBULO DEL AJOLOTE
Tesis que para obtener el título de
Maestro en Ciencias Fisiológicas
presenta
Carlos Eróstegui Revilla
Departamento de Ciencias Fisiológicas
Instituto de Ciencias
Universidad Autónoma de Puebla
1992
Director de la tesis: Dr. Enrique Soto
INDICE
RESUMEN
1
INTRODUCCION
2
Farmacología de los AAE
RECEPTORES TIPO NMDA
3
7
Agonistas del receptor NMDA
8
Antagonistas competitivos
8
Receptores NMDA y Mg
11
Antagonistas no competitivos
13
Receptor NMDA y glicina
16
Receptor NMDA y poliaminas
18
SISTEMA VESTIBULAR
18
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
20
MATERIAL Y METODOS
21
Disección
21
Registro
22
Diseño Experimental
23
RESULTADOS
24
Efectos del NMDA
24
Interacciones entre NMDA y Mg++
26
Interacciones entre NMDA y glicina
28
Efectos del APV
30
Efectos del 7ClKyn
32
DISCUSION
35
BIBLIOGRAFIA
42
RESUMEN
Diversos trabajos apoyan la idea de que un aminoácido excitador (AAE) del tipo del
glutamato es el neurotransmisor entre las células ciliadas y las fibras aferentes en el
sistema acústico-lateral. Particularmente en el caso del sistema vestibular de anfibios,
existen múltiples trabajos de tipo fisiológico y farmacológico que apoyan esta hipótesis.
Sin embargo, hasta ahora no se ha logrado aún determinar con precisión el papel
funcional de los diferentes receptores a los AAE en la transmisión aferente. Por estas
razones, decidimos estudiar el efecto de algunos agonistas y antagonistas del N-MetilD-Aspartico (NMDA), sobre la actividad eléctrica de las aferentes primarias en el
sistema vestibular del axolotl (Ambystoma tigrinum).
Los resultados que hemos obtenido indican que el NMDA ejerce un efecto
excitadordependiente de la concentración sobre las aferentes vestibulares. La curva
concentración efecto para el NMDA presenta una forma sigmoidea con una DE50 de
300 µM.
El estudio de las interacciones entre el NMDA y la glicina muestra que ésta, potencia
los efectos del NMDA. El ácido 2-amino-5-fosfono valérico (APV) que es un antagonista
competitivo del receptor NMDA, en concentraciones de 0.1 y 1 mM, bloquea la actividad
basal de las aferentes vestibulares y el efecto excitador del NMDA. Antagonistas
indirectos como el ácido 7 cloro kynurénico (7ClKyn) en concentraciones de 0.01 y 0.1
mM producen también un claro efecto inhibitorio sobre la actividad basal y aquella
evocada por el NMDA sobre las aferentes vestibulares. El incremento de la
concentración de Mg++ en el medio extracelular produce también una disminución de
las respuestas evocadas por el NMDA.
Nuestros resultados sugieren que en el sistema vestibular del axolotl se encuentran
receptores tipo NMDA, los cuales son modulados positivamente por glicina y
negativamente por el Mg++ extracelular.
1
INTRODUCCION
En los últimos treinta años, la investigación en el campo de la neurotransmisión ha
tenido un desarrollo rápido con descubrimientos importantes que han permitido avanzar
en la comprensión de la fisiología y bioquímica del Sistema Nervioso Central (SNC).
Entre estos avances está el descubrimiento del papel neurotransmisor de algunos
aminoácidos, a los que se los ha denominado aminoácidos excitadores (AAE) (Watkins
y Evans, 1981; DiChiara y Gessa, 1981; Foster y Fagg, 1984).
Existen dos clases de aminoácidos que tienen un profundo efecto sobre el sistema
nervioso, y que están presentes en altas concentraciones en el líquido extracelular: los
aminoácidos inhibitorios GABA y glicina, y los AAE glutamato y aspartato (McLennan,
1981).
A partir del descubrimiento de los AAE, se han buscado derivados tanto naturales
como sintéticos para poder estudiar las propiedades farmacológicas de los receptores,
y entender así su papel funcional en diferentes tejidos excitables. Actualmente se sabe
que los receptores a AAE están distribuidos en múltiples regiones del SNC, tanto de
vertebrados como de invertebrados (Watkins y Evans, 1981; Mayer y Westbrook, 1987;
Stone y Burton, 1987). Además en invertebrados se ha logrado demostrar
fehacientemente que el glutamato es el neurotransmisor de la unión neuromuscular
(Takeuchi y Takeuchi, 1964; Shinozaki, 1988).
La existencia de venenos específicos que pueden bloquear la neurotransmisión
mediada por el glutamato y el hecho de que estos venenos se encuentren en múltiples
especies, refuerzan la idea de que el ácido glutámico es un neurotransmisor
ampliamente distribuído. Por ejemplo, se ha logrado aislar una toxina de bajo peso
molecular de arañas tejedoras denominada argiotoxina que es un potente antagonista
de alta especificidad para el receptor a ácido quiscuálico (Jackson y Usherwood, 1988).
Esta toxina, bloquea la transmisión en la unión neuromuscular de la langosta, y en la
sinapsis del ganglio estrellado del calamar. Estas toxinas se han usado para diferenciar
2
entre los distintos tipos de receptores a AAE. Por ejemplo, la toxina de araña joro
(JSTX), no inhibe el receptor acoplado a proteína G (Sugiyama y cols, 1987). Por otra
parte, la filantotoxina tiene una mayor afinidad por los receptores ionotróticos a AAE. La
amplia distribución de los receptores a AAE en la escala filogenética es una clara
evidencia de su importante papel funcional.
En la década de los cincuenta, se encontró que el SNC de los mamíferos contenía
concentraciones de ácido aspártico y especialmente de ácido glutámico, mucho
mayores que cualquier otro tejido, lo que hacía pensar que el papel del ácido glutámico
en el tejido nervioso era importante en su metabolismo o como compensador del déficit
aniónico. Esta idea estuvo presente hasta principios de los años 60, cuando demostró
que el glutamato poseía una acción excitadora potente cuando se aplicaba a la mayoría
de las neuronas centrales (Curtis y Watkins; 1960, Curtis y cols. 1963). Curtis y Eccles
en 1958 encontraron, utilizando la técnica de microiontoforesis, que la aplicación de
glutamato y aspartato a neuronas aisladas de médula espinal, producía despolarización
(Curtis y Eccles 1958). Sin embargo, a pesar de la demostración del efecto del
glutamato y aspartato sobre las células nerviosas, no se aceptó la idea de que fueran
neurotransmisores, por el hecho de que mostraban un efecto excitador en
prácticamente cualquier tejido excitable en que se aplicaran, y principalmente porque no
satisfacían todos los criterios establecidos para considerar una substancia como
neurotransmisor (McLennan, 1987).
Farmacología de los AAE
Los primeros estudios de los receptores a AAE se llevaron a cabo en base al
descubrimiento del efecto convulsivante del glutamato, y a su capacidad de
despolarizar y excitar neuronas centrales aisladas. Posteriormente estudiando la
relación estructura-actividad de los ácidos glutámico, aspártico y otros compuestos
similares, se encontraron nuevos derivados a los que el cambio de la posición de los
grupos funcionales o la sustitución de estos por otros, les conferían mayor, igual o
menor potencia que el glutamato para despolarizar neuronas de médula espinal (Curtis
y Watkins; 1960). La actividad óptima del glutamato requería la presencia de dos
3
grupos acídicos y un grupo básico (amino). Este último óptimamente situado en el
carbono α para el grupo carboxilo, y el otro grupo acídico situado en el carbono _
separado por dos o tres átomos del primer grupo acídico (Curtis y Watkins, 1960;
Watkins y Cols., 1990), (Fig. 1). También se reconocieron los determinantes
estereoquímicos de la potencia; los isómeros L del glutamato eran por lo menos dos
veces más potentes que los isómeros D (Curtis y Watkins, 1963; Hall, 1979. Citados en
McLennan., 1987). Sin embargo, en los derivados N-alquil, como es el ácido NMDA, el
isómero D es muchas veces más potente que las formas L.
Con la demostración en los años sesenta de que diferentes AAE mostraban grados de
potencia variables en distintas regiones del SNC, y con el desarrollo de agonistas y
antagonistas selectivos, se estableció definitivamente la existencia de receptores a
AAE. A finales de los 70 el NMDA era el agonista más potente conocido. La excitación
inducida por el NMDA era inhibida por el D-α-amino adipato (D α-AA), el ácido D-amino
pimélico (DAP), el ácido 3-amino-l-hidroxi-pirrolidina (HA-966), y el Mg++, pero estos no
tenían efecto sobre las respuestas inducidas por otros agonistas o por el glutamato en
otras regiones del SNC (Watkins y Evans, 1981; Watkins y Olverman, 1987) (ver tabla
I). Estas observaciones llevaron a pensar que había más de un receptor al glutamato, lo
cual se confirmó con el descubrimiento de otros agonistas naturales como el ácido
kaínico (AK) (derivado cíclico del glutamato), y el ácido quiscuálico (AQ).
Posteriormente se encontró que las respuestas evocadas por el AK y el AQ eran
insensibles a los antagonistas de NMDA, pero antagonizados por el dietil éster del ácido
glutámico (GDEE), el cual no tenía ningún efecto sobre la depolarización inducida por
NMDA. En base a esto los receptores a AAE se clasificaron como NMDA y no-NMDA
(Watkins y Evans, 1981; Watkins, 1978; Watkins y Olverman, 1987; Watkins y cols,
1990). En la médula espinal de la rata el AK evocaba respuestas mayores y distintas
que el AQ (Watkins y Olverman 1987), mientras que en los crustáceos el AQ es mucho
más potente que el AK (Watkins y Cols, 1990), además de que este último y su análogo
el ácido α- amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxasolpropiónico (AMPA), son antagonizados por
4
Figura 1. Agonistas y antagonistas de los receptores a aminoácidos excitadores.
Agonistas: NMDA, ácido N-metil-D-aspártico; AMPA ácido α-amino-3-hidroxi-5isoxasolpropiónico. Antagonistas: GDEE, dietilester del ácido glutámico; HA-966, 3amino-l-hidroxipirrolidina 2; DAP, ácido α-ε-diaminopimélico; DαAA, ácido
aminoadípico; δDGG, δ-D-glutamil glicina;L- AP4, ácido fosfonobutírico.
5
GDEE y no así el AK, en base a lo cual se estableció una diferenciación entre los
receptores no NMDA: el receptor sensible a AK y el sensible a AQ (Foster y Fagg,
1984; Watkins y Cols, 1990).
Se encontró también en estudios de ligando, que el ácido 2-amino fosfono-butírico
(AP4 o APB) se une con alta afinidad a algunos sitios de la membrana y desplaza al
glutamato. Además se ha demostrado que la aplicación de AP4 induce una respuesta
inhibitoria en vías hipocámpicas y espinales (Harris y cols., 1987; Shinozaki 1988;
Mayer y Westbrook 1987; Pullan y Cols. 1987). A partir de estos estudios se propuso un
cuarto tipo de receptor denominado APB (actualmente AP4) ( Foster y Fagg, 1984;
Watkins, 1978; Watkins y Olverman, 1987; Watkins y Cols, 1990). Este receptor ha sido
comúnmente localizado presinápticamente, y se postula que funcione como
autorreceptor controlando la liberación de glutamato (Watkins y Cols., 1990). Sin
embargo aún no se conocen agonistas ni antagonistas específicos para este receptor,
aunque hay reportes de que la cistina podría ser un agonista selectivo (Homma, 1983;
Pullan y Cols. 1987).
Estos hallazgos han sido reforzados por estudios de unión de ligandos radioactivos, en
los que se ha demostrado que el AMPA y el AK marcados, son radioligandos
específicos para los receptores AQ y AK respectivamente (Foster y Cols., 1987),
mientras que el AQ es menos específico que el AMPA, ya que también presenta
afinidad moderada por los sitios de unión del AK. Esta característica del AQ junto con el
hecho de que el AMPA y el AQ son antagonizados por el GDEE, sugiere la existencia
de un subtipo particular de receptor a AQ propio de los vertebrados, pues el AMPA no
tiene efecto sobre la uniones neuromusculares de los insectos, (Watkins y Cols, 1990).
Por estas razones actualmente se denomina al receptor AQ como receptor a AMPA,
para diferenciarlo de un quinto tipo de receptor, el receptor metabotrópico (tabla I).
En 1987 Sugiyama y colaboradores reportaron que oocitos de rana inyectados con
RNA mensajero extraído de cerebro de rata, expresan receptores a glutamato cuya
activación
inducía
cambios
en
el
metabolismo
del
inositol
trifosfato
(IP3).
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Posteriormente se encontró que este tipo de receptores asociados al metabolismo de
fosfolípidos muestran una afinidad especial por el AQ y el 1-trans-3-amino ciclopentano
(ACPD) (Monahan y Cols., 1989). Este receptor es el denominado metabotrópico o
ACPD, y es antagonizado por la toxina pertussis, y se piensa que podría estar
involucrado en el desarrollo de la plasticidad.
Tabla 1. Clasificación de receptores a aminoácidos excitatorios
_____________________________________________________________________
Tipo de receptor
Subtipo de receptor
Ionotrópicos
NMDA
No NMDA
Principales agonistas
NMDA
Acido Kaínico
AMPA
AP4 o APB
metabotrópico
Acido Kaínico
Ac. Quiscuálico
Trans ACPD
____________________________________________________________________
Abreviaturas: NMDA, Ac. N-Metil-D-aspártico; AMPA, Ac. _-amino metil isoxasol
propiónico; AP4. Ac. aminofosfonobutírico; ACPD, Ac. Trans-1-amíno ciclopentil-1, 3
dicarboxílico.
RECEPTORES TIPO NMDA
Los receptores tipo NMDA han sido los más estudiados por sus características muy
particulares y su posible papel crítico en varios eventos neurofisiológicos, como son la
potenciación a largo plazo, el aprendizaje y la memoria.
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Agonistas del receptor NMDA
Aunque inicialmente se pensó que el agonista endógeno más potente para el receptor
NMDA debía ser un componente con la misma estructura enantiomérica, es decir, un
isómero D como el ácido aspártico, más tarde en experimentos electrofisiológicos y de
ligandos se demostró que agonistas que mostraban más actividad eran los isómeros L.
Así, el L-glu es más afín al receptor NMDA que el D-glu con una Ki de 0.9 y 49 µM
respectivamente. Parece que el ácido aspártico no tiene una estereoespecificidad
importante por el receptor y que las conformaciones L y D tienen una Ki prácticamente
igual de 11 y 10 µM respectivamente. La metilación del D-Aspártico no modifica la
afinidad por el receptor NMDA, la cual es de 11µM, sin embargo, la N-metilación del Laspártico decrementa la afinidad, así la Ki del NMLA es mucho menor, 160 µM
(Aebischer y cols, 1989).
En estudios de ligando con antagonistas específicos tritiados como el ácido
aminofosfovalérico (APV), se ha encontrado que los agonistas endógenos más afines al
receptor NMDA son los isómeros L con grupos terminales ácidos, COOH, SO2H, o
SO3H, siendo el más potente el L-glutamato (Watkins y Olverman, 1987; Watkins y
Cols. 1987).
Antagonistas Competitivos
El ácido kynurénico es una sustancia de ocurrencia natural, y es uno de los
antagonistas competitivos no selectivos con mayor potencia para antagonizar al
receptor NMDA. También se han propuesto otros aminoácidos endógenos que
desplazan al APV y AP7, y que podrían actuar como antagonistas sobre el receptor
NMDA, entre los cuales están la L-cisteína, el L-glutamato sulfinato y la L-homocisteína
sulfonato, (Do y cols, 1986; Watkins y cols. 1987; Pullan y cols. 1987; Stone y Burton,
1987; Dunlop y cols, 1989).
8
Los antagonistas del receptor NMDA son aminoácidos de cadena más larga que el
glutamato, son D-isómeros y tienen un radical terminal carboxi o fosfono, siendo los de
mayor actividad los que poseen el radical fosfono, como el APV y el AP7 (Fig. 2). Otros
compuestos que tienen actividad antagónica sobre el efecto del NMDA son los
derivados de la piperazina. De estos los más potentes son el CPP, y el ácido 3-(E)-(2carboxipiperazina-4-il) -propenil-1-fosfónico, (CPP-ene), de los cuales los de mayor
potencia son también los isómeros D (ver Tabla II).
Tabla 2. Clasificación de los agonistas y antagonistas del receptor NMDA
____________________________________________________________________
AGONISTAS
Selectivos
NO selectivos
ANTAGONISTAS
NMDA
APV
HCSA
AP7
PDA
CPP
L-Glutamato
D-α- AA
Ac.Aspártico
D-α- AS
Ac.Homocisteico
DAP
Ac. Iboténico
Ac. Quinolínico
NO Competitivos
MK-801
Fenciclidina
SKF 10047
Ketamina
Mg++
Alostericos
Glicina
HA-966
D-serina
7-Cl-kynurenico
_____________________________________________________________________
ABREVIATURAS: HCSA, Ac. Homocisteico sulfínico; PDA, Ac. Piperidín Dicarboxílico;
AP-7, Amino Fosfoheptanoico; CPP, Ac. 3-3(2-Carboxi piperazina-4-il) propil-1fosfónico; D-_-AA, Ac. Amino Adípico; D-_-AS, Ac. Amino Subérico; DAP, Ac. Amino
Pimélico; HA-966, 3-amino-1-hidroxi-Pirrolidina.
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Después de examinar varios antagonistas competitivos a AAE, se reportó que los más
potentes y selectivos para el receptor tipo NMDA eran en orden decreciente: el CPP, el
APV y el AP7, con constantes de afinidad de 0.28 µM para el CPP, entre 0.6 y 5 µM
para el APV y 1.7 µM para el AP7 (Watkins y cols., 1984; Olverman y cols., 1984; Fagg
y cols, 1986; Davies y cols., 1986; Watkins y Olverman, 1987 ).
FORMULA ESTRUCTURAL DE ALGUNOS ANTAGONISTAS COMPETITIVOS DEL
RECEPTOR NMDA
Figura 2. Estructura de algunos de los antagonistas más potentes y específicos del
receptor tipo NMDA. Abreviaturas: D-Asp-AMP, ácido á- aspartilaminometil fosfónico.
Para las otras abreviaciones ver el texto.
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Otros antagonistas competitivos son los ácidos 1-p-clorobenzoil (PCB), y 1-pbromobenzoil-piperazina-2-3 dicarboxílico (PBB-PzDA), los cuales tienen menor
potencia que el ácido kynurénico para antagonizar la respuesta de receptores tipo
NMDA y son de igual potencia que los receptores AK y AQ (Watkins y cols, 1987).
Ninguno de estos antagonistas alcanza la potencia ni es tan selectivo como el CPP y el
APV, por lo que este último se ha considerado como el antagonista específico de los
receptores tipo NMDA.
Receptores NMDA y Mg++
En experimentos de fijación de voltaje en neuronas aisladas, se ha analizado la
permeabilidad iónica de los receptores NMDA usando como agonistas el NMDA y el Laspartato. Las curvas corriente voltaje muestran que en presencia del agonista, el
receptor NMDA se comporta de manera similar a los canales del receptor a acetilcolina
de las uniones neuromusculares, produciendo corrientes de entrada (Na+) y de salida
(K+). Maniobrando la composición iónica intra y extracelular, se encontró que el canal
tenía un potencial de inversión cercano a 0 mV, y que éste cambiaba cuando se
alteraba la concentracion extracelular de Ca++ (Mayer y Westbrook, 1987). Este hecho
sugiere que el canal asociado al receptor NMDA no solo es permeable a los cationes en
general, sino principalmente al Ca++, mientras que el canal asociado a los receptores
no NMDA es bastante inespecífico. En adición a esto, se ha reportado que la activación
del receptor NMDA incrementa la concentración intracelular de Ca++ libre (McDermott y
Dale, 1987), y por otra parte, parece que las dihidropiridinas interactuan con la corriente
de Ca++ evocada por NMDA, razon por la cual se piensa que ésta podría estar
mediada por un canal catiónico con caracteristicas similares al canal voltaje
dependiente tipo 'L' de Ca++ (Hashim y cols, 1989). Estos hechos sugieren que el rol
del receptor NMDA es principalmente metabólico, más que de neurotransmisión, pues
la entrada de Ca++ inducida por los agonistas del recptor NMDA, desencadena
procesos fisiológicos como la potenciación a largo plazo, producción de ácido
araquidónico, actividad rítmica etc., además que explica la toxicidad de los agonistas
NMDA (Ascher y Johnson, 1989).
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Las corrientes y el incremento del Ca++ intracelular inducidos por los agonistas del
receptor NMDA , pueden ser bloqueadas por el Mg++ dependiendo del potencial de
membrana de la célula (Ascher y Nowak, 1987; Nowak y cols., 1984; Mayer y
Westbrook, 1987; Foster y Fagg, 1987). En soluciones libres de Mg++, la sensibilidad
del canal hacia el voltaje disminuye dramáticamente, deduciendose de esto, que el
canal asociado al receptor no tiene dependencia intrínseca del voltaje, sino que la
sensibilidad a éste depende de la presencia de Mg++ u otro catión divalente (Co++,
Mn++, Ni++, etc.) (Mayer y Westbrook, 1987).
Mediante fijación de voltaje se ha encontrado que el Mg++ aumenta su afinidad por el
canal cuando la membrana se hiperpolariza hasta alrededor de -90 mV, y disminuye
cuando el potencial de membrana se hace menos negativo (Mayer y Westbrook, 1987).
El Mg++ parece bloquear al canal de forma intermitente, pues con la técnica de patch
clamp se ha visto que el canal presenta estados de apertura y cierre rápidos en
presencia de Mg++ extracelular; sin embargo el canal permanece más tiempo abierto
cuando el medio extracelular carece de Mg++, generando corrientes de larga duración.
En base a esto Mayer y Westbrook propusieron que la dependencia de voltaje del
canal asociado al receptor NMDA podría ser debida a que el receptor tiene un sitio
específico donde se une el Mg++, y que éste al entrar al canal quedaría dentro del
campo eléctrico de la membrana, lo que conferiría al bloqueo la dependencia de voltaje.
Por otra parte Ascher y Nowak en 1987 propusieron, para explicar este mismo
fenómeno, que la dependencia podría deberse a que el Mg++ se deshidrata 1000 veces
más lentamente que el Ca++. Ellos suponen que el canal tiene un orificio de entrada
ancho, por donde penetrarían ambos cationes hidratados, sin embargo el Mg++
quedaría atrapado en un sitio estrecho del canal, al no poder deshidratarse.
Sin embargo estas hipótesis parecen ser muy simples, ya que también se encontró que
el canal NMDA es sensible al Mg++ intracelular, dependiente también de voltaje pero de
manera inversa a la del Mg++ extracelular, es decir que el canal es bloqueado cuando
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la célula se despolariza y se hace permeable con la hiperpolarización, además que la
intermitencia de la apertura y cierre del canal registrados en patch clamp no aumenta
con el incremento de la concentración de Mg++ extracelular (Ascher y Johnson., 1989).
De esta manera, actualmente se buscan nuevos modelos e hipótesis que puedan
explicar el bloqueo del canal por Mg++.
Antagonistas No Competitivos
A principios de los 80, se reportó que algunas sustancias con estructuras químicas muy
diferentes a las de los AAE, generalmente de peso molecular alto, actuaban como
antagonistas no competitivos específicos de los receptores tipo NMDA (Cotman e
Iversen, 1987; Kemp y cols, 1987). Estos antagonistas no competitivos incluyen la
clorpromazina, anestésicos disociativos como la fenciclidina (PCP) y la ketamina; un
anticonvulsivante, el MK-801 que es el más potente de este tipo de antagonistas;
derivados del benzomorfan, la N-alilnormetazocina (SKF10047) y la ciclazocina;
derivados de la morfina, el dextrorfan, el dextrometorfan y otros (Fig. 3). Los
estereoisómeros (+) de estos compuestos muestran mayor potencia que los (-). En
experimentos con ketamina, fenciclidina y MK-801 (Lehmann y cols, 1987; Contreras y
cols, 1987; Greenberg y Maks, 1988), se ha visto que su efecto es dependiente de
voltaje (aunque de manera mucho menor que el Mg++), y de la activación del canal con
un agonista.
Ni el glutamato ni los antagonistas competitivos desplazan (en estudios de ligandos), ni
tampoco bloquean (en experimentos electrofisiológicos), el efecto de la PCP y
sustancias similares. Estos hallazgos sugieren que los antagonistas no competitivos
actúan de la misma forma que el Mg++, es decir se unen al interior del canal impidiendo
el paso de los iones (Foster y Fagg, 1987; Kemp y cols, 1987), pero aparentemente en
un sitio distinto al de Mg++, ya que no hay correlación entre el efecto de estos
antagonistas y el de Mg++, (fig 4).
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FORMULA ESTRUCTURAL DE ALGUNOS ANTAGONISTAS DEL RECEPTOR NMDA
Figura 3. Fórmula estructural de algunos antagonistas no competitivos del receptor
NMDA. Abreviaturas: PCP, Fenciclidina; SKF 10047, n-alilnormetazocina; LY
154045 Benz (f) isoquinolina; MK 801, Dibenzocicloheptenaimina.
En estudios electrofisiológicos se ha visto que la activación del receptor NMDA está
relacionada con los otros tipos de receptores a AAE (AK y AQ), pues en los potenciales
postsinápticos excitatorios (PPSE) inducidos por AAE, la fase rápida de la descarga es
mediada por receptores no NMDA y la fase lenta y de larga duración por receptores
NMDA (MacDermott y Dale, 1987). En base a esto se ha propuesto un posible
mecanismo en el cual la despolarización producida por los receptores AK y AQ,
induciría a la apertura del canal mediado por el receptor NMDA, el cual sería modulado
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por el Mg++ y un agonista no competitivo para dar un potencial lento y de larga
duración. Estas características del receptor NMDA apoyan la hipótesis de que este
receptor participa en los fenómenos de aprendizaje y plasticidad del SNC mediante la
potenciación de largo plazo (Collingridge y Bliss, 1987; Cotman, 1988).
Receptores NMDA y glicina
Otro aspecto del receptor NMDA es el de su modulación por la glicina, la cual
contrariamente a su acción inhibidora clásica, potencia las respuestas evocadas por
agonistas del receptor NMDA, (Ascher y Nowak, 1987; Kleckner y Dingledine, 1988).
En 1987 Johnson y Ascher descubrieron en experimentos de patch clamp en neuronas,
que la corriente y el tiempo de apertura del canal, aumentaba con concentraciones
submicromolares de glicina. Demostraron además, que este efecto de la glicina era
insensible a la estricnina que es un antagonista de los receptores inhibitorios de glicina.
A este descubrimiento siguieron otros trabajos que demostraron que la glicina prevenía
la desensibilización del receptor (Mayer y Westbrook, 1987) y que la unión de los
antagonistas (competitivos y no competitivos) al receptor NMDA, dependía de la
presencia de glicina en el medio. Incluso en algunas preparaciones se encontró que la
glicina era un requerimiento absoluto para inducir una respuesta con NMDA (Kleckner y
Dingledine, 1988). Con base en estos hallazgos se postuló la existencia de un sitio
alostérico en el receptor cuyo agonista era la glicina. Para demostrar esto se buscaron
sustancias que antagonizaran la acción de la glicina, encontrándose un derivado del
ácido kynurénico, el 7-Cl-kynurénico (Kemp y Cols., 1988), que inhibe la potenciación
por glicina, y un antagonista del receptor NMDA el HA966, cuyo antagonismo es
revertido solamente por la glicina (Drejer y Cols., 1989). Se ha reportado también que el
CNQX y el DNQX afectan la unión de glicina a su sitio en el receptor, aunque el CNQX
es 20 veces más afin al receptor AMPA (Honore y cols, 1987; Kessler y cols, 1989).
Por otra parte se encontró que en algunas regiones del SNC la presencia de glicina
incrementa considerablemente la unión del glutamato y de los agonistas del receptor
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NMDA, y decrementa esta afinidad para los antagonistas, mientras que en presencia
del antagonista del sitio de glicina, el HA-966, sucede lo contrario, es decir que se
incrementa la afinidad por los antagonistas y disminuye por los agonistas (Brugger y
Cols., 1988). Aunque se ha visto que la glicina puede cambiar el estado de preferencia
del receptor por un antagonista a un estado de preferencia por un agonista, y que
estimula la unión del glutamato marcado a los sitios con preferencia de antagonista, la
diferencia regional de afinidad por uno y otro parece ser independiente. Por esto se
postula la existencia de subtipos del receptor NMDA a los que la glicina modularía su
afinidad hacia los agonistas o antagonistas (Monahan y Cols., 1988; Watkins y
Olverman., 1989).
En base a estos hechos se concluyó que el receptor NMDA tiene un sitio específico
insensible a estricnina, donde se une la glicina y actúa como agonista alostérico o
coagonista, potenciando la respuesta producida por el NMDA, de manera semejante a
como lo hacen los derivados de las benzodiazepinas en el receptor de GABA (Cotman
e Iversen, 1987; Kleckner y Dingledine, 1988).
La acción de la glicina no depende del potencial de membrana, y aunque no está claro
el mecanismo de acción, se propone que podría producir un cambio conformacional en
el complejo receptor canal, esencial para la apertura de este último o para la unión del
agonista. Por analogía, se piensa que como en el caso del receptor colinérgico, el de
NMDA requiere la unión de dos moléculas del agonista para activarse, sin embargo uno
de los sitios de unión para el agonista, podría haber cambiado su especificidad
aceptando a la glicina en lugar de la segunda molécula de agonista (Kleckner y
Dingledine, 1988).
16
Esquema del Receptor NMDA
Figura 4. Modelo del complejo receptor-canal NMDA. Se esquematizan los posibles
sitios a los que se unen los agonistas y antagonistas, y los sitios alostéricos para la
glicina, el zinc, los agonistas no competitivos, el Mg++, y las poliaminas. Abreviaturas
DET: dietilentriamina; DA10 1-10 diaminodecano; 7-ClKyn, ácido 7-Cloro Kynurénico;
el resto igual a las figuras anteriores.
Receptor NMDA y poliaminas
Las poliaminas del tipo de la espermina, espermidina, polilisina y lisil-lisina; se unen al
receptor de NMDA, produciendo una modulación positiva del mismo. Todas ellas son
policationes: espermina (+3), espermidina (+4). Estas dos últimas se encuentran y
producen en el SNC, particularmente durante el desarrollo. Sin embargo, su producción
es intracelular lo que obliga a pensar en la posibilidad de que el sitio de unión también
sea intracelular (Reynolds y Miller, 1989). La interacción de poliaminas con la unión de
17
TCP al receptor de NMDA fue reportada por Ransom y Stec (1989). Parecería que la
glicina, el NMDA y las poliaminas interactúan positivamente en el sitio de la glicina , y
que para que actúen las poliaminas se requiere que estén activados los sitios para el
NMDA y la glicina, (Canton y cols, 1989), y probablemente los tres para que el canal se
pueda abrir.
En 1988 Foster y Fagg desarrollaron un modelo del receptor NMDA (fig 4) en el que se
propone que éste tendría un sitio para los agonistas y antagonistas competitivos, otro
donde se uniría la glicina y los antagonistas a ésta, un tercer sitio para el Mg++ situado
dentro del canal cercano a la cara interna de la membrana y un cuarto sitio activo
también dentro del canal pero más exterior, donde se unirían los antagonistas no
competitivos (fig. 4). Este complejo tendría también un sitio donde se unen las
poliaminas del tipo de la espermina y la espermidina (Ransom y Steck, 1989; Ransom y
Deschenes, 1990). Y un sexto sitio de unión donde se une el Zn++, el cual es diferente
al sitio activo del Mg++, ya que no está asociado al canal y no presenta dependencia
del voltaje (Peters y cols, 1987). En la corteza de rata, la potencia para la unión en este
sitio es la siguiente: Zn>La=Cd>Mn>Co>Ni=Mg (Greenberg y Marks, 1988; Westbrook y
Mayer, 1987).
SISTEMA VESTIBULAR
Fisiológicamente el vestíbulo es un sistema de transducción que convierte la energía
mecánica en señales eléctricas que llevan hasta el cerebro información sobre la
posición de la cabeza en el espacio, y respecto al cuerpo. Esta labor es ejecutada por
un sistema complejo de neuronas aferentes y eferentes, y células especializadas
llamadas células ciliadas, las cuales son estimuladas cuando sus cilios (kinocilios y
estereocilios) son desplazados. Las células ciliadas están situadas en la cúpula de los
tres canales semicirculares formando hileras orientadas transversalmente respecto al
eje del canal, con los kinocilios dirigidos hacia el lumen del canal, y en el sáculo y
utrículo donde tienen una distribución más o menos circular, con los cilios dirigidos
hacia la membrana otolítica.
18
Las células ciliadas reciben inervación aferente y eferente, y en condiciones naturales
liberan neurotransmisor(es) constantemente, de tal manera que producen una actividad
tónica en las fibras aferentes. Aunque no se sabe con precisión el mecanismo de acción
de esta liberación tónica de neurotransmisor, se cree que es debida a una entrada
constante y en pequeña magnitud, principalmente de K+ y Ca++ a través de los canales
de transducción situados en el extremo apical de las células ciliadas, el cual está en
contacto con la endolinfa. Esta entrada de iones produciría una despolarización de las
células y desencadenaría los eventos intracelulares necesarios, como es la liberación
de Ca++ de los depósitos intracelulares, para inducir la liberación de neurotransmisor.
La descarga tónica de las fibras aferentes es incrementada por el desplazamiento de
los estereocilios hacia el kinocilio (desplazamiento positivo), o inhibida si se alejan de
éste (desplazamiento negativo). El mecanismo de la transducción no está claro todavía,
sin embargo, hay evidencias que sugieren que los canales de transducción son
activados mecánicamente por un elemento elástico cuando los estereocilios son
desplazados positivamente (Howard y Cols., 1988). La apertura de estos canales
permite la entrada de K+ y Ca++ (Huspeth, 1983; Valli y Cols., 1979), despolarizando
de esta manera la célula e incrementando la liberación de neurotransmisor y, como
consecuencia, aumentando la descarga de las fibras aferentes. La descarga tónica de
las fibras aferentes, es también modulada por las fibras eferentes, y se ha encontrado
que en la mayoría de los vertebrados, esta modulación es inhibitoria.
Aunque ya se ha establecido que el neurotransmisor eferente es la acetilcolina (Klinke,
1986; Norris y cols, 1988), la identidad del neurotransmisor de la sinapsis entre las
células ciliadas y las fibras aferentes todavía no es clara. Hay evidencias que indican
que el neurotransmisor podría ser el glutamato, ya que la aplicación de éste o agonistas
similares (aspartato, quiscualato, etc.), incrementan la tasa de descarga de las fibras
aferentes tanto en registros multiunitarios como intracelulares (Annoni y cols, 1984; Valli
y cols., 1985; Soto y Vega, 1988). Sin embargo, se encontró que los potenciales
excitatorios presinápticos disminuyen en frecuencia y amplitud en presencia de ácido D-
19
_-amino-adípico (D-_-AA), un antagonista de los receptores glutamatérgicos (Valli y
cols., 1985), y aumentan en frecuencia con la aplicación de AQ, AK, y NMDA (Prigioni y
cols., 1990), lo que sugiere que el sitio de acción de este antagonista podría ser no
solamente postsináptico, sino también sobre las células ciliadas. Por otra parte, hasta
ahora tampoco se ha podido demostrar la presencia de las enzimas necesarias para la
producción y degradación del glutamato en la sinapsis, por lo cual a pesar de las fuertes
evidencias que apuntan al glutamato como el neurotransmisor de la sinapsis aferente,
este no llena los criterios necesarios para ser aceptado como tal.
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Si bien es cierto que aún no se acepta al glutamato como el neurotransmisor endógeno
de la sinapsis aferente en el sistema vestibular, tambien está claro que los AEE son las
únicas sustancias que evocan una respuesta en esta sinapsis. Por lo tanto es un hecho
ya establecido que en la sinapsis aferente, ya sea en las células ciliadas o en las
terminales dendríticas de las fibras aferentes, existen receptores a AEE.
En un estudio previo del efecto de los AAE sobre el vestíbulo del ajolote (Soto y Vega,
1988), se reportó que la aplicación de AK y AQ evocaba respuestas de considerable
magnitud, pero no así la aplicación de NMDA, el cual indujo respuestas irregulares y de
pequeña magnitud, y que parecían no ser afectadas significativamente por el el Mg++
extracelular. Por otra parte, en estudios de cromatografía líquida de alta presión de la
perilinfa y endolinfa del sistema vestibular de cobayo, rata y caballo (Drescher y cols.,
1983; Thalman y Cols, 1981), se ha encontrado que estos fluidos contienen, entre otros
aminoácidos, glicina, glutamato y aspartato (Medina y Drescher, 1981), y se ha
demostrado en coclea de cobayo, que éstos son liberados cuando se induce
despolarización por K+ (Jenison y Cols. 1985). En base a lo anterior, cabe preguntarse
si la presencia del receptor NMDA en la sinapsis vestibular es realmente significativa, y
de ser así, qué significado tiene la presencia de la glicina y su liberación hacia la
perilinfa y endolinfa ante un estímulo despolarizante, es decir, si la glicina actúa como
modulador del receptor NMDA o si solamente tiene un papel metabólico. Podemos
20
suponer que si la glicina modula la respuesta de los receptores NMDA en otras
regiones del sistema nervioso, y si el receptor NMDA del vestíbulo tiene propiedades
similares al reportado en la literatura, entonces es posible que la glicina module a este
receptor en el vestíbulo, potenciando su respuesta.
Los objetivos de este trabajo son caracterizar adecuadamente las respuestas inducidas
por el NMDA y sus agonistas y antagonistas en el vestíbulo; definir si la respuesta es
modulada por glicina, y si esta modulación es afectada por los antagonistas del sitio de
glicina. Finalmente determinar si existe o no, antagonismo del Mg++ para las
respuestas evocadas por el NMDA.
MATERIAL Y METODOS
Los experimentos se realizaron en el órgano vestibular del Axolotl (Ambystoma
tigrinum), sin diferenciación de sexo ni peso.
Disección
Para disecar la cápsula ótica, se decapitó al axolotl, y se procedió a eliminar la
mandíbula inferior y la piel de toda la cabeza, descubriendo así la base del cráneo.
Posteriormente bajo el microscopio, se quitó el tejido óseo que cubre a la cápsula ótica
para disecar y liberar los canales semicirculares y los órganos otolíticos. Luego se
disecaron en todo su trayecto, desde las ámpulas hasta el cerebro, los nervios
provenientes de los canales semicirculares anterior y lateral, y se seccionaron lo más
cercanamente posible al tallo cerebral. Se procedió a aislar la capsula ótica del resto del
cráneo, obteniendo así una preparación del laberinto aislado. La preparación se colocó
en una cámara de registro de aproximadamente 2 ml de volumen, y se perfundió con
Ringer de anfibio con flujo constante de 1.2 ml/min, cuya composición fue: NaCl, 111
mM; KCl, 2.5 mM; CaCl2, 1.8 mM; MgCl2, 1 mM; HEPES, 5 mM; Glucosa, 10 mM,
ajustado a pH de 7.4. En la mayor parte de los experimentos se perfundió con Ringer
21
modificado en el cual se eliminó completamente el MgCl2 (Ringer sin Mg++), en tanto
que en otra serie experimental, el MgCl2 se elevó a 1 o 3 mM (Ringer con alto Mg++).
Registro
El registro extracelular, se hizo mediante un electrodo de succión (fig. 5). Este
electrodo está formado por un tubo de plástico, al cual se le coloca en la punta una
pipeta de vidrio, con un extremo cónico pulido al cual se introducirá el nervio. El
electrodo está conectado mediante una manguera a una jeringa con la que se ejerce
presión negativa. En su interior el electrodo tiene un alambre de plata clorurada. Para
llevar a cabo el registro la pipeta de vidrio y el electrodo se llenan con solución Ringer
hasta que la punta del alambre de plata quede sumergido en éste. Una vez hecho esto
se afrontan el electrodo y el nervio, y con la jeringa se ejerce presión negativa para
succionar el extremo libre del nervio e introducirlo dentro del electrodo y formar así un
sello de alta resistencia eléctrica. La presión negativa se mantiene a lo largo del
experimento, asegurando así que se mantenga el nervio dentro del electrodo.
La señal proveniente del nervio se amplificó 1000 veces mediante un amplificador ACDC Grass P-16, y de este se derivó a un osciloscopio y a un sistema de grabación para
su ulterior procesamiento. La actividad eléctrica de las aferentes se procesó mediante
un programa de captura de datos con el que se construyen histogramas de frecuencia
contra tiempo (Soto y Vega, 1987). El registro para cada prueba se hizo durante 10
minutos, aplicando la droga 2 minutos después de tener un registro basal estable, y se
continuó el registro durante 8 minutos.
Posteriormente se lavó la preparación hasta asegurar que el efecto de la droga hubiese
terminado, tomando como criterio que la frecuencia de descarga sea igual a la control.
Las drogas utilizadas fueron: NMDA, 7-KClKyn (Cambridge Research Biochemicals);
glicina (J.T. Baker); APV, AQ y D-serina (Sigma Chemicals Co.).
22
Esquema del método de registro
Figura 5. Esquema del sistema de registro de la actividad eléctrica de las aferentes
primarias del órgano vestibular. Para la descripción veáse el texto.
La aplicación del NMDA y el APV, y de una serie de experimentos con glicina, se hizo a
través de un sistema de microperfusión, en el que mediante una microjeringa (Hamilton)
conectada a una pipeta de vidrio se inyectaron 20 µl de la droga diluida en Ringer. La
droga se aplicó aproximadamente a 0.5 mm, de distancia del origen visible de las fibras
nerviosas en las ámpulas de los canales semicirculares anterior y lateral. La glicina, Dserina y el 7ClKyn, se perfundieron por sustitución del baño.
Diseño Experimental
Para poder responder a las preguntas planteadas, dividimos el trabajo experimental en
cinco fases. En la primera fase se estudió el efecto del NMDA sobre la descarga basal
de las fibras aferentes vestibulares. Para ello, se aplicó NMDA a concentraciones
crecientes de 0.01, 0.1, 1, y 50 milimolar. La segunda fase consistió en estudiar el
efecto de la glicina sobre la descarga espontanea, y sobre la curva dosis efecto del
23
NMDA, para lo cual, en una serie de experimentos la glicina se perfundió en el baño a
concentraciones de 0.001, 0.01, 0.1, 1, 10 y 100 µm. En otra serie, la glicina se
microperfundió conjuntamente con el NMDA. En esta última serie los experimentos se
llevaron a cabo en base al diseño del cuadrado latino (Cochran y Cox, 1981), en el cual
se combinaron las concentraciones de NMDA y glicina de tal manera que el orden de
las aplicaciónes de las drogas fué realizada completamente al azar. En la tercera fase
se probó el efecto del antagonista competitivo, APV y del antagonista del sitio de
glicina, el 7ClKyn, sobre la descarga inducida por el NMDA. En la cuarta fase se estudió
la capacidad de la D-serina para revertir los efectos del 7ClKyn. En la última fase, se
probó el efecto del Mg++ sobre las respuestas inducidas por el NMDA, perfundiendo
para esto con Ringer conteniendo 1 y 3 mM MgCl2.
Para determinar la significancia estadística del efecto de cada una de las drogas en
una misma preparación, se usó la prueba no paramétrica de U-Mann-Whitney (Soto y
cols, 1989), comparando la actividad eléctrica de las aferentes antes de la aplicación de
la droga durante un período establecido de 2 min como control, y en el pico de la
respuesta después de aplicada la droga. Con los resultados obtenidos en diferentes
experimentos y a diferentes concentraciones de las drogas, se construyeron curvas
dosis-efecto, en las cuales las respuestas intereventos se normalizaron como el
porcentaje de aumento con respecto al control. Para la comparación de los efectos de
las diferentes concentraciones se usó la prueba de t de student.
RESULTADOS
Efectos del NMDA
Se usaron 85 ajolotes en los cuales se hizo registro extracelular multiunitario. En los
experimentos que se realizaron para estudiar los efectos del NMDA, la preparación se
perfundió con Ringer de anfibio libre de Mg++. Se probó la respuesta al NMDA en 68
ocasiones y se exploraron 5 concentraciones que van de 1 µM a 5 mM. Se encontró
24
que el NMDA induce un efecto excitador dependiente de la concentración sobre la
actividad
Figura 6. Gráficas de frecuencia contra tiempo que muestran el efecto típico del
NMDA sobre la actividad eléctrica de las aferentes vestibulares. Los tres
histogramas corresponden a registros de la misma preparación. Luego de un
registro control (2 min), se aplicó NMDA (flecha) a las concentraciones indicadas en
cada gráfica.
25
eléctrica de las aferentes vestibulares. La respuesta a la aplicación del NMDA se
presenta en los primeros 30 segundos después de inyectada la droga, y el efecto tiene
una duración de aproximadamente 5 minutos, aunque ésta muestra una clara
dependencia de la concentración a la que se aplica la droga (Fig. 6), registrándose en
algunos casos respuestas con una duración de 20 minutos. Como se esperaba, la curva
concentración efecto, presenta una forma sigmoidea con una dosis media efectiva
(DE50) de aproximadamente 300 µM (Fig. 7). A concentraciones de 1 y 10 µM,
prácticamente no hay incremento sobre la descarga basal, pero a concentraciones
mayores el NMDA induce un efecto excitador significativo de la actividad basal. Cabe
destacar que la relación concentración-efecto del NMDA muestra una pendiente muy
grande para concentraciones entre 0.1 y 1 mM.
Interacciones entre NMDA y Mg++
Para ver el efecto del Mg++ sobre la descarga evocada por el NMDA, se realizaron 6
experimentos en los que hicieron 31 aplicaciones de NMDA (1-1000 µM) sobre la
preparación perfundida con Ringer con 1 o 3 mM de Mg++. El aumento en el Mg++
extracelular produjo una disminución de las respuestas inducidas por el NMDA.
Este efecto también mostró ser dependiente de la concentración, ya que la perfusión
con Ringer con 3 mM de Mg++, causa un desplazamiento significativo de la curva
dosis-efecto del NMDA, mientras que con 1 mM, el Mg++ induce un decremento de la
respuesta al NMDA, el cual no es significativo (Fig. 7).
26
Curva dosis-efecto del NMDA a diferentes concentraciones de Mg+ en el perfusado
Figura 7. Curva concentración efecto del NMDA (N=69) sobre la actividad basal
de las aferentes vestibulares. En Ringer libre de Mg++, el NMDA produce un
efecto dosis dependiente con una DE50 de aproximadamente 0.3 mM. Cuando
se añadió MgCl2 1 o 3 mM al Ringer con que se perfunde la preparación, las
respuestas evocadas por el NMDA disminuyeron hasta en 10 y 50%
respectivamante, indicando que al igual que en otras preparaciones, el Mg++
ejerce un efecto inhibidor sobre las respuestas evocadas por el NMDA. Los
puntos representan la media de 5 a 6 determinaciones ñ la desviación
estandar.
27
Interacciones entre NMDA y glicina
En 31 experimentos se estudió el efecto de la microperfusión (20 µl) de glicina en
concentraciones de 0.1, 1, 10, 100 µM, 1 y 10 mM sobre la descarga basal de las
aferentes vestibulares. En ningún caso, la microperfusión de glicina fue capaz de
evocar un incremento significativo de la actividad eléctrica multiunitaria basal de las
aferentes vestibulares, a excepción de una aplicación de 10 mM de glicina que produjo
un incremento visible de la actividad basal.
Para estudiar el efecto de la glicina sobre el NMDA, se realizaron dos tipos de
experimentos, en unos la glicina y el NMDA se perfundieron al mismo tiempo diluidas
en una misma solución (20 µl de cada una), n=20. En otro grupo de experimentos, la
glicina se perfundió de manera continua en el baño, n=54. En ambos tipos de
experimento se combinaron las concentraciones de ambas sustancias de tal manera
que se hicieron entre 4-6 pruebas para cada combinación. El procedimento estadístico
para estos experimentos fue el mismo que el empleado para la curva dosis-efecto del
NMDA. Los resultados obtenidos muestran que los dos tipos de aplicacion producen
esencialmente los mismos efectos. Con casi todas las concentraciones de NMDA con
glicina en el perfusado o en la pipeta de inyección, hubo un incremento en relación a la
descarga inducida por NMDA (fig 8). Es decir que tomando como control la respuesta
de cada una de las concentraciones de NMDA, el efecto a esta misma concentración de
NMDA pero con glicina en el medio, fue mayor, excepto en el caso de NMDA 10 mM
con glicina 0.001 µM, en la que obtuvimos una inhibición del efecto del NMDA.
Además de modificar la amplitud de la respuesta excitadora inducida por el NMDA, la
glicina parece modificar también la duración del efecto del NMDA, prolongando el
tiempo de descarga de manera dosis dependiente. La glicina 1 µM produce en
promedio una incremento de alrededor del 30% en la duración del efecto del NMDA 0.1
y 1 mM (tomando como tiempo de duración de la respuesta desde que el efecto es
evidente hasta que la descarga basal retorna al valor control).
28
Gráfica concentración-efecto de la glicina sobre la descarga evocada por NMDA
Figura 8. Gráfica concentración-efecto de NMDA en presencia de diferentes
concentraciones de glicina. Cada una de las barras es la combinación de NMDA
aplicado en microperfusión y en el perfusado. Cada barra representa la media y el error
estandard de 4-6 pruebas. La gráfica esta normalizada respecto a la magnitud de la
descarga producida por NMDA 0.01 mM y glicina 1 nM.
Como se ve, la decarga evocada por NMDA en presencia de glicina a las
concentraciones indicadas, es mayor que NMDA solo, sin embargo estadisticamente
esta diferencia no es significativa. El mayor incremento porcentual fue registrado
cuando se aplicó NMDA 1 µM y glicina 0.01 µM pues la respuesta con glicina aumenta
significativamente respecto a su valor control en más del doble, mientras que a dosis
mayores de NMDA el efecto de la glicina es mínimo. La gráfica muestra que no hay una
buena correlación entre la concentración de glicina y el aumento en la respuesta al
NMDA. Esto probablemente es debido en parte a la gran variabilidad que se observa en
29
los resultados. En términos generales nuestros resultados sugieren que la glicina ejerce
un efecto modulador favorable solo para las concentraciones muy bajas de NMDA .
Efectos del APV
En 21 experimentos se estudió el efecto del APV sobre la actividad basal de las
aferentes. El APV en concentraciones de 0.01 a 10 mM indujo una disminución
reversible y dependiente de la concentración de la actividad basal (Fig. 9). La inhibición
inducida por el APV sobre la descarga basal tiene una DI50 de aproximadamente 1
mM. La duración de su efecto inhibidor también depende de la concentración. Para las
concentraciones usadas fluctúa entre 3 y 10 minutos.
El efecto inhibidor del APV sobre la descarga espontanea puede calificarse como de
poca potencia cuando se le compara con la inhibición producida por el ácido kynurénico
o la estreptomicina (Soto y cols, 1988; Soto y cols., 1990). Pensamos que esto podría
deberse a que aunque el APV es considerado como antagonista específico de los
receptores NMDA, el hecho de que la dosis requerida para obtener un inhibición
significativa sea tan alta, 1 mM, sugiere que su acción es inespecífica, y podria estar
actuando sobre los otros tipos de receptores. Esta acción inespecífica lleva a pensar
que la descarga basal no es mediada por receptores NMDA, sino principalmente por
receptores tipo AK y AQ.
Cuando se perfundieron conjuntamente el APV y el NMDA (N=16), se encontró que el
APV bloquea la excitación inducida por el NMDA. Cabe destacar que el efecto
antagonico del APV no se logró contrarrestar aún con concentraciones máximas
efectivas de NMDA, lo que sugiere que el receptor NMDA del órgano vestibular, podría
ser del subtipo que tiene preferencia por los antagonistas (Olverman y Watkins., 1989).
30
EFECTO DEL APV Y 7ClKyn Y CURVA DOSIS-RESPUESTA
Figura 9. Gráficas de frecuencia contra tiempo y curva dosis efecto de APV y 7ClKyn.
En A y B los efectos típicos de la aplicación de 20 µl de ambos antagonistas a
concentración de 1 mM. El efecto se inicia lentamente y es de larga duración (5 min
para el APV, 10 min para el 7ClKyn). En C, curvas concentración efecto.
31
Efectos del 7ClKyn
Se estudió el efecto de la microperfusión de 7ClKyn 0.01 a 10 mM en 8 experimentos.
El 7ClKyn produce una disminución reversible de la actividad basal de las aferentes
vestibulares, dependiente de la concentración y con una DI50 de alrededor de 0.1 mM.
El efecto inhibidor del 7ClKyn se inicia rápidamente y alcanza su máximo
aproximadamente 1 minuto después de su aplicación, regresando posteriormente al
nivel de descarga basal en aproximadamente de 10 minutos (Fig. 9).
El 7ClKyn bloquea de manera dosis dependiente la respuesta provocada por el NMDA
1 mM, y es aproximadamente 10 veces más potente que el APV. Probablemente el
efecto
inhibitorio del 7ClKyn se deba en parte a su efecto sobre el receptor AK, ya que a pesar
de que se ha propuesto que es un antagonista específico del sitio de glicina en el
receptor NMDA (Kemp y cols, 1988), en nuestra preparación el 7ClKyn 0.5 mM también
bloquea completamente la respuesta inducida por el ácido kaínico 0.1mM (fig. 11), lo
que concuerda con otros reportes (McNamara y cols., 1990).
32
EFECTO DEL 7-CLORO-KYNURENICO SOBRE LA ACCION DEL ACIDO KAINICO
Figura 10. Gráfica frecuenca contra tiempo que muestra el efecto inhibidor de 7- cloro
kynurénico 0.5 mM sobre las respuesta inducida por el ácido kaínico 0.1 mM. A los dos
minutos de registro se aplicó el AK y 10 segundos despés el 7ClKyn. Vease como el
7ClKyn bloquea total e inmediatamente el efecto de AK. Al minuto siete la gráfica se
interrumpe y reinicia cerca de 20 minutos después mostrando la reversibilidad de los
efectos.
7-Clkyn y D-serina
Para investigar la especificidad del 7ClKyn sobre el sitio de glicina, aplicamos 7ClKyn 1
mM en presencia de glicina, y encontramos que esta última es incapaz de evitar o
revertir el efecto inhibitorio del 7ClKyn aun perfundiendo a concentraciones
equimolares. Una razon por la que la glicina no podría revertir el efecto del 7ClKyn, es
que podría ser activamente capturada por los tejidos del oído interno, disminuyendo así
33
su concentración efectiva. Por esta última razón es que decidimos sustituir en estos
experimentos la glicina
INTERACCION DE LA D-SERINA Y EL 7-CLORO-KYNURENICO
Figura 11. Efecto de la D-serina sobre la inhibición de la descarga basal,
producida por el 7ClKyn. La primera gráfica muestra el efecto de la aplicación de
NMDA (control). Posteriormente se perfundió 7ClKyn, y se repitió la aplicación de
NMDA. Finalmente se perfundieron 7-KClKyn y D-serina. Véase que en ésta
última la preparación responde a la aplicación de NMDA.
34
por la D-serina, la cual ha sido descrita como un agonista potente del sitio de glicina, y
además no es un substrato adecuado para el sistema de transporte de alta afinidad.
Con la perfusión de 10 µM de D-serina, el efecto inhibitorio del 7ClKyn, tanto sobre la
actividad basal como la descarga evocada por el NMDA, fue revertido (Fig 11).
Esto sugiere que la D-serina tiene una mayor afinidad por el sitio de glicina del receptor
NMDA, y probablemente también por los otros receptores a AAE, ya que la actividad
basal de las aferentes primarias está mediada principalmente por receptores no NMDA.
Sin embargo esto no descarta la posibilidad de que la incapacidad de la glicina en
revertir el efecto del 7ClKyn, se deba a la baja afinidad de ésta por el receptor, y no a su
captura. Más bien apunta al hecho de que la D-serina podria ser el neurotransmisor
endógeno para el sitio de glicina.
DISCUSION
Nuestros resultados indican que el NMDA ejerce un efecto excitador sobre la actividad
eléctrica de las aferentes provenientes de los canales semicirculares. Esto apoya la
hipótesis de que el receptor NMDA también participa en la neurotransmisión en la
sinapsis aferente del órgano vestibular. El efecto del NMDA es dependiente de la
concentración y es bloqueado por el aumento en la concentración del Mg++
extracelular. Por otra parte la glicina no tiene efecto por si misma sobre la actividad
basal de las aferentes. Sin embargo, cuando se aplica conjuntamente con el NMDA,
potencia el efecto excitador de este último, aunque esta potenciación no muestra una
buena correlación con respecto a la concentración de glicina utilizada. El APV y el
7ClKyn inducen una disminución de la actividad basal de las aferentes vestibulares, y
también disminuyen el efecto excitador del NMDA. En conjunto, estos resultados
apoyan la hipótesis de que en la sinapsis aferente vestibular existen receptores tipo
NMDA, los cuales al igual que en el SNC son bloqueados por el Mg++ extracelular y
modulados positivamente por glicina.
35
El efecto excitador obtenido con NMDA difiere significativamente del que inducen el AK
y el AQ. El NMDA es aproxiamdamente 1000 veces menos potente que el AK y AQ. El
efecto del AK en las aferentes vestibulares se caracteriza por una rápida excitación
seguida de un período inhibitorio. El efecto del AQ es un poco más lento, pero también
de corta duración, no más de 5 minutos, en cambio, el NMDA induce una excitación que
se inicia lentamente y permanece elevada por varios minutos volviendo al nivel basal
muy lenamente. Indudablemente estas diferencias pueden deberse a la farmacocinética
particular de cada droga, ya que para alcanzar la región sináptica estas sustancias
deben difundir a través del epitelio de los canales. En el caso particular del AK se ha
pensado que podría activar receptores extrasinápticos, lo cual explicaría la corta
latencia en el inicio de su efecto. Sin embargo, también estas diferencias pueden
deberse a propiedades en el tipo de corrientes iónicas que se activan al unirse el
agonista al receptor. De hecho se ha encontrado mediante la técnica de clamp de
voltaje que las corrientes iónicas debidas a la activación de receptores tipo NMDA son
más lentas, pero de mayor intensidad y duración que aquellas inducidas por la
activación de receptores no NMDA.(Johnson y Ascher, 1987).
Los resultados obtenidos cuando se perfunde con glicina añadida al Ringer, muestran
que efectivamente la glicina potencia la respuesta de las aferentes al NMDA, aunque
nuestros resultados son variables. Creemos que esta variabilidad se debe a que todos
los tejidos son particularmente ricos en glicina, y el tejido lesionado durante la disección
y el no lesionado liberan glicina al medio, por lo que cuando se aplica el NMDA la
concentración de glicina sobrepasaría la requerida (del orden de nanomolar) por los
receptores NMDA, así los sitios de glicina ya estarían ocupados, y esta ocupación
diferiría de un experimento a otro probablemente en función de la masa de tejido de la
preparación. Esta variabilidad también es observada en experimentos de células
aisladas, ya que el efecto de la glicina es claramente observado solo si se lleva a cabo
una perfusión rápida (Johnson y Ascher, 1987). Pensamos que ésta es la causa de la
variabilidad que hemos observado, y de la falta de correlación entre la concentración de
glicina que administramos y la potenciación de la respuesta al NMDA. Si suponemos
que los receptores involucrados en la respuesta de las aferentes vestibulares al NMDA
36
son similares a los que se han reportado en la literatura, y si como se postula, la glicina
es un requerimiento absoluto del receptor NMDA (Kleckner y Dingledine, 1988),
nosotros al aplicar NMDA sin glicina en el Ringer, no deberíamos obtener ninguna
respuesta, sin embargo aplicando concentraciones de 0.1 y 1M, siempre registramos un
aumento significativo en la frecuencia de descarga, lo cual implica que existen al menos
trazas de este u otro aminoácido similar en la preparación.
También nuestros resultados muestran que a dosis mayores de NMDA, el efecto de la
glicina sobre la respuesta es menor, y esto probablemente se deba a que estas
concentraciones (1 y 10 mM) son dosis de saturación como se ve en la gráfica dosis
efecto del NMDA. A estas concentraciónes, el incremento producido por la glicina sobre
la descarga evocada por NMDA es muy difícil de observar, ya que probablemente la
mayor parte de los receptores esten activos con la consiguiente despolarización de las
fibras, lo que da un registro de frecuencia alto, y la glicina aunque esté presente a
concentraciones altas, no afectaría mayormente a la frecuencia de disparo. Así a
medida que se aumenta la concentración de glicina, el efecto de ésta también es menor
por que la dosis de saturación de la glicina para el receptor NMDA es de 1 µM,
concentración con la que obtuvimos las máximas respuestas.
Como se esperaba, la excitación inducida por el NMDA en las aferentes vestibulares
está en relación inversa con la concentración extracelular de Mg++. Esto indica que los
receptores que median la respuesta al NMDA comparten esta propiedad con los que se
han descrito en otras áreas del SNC en vertebrados. Cabe mencionar sin embargo, que
la modulación por Mg++ extracelular es mucho menor en comparación con los
resultados de clamp de voltaje en células aisladas reportados por otros autores (Nowak
y cols, 1984; Mayer y cols., 1984). El Mg++ en concentración 1 mM tiene muy poco
efecto sobre las respuestas inducidas por el NMDA, y su acción inhibidora se hace
patente solo cuando el medio contiene concentraciones de Mg++ de 3 mM o mayores.
Este resultado que en un principio nos hizo pensar que los receptores para NMDA en
el vestíbulo no eran sensibles a la concentración extracelular de Mg++, parece
37
reproducirse en otros sistemas. Un análisis más cuidadoso de la bibliografía nos ha
mostrado que son pocos los sistemas en los que se han hecho curvas dosis efecto del
NMDA en presencia de diferentes concentraciones de Mg++, y que como ya anotamos,
casi todos los reportes de la literatura se refieren a células aisladas. Una posible
explicación para las discrepancias que se observan en el efecto del Mg++ entre los
experimentos de clamp de voltaje en células aisladas y los experimentos como los
nuestros en sistemas y tejidos aislados, puede ser el hecho de que el efecto del Mg++
depende del potencial de membrana, y por tanto en preparaciones como la nuestra que
están sometidas a una constante activación sináptica y consecuente generación de
potenciales
excitatorios
postsinápticos,
el
efecto
del
Mg++
se
reduce
considerablemente. Por otra parte cuando se trabaja con sistemas aislados,
particularmente en el registro multiunitario, las mediciones de los eventos son indirectas
(por ejemplo nosotros medimos el número de espigas, las cuales son suma de varios
potenciales de acción), y el número de variables que no se pueden controlar y que
intervienen en las respuestas es mucho mayor. Así en el caso nuestro el Mg++ no
solamente afecta al receptor NMDA, sino también a las células ciliadas, las fibras
nerviosas y las terminaciones dendriticas.
Los efectos del NMDA no son de tipo inespecífico, debidos a cambios en el pH o algún
otro factor, ya que la presencia de un segundo ácido como el APV bloquea
completamente y de manera reversible el efecto del NMDA. El APV bloquea la
respuesta inducida aún por dosis máximas efectivas de NMDA, lo que sugiere alta
especificidad para este receptor, sin embargo aun aplicando dosis máximas de APV no
se consigue bloquear totalmente la descarga espontanea. Esto sugiere que los
receptores NMDA son responsables de solo parte de la descarga espontanea de las
aferentes vestibulares y más bién podrían participar en la generación de la descarga
evocada (Guth y cols. 1990). Sin embargo los experimentos en los que se ha estudiado
el efecto del APV sobre la respuesta evocada por estimulación (Soto y cols., 1988),
demuestran que el APV no bloquea la respuesta ante estímulos mecánicos,
(inclinaciones). Esto indica que los receptores tipo NMDA no participan en la respuesta
evocada del órgano vestibular, lo que apoya la idea de que estos receptores más bien
38
participen en la generación de la descarga tónica espontánea, y probablemente también
en procesos plásticos y tróficos sobre las aferentes vestibulares (McDonald y Johnston,
1990; Choi, 1990).
Por otra parte, la inhibición de la descarga basal producida por el 7ClKyn podría
deberse a que efectivamente el 7ClKyn actúe sobre el sitio de glicina desplazando a
esta última y de esta manera modularía negativamente al receptor NMDA, inhibiendo
así, como dijimos anteriormente, parte de la descarga espontanea. Esta interpretación
se basa en que tanto, el APV como el 7ClKyn, han sido propuestos como antagonistas
específicos para el sitio NMDA y para el sitio de glicina respectivamente en este mismo
receptor (Kemp y cols, 1988; Watkins y Olverman, 1987).
Sin embargo el 7ClKyn es capaz de bloquear completamente la actividad espontanea,
de la cual la mayor parte no puede ser explicada por el bloqueo sobre el receptor
NMDA, como lo demuestra el debil efecto del APV. Los resultados obtenidos con el
7ClKyn, que se hallan en contradicción con lo que se ha reportado en la literatura,
pueden deberse a varios factores, sin embargo la posibilidad que nos parece más
plausible es que realmente el 7ClKyn se comporte como un antagonista inespecífico de
los receptores a los AAE, ya que se reporta que en experimentos de clamp de voltaje
en ovocitos de Xenopus, el 7CLKyn es solamente 40 veces más específico por el sitio
de glicina que por el receptor AK (McNamara y cols., 1990). De esta manera, la
inhibición total de la descarga espontanea producida por el 7ClKyn, creemos que es
debida a que el 7ClKyn actúe compitiendo con el neurotransmisor natural por el
receptor AK, ya que nuestros propios resultados demuestran que en nuestras
condiciones experimentales y a las concentraciones usadas, el 7ClKyn se comporta
como un potente antagonista de las respuestas inducidas por el AK. De todo ello se
desprende que debe tenerse cautela al interpretar el efecto de los antagonistas ya que
su especificidad no siempre es tan alta como puede inferirse a partir de datos en otras
preparaciones.
39
Los experimentos en los que se perfundió D-serina confirman la presencia del sitio de
glicina en los receptores NMDA. Por otro lado aunque el efecto del 7ClKyn es
inespecífico, su acción sobre el sitio de glicina parece ser clara, ya que el efecto del
NMDA es revertido en presencia de d-serina. El hecho de que sea la D-serina y no la
glicina la que revierta el efecto del 7ClKyn, sugiere que el sitio de glicina en los
receptores NMDA del vestíbulo son más afines a la D-serina, pues se considera que
ambas tienen la misma potencia para revertir el efecto del 7ClKyn, (Brugger y cols.
1990), y por lo tanto posiblemente también la potenciación del efecto del NMDA sea
mayor con D-serina que la que obtuvimos con glicina. Por otra parte el efecto de la Dserina en revertir el efecto del 7ClKyn sobre la actividad basal, indica que la d-serina
también es inespecífica en términos de farmacocinética pero no en su acción
farmacológica, pues es capaz de desplazar al 7ClKyn de los receptores no NMDA, pero
no tiene efecto sobre estos.
Debido a que nuestros registros son multi-unitarios, no es posible definir si los
receptores tipo NMDA, AQ y AK coexisten en una misma fibra aferente. A pesar de
esto, es importante tratar de definir el papel funcional que cada tipo de receptor tiene en
la codificación de la información vestibular. Por los efectos que inducen, creemos que
los receptores tipo NMDA median respuestas lentas y de larga duración, en tanto los de
AK y AQ, respuestas rápidas y de corta duración. Esta diferencia podría ser debida al
rol fisiológico que cada uno de los subtipos de receptores a AAE desempeña en las
sinapsis aferentes vestibulares. Así, para explicar la descarga espontánea de esta
sinapsis se ha postulado, en base a algunas evidencias, que el neurotransmisor de esta
sinapsis tiene también acción presináptica, es decir sobre las células ciliadas (Prigioni y
cols., 1990), dando lugar a un sistema de autorreceptor, similar al descrito para
neuronas de hipocampo (Martín y cols., 1991; Bliss y Lynch., 1986). En este sentido, los
efectos de larga duración del NMDA en el vestíbulo, podrían ser parte de este sistema,
pues el canal asociado es permeable a Ca++ y permanece largo tiempo abierto, de
manera que el Ca++ entraría a las células ciliadas desencadenando los eventos
intracelulares como es la liberación de calcio intracelular, (McDermott y Dale, 1987;
Lynch y Voss., 1991), el cual produciría una liberación sostenida de neurotransmisor
40
dando lugar así a la descarga tónica espontánea, y a su vez el neurotransmisor liberado
actuaría otra vez sobre los receptores presinápticos conformando un sistema de
retroalimentación positiva modulado por el Mg++, la glicina, el ácido kynurénico, las
poliaminas etc.
Otra posibilidad para explicar esta diferencia, es la de que algunas fibras aferentes
podrían tener principalmente receptores tipo AK o AQ dando una respuesta rápida,
mientras que otras contendrían mayor número de receptores NMDA dando respuestas
más prolongadas. Para dilucidar esta y otras interrogantes será necesario llevar a cabo
experimentos que nos permitan contestar cuestiones más específicas y a mayor
profundidad dentro la fisiología del oído interno.
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BIBLIOGRAFIA
Aebischer, B., Frey, P., Haerter, H.P., Herrling, P.L., Mueller, W., Olverman, H.J. y
Watkins, J.C. (1989) Synthesis and NMDA anatgonistic properties of the enantiomers of
4-(3-phosphonopropyl)piperazine-2-carboxylic acid (CPP) and of the unsaturated
analogue (E)-4-(3-phosphonoprop- 2-enyl)piperazine- 2-carboxylic acid (CPP-ene).
Helvetica Chimica Acta 72, 1043-1051.
Annoni J.M., Cochran S.L. y Precht W. (1984) Pharmacology of the vestibular hair cell
afferent fiber synapse in the frog. Journal of Neuroscience. 4, 2106-2116.
Adamson, P., Hajimohammadreza, I., Brammer, M.J., Campell, I.C. y Meldrum, B.S.
(1990). Presynaptic glutamate/quiscualate receptors: Effects on synaptosomal free
calcium concentrations. Journal of Neurochemistry 55, 1850-54.
Ascher, P. y Johnson, J.W. (1989) The NMDA receptor, its channel and its modulation
by glycine. en: Watkins, J.C., Collingrade, G.L. (1989) The NMDA Receptor. IRL press.
Ascher, P. y Nowak L. (1987) Electrophysiological studies of NMDA receptors. TINS. 10,
284-288.
Bernard, C., Cochram, S.L. y Precht, W. (1985) Presynaptic action of cholinergic agents
upon the hair cell-afferent synapse in the vestibular laberynth of the frog. Brain Res.
338, 225-236.
Bliss, T.V.P. y Lφmo, T. (1973) Long lasting potentiation of synaptic transmission in the
dentate area of the anaesthetized rabitt following stumulation by the perforant path.
Journal Physilogy. 232, 331-356
Boyle, R, Carey, J.P. y Highstein, S.M. (1991) Morphological correlates of response
dynamics and efferent stimulation in horizontal semicircular canal afferents of the
toadfish, Opsanus tau. Journal of Neurophysiology. 66, 5, 1504-1521.
Brugger, F., Wicki, U., Nassentein-Elton D., Fagg,G.U., Olpe, H. y Pozza, M.F. (1990)
Modulation of the NMDA receptor by D-serine in the cortex and the spinal cord, in vitro.
European Journal of Pharmacology. 191, 29-38.
Brugger, F., Evans, R.H. y Olpe, H., (1998) The effects of excitatory aminoacids
antagonists and capsaicin on spinal reflexes of the rodent recorded in vitro. Journal of
Physiology. 401, 59P.
Canton, H., Colpaert, F. y Lehmann, J. (1989) Polyamine activation of NMDA effector
requires occupation by agonists of both glycine and NMDA. Soc. Nsci. Abs. 15, 133.7.
Choi, D.W. (1990) Cerebral hypoxia: some new approaches and unanswered questions.
J. Neurosci. 10, 2493-2501.
42
Cochram Willam, G. y Cox Gertrude, M. (1980) Diseños experimentales . Ed. Trillas,
México.
Collingride, G.L. y Bliss, T.V.P., (1987) NMDA receptors- their role in long term
potentiation TINS, 10, 7.
Collingride, G.L., Kehl, S.J. y McLennan, H., (1983) Excitatory aminoacids in synaptic
transmission in the schaffer. Journal of Physiology. 334, 33-46
Contreras, P.C., Monahan, J.B., Lanthorn, T.H., Pullan, L.M., DiMaggio, D.A.,
Handelmann, G.E., Gray, N.M. y O'Donohue, T.L. (1987): Phencyclidine. Molecular
Neurobiology. 1, 191-211.
Cotman, C.W., e Iversen, L.L. (1987) Excitatory amino acids in the brain-focus on NMDA
receptors. TINS. 10, 263-267.
Curtis, D.R. y Eccles, R.M. (1958a) The excitation of Renshaw cells by pharmacological
agents applied electrophoretically. Journal of Physiology 141, 446-463.
Curtis, D.R., Phillis, J.W. y Watkins, J.C. (1960) The chemical excitation of spinal
neurones by certain acidid aminoacid. Journal of Physiology 150, 656-682.
Curtis, D.R. y Watkins, J.C. (1960) The excitation and depression of spinal neurones by
structurally related amino acids. Journal of Neurochemistry 6, 117-141.
Curtis, D.R. y Watkins, J.C. (1963) Acidic amino acids with strong excitatory actions on
mamalian neurones. Journal of Physiology 166, 1-14
Davies, J. y Watkins, J.C. (1981) Pharmacology of glutamate and aspartate antagonists
on cat spinal neurones. en: DiCHIARA y GESSA. Glutamate as a Neurotransmitter.
Raven Press, Nueva York, 275-284.
Davies, J., Evans, R.H., Herrling, P.L., Jones, A.W. Olverman, H.J., Pook, P. y Watkins,
J.C. (1986) CPP, a new and selective NMDA antagonist. Depression of central neuron
responses, affinity for [3H]D-AP5 binding sites on brain membranes and anticonvulsant
activity. Brain Res. 382, 169-173.
Dechesne, C. y Sans, A. (1980) Control of vetibular activity by the efferent system in the
cat. Acta Otolaryngol. 90,82-85.
DiChiara y Gessa (1981) Glutamate as a Neurotransmitter. Raven Press, Nueva York,
275-284.
Do, K.Q., Herrling, P.L., Streit, P., Turski, W.A. y Cuenod, M. (1986) In vitro release and
electrophysiological effects In situ of homocysteic acid, an endogenous N-Methyl-Daspartic acid agonist, in the mammalian striatum. Journal of Neurosciences. 6, 2262234.
43
Drejer, J., Sheardown, M., Nielsen, E.O. y Honor‚ T. (1989) Glycine reverses the effect
of HA-966 on NMDA responses in cultured rat cortical neurons and in chick retina.
Neurosciences. Letters. 98, 333-338.
Drescher, J.M., Drescher, G.D. y Medina, J.E. (1983) Effect of sound stimulation at
several levels on concentrations of primary amines, including neurotransmitter
candidates, in perilinph of the guinea pig inner ear. Journal of Neurochemistry. 41, 309319.
Dunlop, J., Grieve, A., Schousboe, A. y Griffiths, R. (1989) Neuroactive sulphur amino
acids evoke a calcium dependent transmitter release from cultured neurones that is
sensitive to excitatory amino acid antagonists. Journal Neurochem. 52, 1648-1651.
Engstrom, H. y Engstrom, B. (1981) The structure of the vestibular sensory epithelia. en:
Gualtierotti T. The vestibular system: function and Morphology. Springer-Verlag, Nueva
York, 3-37.
Fagg, G.E.,Lanthorn, T.H., Foster, A.C.,Maier, L., Dingwall, J., Lane, J.D. y Matus, A.
(1986) Discrimination of excitatory amino acid receptors sub-types using radioligand
binding techniques. En Roberts, P.J. Excitatory Amino Acids. MacMillan Press.
Foster, A.C. y Fagg, G.E. (1984) Acidic amino acid binding sites in mammalian neuronal
membranes: their characteristics and relationship to synaptic receptors. Brain Res.
Revs. 7, 103-164.
Foster, A.C. y Fagg, G.E. (1987) Comparison of L-[3H] glutamate, D-[3H] aspartate, DL[3H]AP5 and [3H]NMDA as ligands for NMDA receptors in crude postsinaptic densities
from rat brain. European Journal of Pharmacology. 133, 291-300.
Foster, A.C. y Fagg, G.E. (1987) Taking apart NMDA receptors. Nature. 329, 395-396.
Foster, A.C., Kemp, J.A., Grimwood, S., Wong, E.H.F. y Fagg, G.E. (1987)
Investigations of N-MDA receptors using radioligands binding techniques. Excitatory
Amino Acid Transmission. Alan R. Liss, Nueva York, 107-114.
Gacek, R.R. (1981) The afferent and efferent vestibular pathways: morphologis aspects.
en: Gualtierotti T. The vestibular system: function and Morphology. Springer-Verlag,
Nueva York, 38-63.
Goldberg, J. y Fernandez, C. (1980) Efferent vestibular system in the squirrel monkey:
Anatomical location and influence on afferent activity. J. Neurophysiology. 43,986-1025.
38-63.
Greenberg, D.A. y Marks, S.S. (1988) Cation interactions with putative NMDA receptor
gated channels labeled by [3H]MK-801 in rat cerebral cortex. Neurosciences. Lett. 95,
236-240.
44
Guth, P.S., Aubert, A., Ricci, A. y Norris, C.H. (1991) Differential modulation of
spontaneous and evoked neurotransmitter release from hair cells: some novel
hypotheses. Hearing Research, 56, 69-78
Guth, P.S. Norris, C.H. Guth, S.L. Quine, D.B. y Willams, W.H. (1986) Cholinomimetics
mimic afferent effects on semicurcular canal afferent activity in the frog. Acta
Otolaringol. 102, 186-194.
Hamilton, D. (1968) The calyceal Synapse of type I vestbular hair cells. J. Ultrastructure
Research. 23, 98-114.
Harris, E.W., Ganong, A.H. y Cotman, C.W. (1984) Long term potentiation involves
activation of N-Metil-D-Aspartate receptors. Brain Research 323, 132-137
Harris, E.W., Stevens, D.R. y Cotman, C.W. (1987) Hippocampal cells primed with
quisqualate are depolarized by AP4 and AP6, ligands for putative glutamate uptake site.
Brain Research. 418, 361-365.
Hashim, M.A., Bolger, G.T. y Bieger, D. (1989) Modulation of solitarial deglutitive Nmethyl-D-aspartate receptors bu dihydropyridines. Neuropharmacology. 28, 923-929.
Homma, S. (1983) Physiology and pharmacology of putative transmitters in lamprey
central nervous system. Progress in Neurobiology. 20, 287-311.
Honore, T., Davies, S.N., Drejer, E., Fletcher, E.J., Jacobsen, P., Lodge, D. y Nielsen,
F.E. (1987): Potent and competitive antagonism at non-NMDA receptors by FG 9041
and FG 9065. Soc. for Neurosci. Abstr. 13, 383.
Howard, J., Roberts, W.M. y Hudspeth, A. J. (1988): Mechanoelectrical transduction by
hair Cells. Biophysic Chemical 17.
Hudspeth, A.J. (1983) Mechanoelectrical transduction by hair cells
acusticolateralis sensory system. Annual Review of Neuroscience. 6,187-215.
in
the
Jackson, H. y Usherwood. (1988) Spider toxins as tool for dissecting elements of EEA
transmission. Trends in Neurosciences. 11, 268- 272.
Jenison, G.L., Bobbin, R.P. y Thalman, R. (1985) Potassium-induced release of
endogenous amino acids in the guinea pig cochlea. Journal of Neurochemistry. 44, No
6, 1845-1853.
Johnson, F. y Ascher, P. (1987) Glycine potentiates the NMDA response in cultured
mouse brain neurons. Nature 325, 529-531.
Kemp, J.A., Foster, A.C., Leeson, P.D., Priestley, T., Tridgett, R., Iversen, L.L. y
Woodruff, G.N. (1988) 7-Chlorokynurenic acid is a selective antagonist at the glycine
modulatory site of the N-methyl-D-aspartate receptor complex. Proc. Natl. Acad. Sci. 85,
6547-6550.
45
Kemp, J.A., Foster, A.C. y Wong, H.F. (1987) Non competitive antagonists of excitatory
amino acid receptors. Tins.10, 294-298.
Kessler, M., Baudry, M. y Lynch, G. (1989) Quinoxaline derivatives are high affinity
antagonists of the NMDA receptor associated glycine sites. Brain Research. 489, 377382.
Kleckner, N. y Dingledine, R. (1988) Requirement for glycine in activation of NMDA
receptors expressed in Xenopus Oocytes. Science. 241, 835-837.
Klinke, R. (1986) Neurotransmission in the ear. Brain Research 22, 235-243.
Lehmann, J., Loo, P., McPherson, S., French-Mullen, J.M.H., Steel, D., Braunwalder, A.,
Williams, M. y Wood, P.L. (1987) NMDA- and PCP receptor interactions. En Excitatory
amino acid transmission. (Eds.) Hicks, T.P., Lodge, D. y McLennan, H., Alan R. Liss,
Inc., New York, pp 91-98.
Lynch, M.A. y Voss, K.L. (1991) Presynaptic changes in long term potentiation: elevated
synaptosomal calcium concentration and basal phosphoinositide turnover in dentate
gyrus. Journal of Neurochemistry 56, 1, 113-118.
MacDermott, A.B. y Dale, N. (1987) Receptors ion channels and synaptic potential
underlying the integrative actions of excitatory amino acids. Tins. 10, 280-283.
MacDonald, J.W. y Johnston, M.V. (1990) Physiological and pathophysiological roles of
excitatory amino acids during central nervous system development. Brain Research.
Rev. 15, 41-70.
Martin, D., Bustos, G.A., Bowe, M.A., Bray, S.D. y Nadler, V. (1991) Autoreceptor
regulation of glutamate and aspartate release from slices of the hippocampal CA1 area
Journal of Neurochemistry 56, 5, 1647-1655.
Mayer, M.L. y Westbrook, G.L. (1987) The physiology of EAA in the vertebrate central
nervous system. Progress in Neurobiology 28, 197-276.
Mayer, M.L., Westbrook. G.L. y Guthrie, P.B. (1984) Voltage-dependent block by Mg++
of NMDA responses in spinal cord neuron. Nature. 309, 261-263.
McLennan, H. (1981) On the nature of the receptors for various EAA in the mamalian
central nervous system en: DiCHIARA, G. y GESSA, G.L. Glutamate as a
Neurotransmitter. Raven Press, New York, 253-262.
McLennan, H. (1987) Setting the scene: the EAA 30 years on. en: Hicks, Lodge y
McLennan. Excitatory Amino Acid Transmision. Alan R. Liss Inc. New York, 1-19.
McNamara, D., Smith, E.C.R., Calligaro, D.O., O'Malley, P.J.O., McQuaid, L.A. y
Dingledine, R. (1990) 5,7-Dichlorokynurenic acid a potent and selective competitive
antagonist of the glycine site on NMDA receptors. Neurosciences letters 120, 17-20
46
Medina, J.E. y Drescher, G. (1981) The amino acid content of perilymph and
cerebrospinal fluid from guinea-pigs and the effect of noise on the amino acid
composition of perilynph. Neuroscience. 6, 505-509.
Meza, G. (1985) Characterization of GABA-ergic and cholinergic neurotransmission in
the chick inner ear. en: DRESCHER, D. Auditory Biochemistry. Charles C Thomas,
Illinois, USA, 80-97.
Monahan, D.T, Bridges, R.J. Y Cotman, C.W. (1989) the Excitatory Amino Acid
Receptors: their classes pharmacology and distinct propietiesin the function of central
nervous system. Anual Review of Pharmacology and Toxicology. Vol 29 1989.
Monahan, D.T., Olverman, H.J., Nguyen, L. y Watkins, J.F. (1988) Two Classes of Nmethyl-D-aspartate Recognition Sites: Differential Distribution and Differential
Regulation by Glycine. Proc. Natl. Acad. Sci. 85. 9836-9840. USA.
Nowak, L., Bregestovsky, P., Ascher, P., Herbet, A. y Prochiantz, A. (1984) Magnesium
gates glutamate-activated channels in mouse central neurones. Nature. 307, 2, 462465.
Norris, C., Housley, G.D., Willians, W.H. y Guth, P.S. (1988) The acetylcholine receptors
of the semicircular canal in the frog (Rana Pipiens). Hearin Research, 32, 197-206.
Olverman, H.J., Jones, A.W. y Watkins, J.C. (1984) L-Glutamate has higher affinity than
other amino acids for '3H-D-AP5 binding sites in rat brain membranes. Nature. 307, 2,
460-462.
Olverman, H.J. y Watkins, J.C. (1989) NMDA agonist and antagonist in Watkins, J.C. y
Collingridge, G.L. The receptor NMDA. IRL Press. Oxford. Inglaterra.
Peters, S., Kohn, J. y Choi, D.W. (1987) Zinc selectively blocks the action of N-methylD-aspartate on cortical neurons. Science 236, 589-593.
Priestley, T., Woodruff, G.N. y Kemp, J.A. (1989) Antagonism of responses to excitatory
amino acids on rat cortical neurones by the spider toxin, argiotoxin 636. Br. J.
Pharmacol, 97; 1315-1323.
Prigioni, I., Russo, G. Valli, P. y Masetto, S. (1990) Pre- and postsynaptic excitatory
action of glutamate agonists on frog vestibular receptors. Hearing Research. 46, 253260.
Pullan, L.M.,Olney, J.W., Price, M.T., Compton, R.P., Hood, W.F.Michel, J. y Monahan,
J.B. (1987) Excitatory amino acid receptor potency and subclass specifity of sulfur
containing amino Acids. Journal of Neurochemistry. 49, 4, 1301-1307.
Ragsdale, D., Gant, D.B., Anis, N.A., Eldefrawi, A.T., Eldefrawi, M.E., Konno, K. y
Miledi, R. (1989) Inhibition of rat brain glutamate receptors by philanthotoxin. J.
Pharmacol. Exp. Ther. 251; 156-163.
47
Ransom, R.W. y Deschenes, N.L. (1990) Polyamines regulates glycine interaction with
the N-methyl-D-aspartate receptor. Synapse. 5, 294-298.
Ransom, R.W. y Stec, N.L. (1988) Cooperative modulation of [3H] MK-801 binding to
the N-methyl-D-aspartate receptor ion channel complex by L-glutamate, glycine and
polyamines. J. Neurochem. 51, 830-836.
Reynolds, I.J. y Miller, R.J. (1989) Ifenprodil is a novel type of N-Methyl-D-Aspartate
receptor antagonist: interaction with polyamines. Molecular Pharmacology 36, 758-765.
Shinozaki, H. (1988) Pharmacology of the glutamate receptor. Progress in
Neurobiology. 30, 399-435.
Shinozaki, H. e Ishida, M. (1981) Electrophysiological studies of kainate quiscualato and
ibotenate action on the crayfish neuromuscular juntion en: Dichiara, G. y Gessa, G.L.
Glutamate as a Neurotransmitter. Raven Press, Nueva York, 327-336.
Soto, E., Echague, J.V. y Vega, R.(1989) Computer program for statistical U-MANN
WHITNEY nonparametric analysis of neuronal activity. Computer Methods and Program
in Biomedicine.
Soto, E., Perez, M.E., Y Vega, R. (1990) Streptomycin blocks kainate and quisqualate
effects on the vestibular system primary afferents. En. Meldrum y Moroni. (Eds).
Excitatory amino acids, 1990. Fidia Symposium Research Series. Vol. III. Raven Press,
New York, en prensa.
Soto, E. y Vega, R. (1987) A turbo Pascal program for on line spike data acquisition and
analysis using a standard serial port. Journal of Neuroscience Methods. 19, 61-68.
Soto, E. y Vega, R. (1988) Actions of EAA agonists and antagonists on the primary
afferents of the vestibular system of the axolotl. Brain Research. 462, 104-111.
Stone, T.W. y Burton, N.R. (1987): NMDA receptors and ligands in the vertebrate CNS.
Prog. in Neurobiol. 30, 333-368.
Sugiyama, H., Ito, I. e Hirono, C. (1987) A new type of glutamate receptor linked to
inositol phospholipid metabolism. Nature 325; 531-533.
Takeuchi, A. y Takeuchi, N. (1964) The effect on crayfish muscle of iontophoretically
applied glutamate. J. Physiol. 170, 296-317.
Thalmann, R., Comegys, T.H. y Thalmann, I. (1981) Amino acid profiles in inner ear
fluids and cerebrospinal fluid. Laryngoscope. 92, 21-327.
Valli, P., Zucca, G., Prigioni, I., Botta, L., Casella, C. y Guth P.S. (1985) The effect of
glutamate on the frog semicircular canal. Brain Research. 330, 1-9
48
Watkins, J.C. (1978) Excitatory amino acids. en: McGEER. Kainic acid as a tool in
Neurobiology. Raven Press. Nueva York. 37-69.
Watkins, J.C. (1984) Excitatory aminoacids and central synaptic transmission. TIPS. 5,
9, 373-376.
Watkins, J.C. (1989) The NMDA receptor concept: origins and development. En:
Watkins, J.C. y Collingridge, G.L. The NMDA Receptor IRL press.
Watkins, J.C., Davies, J., Evans, R.H., Francis, A.A. y Jones, A.W. (1981)
Pharmacology of receptors for EAA en: DiChiara G. y Gessa G.L. Glutamate as
Neurotransmiter. Raven Press, Nueva York, 263-273.
Watkins, J.C. y Evans, R.H. (1981) Excitatory amino acids transmitters. A. Rev.
Pharmacology, Toxicology. 21, 165-204.
Watkins, J.C., Evans, R.H., Mewet, K.N., Olverman, H.J. y Pook, P.C. (1987) Recent
advances in the pharmacology of EAA. en: HICKS, LODGE y McLENNAN. Excitatory
Amino Acid Transmission. Alan R. Liss Inc,Nueva York, 19-26.
Watkins, J.C., Krogsgaard-Larsen, P. y Honoré‚ T. (1990) Structureactivity relationships
in the developement of excitatory aminoacid receptor agonist and competitive antagonist
TIPS, 11, 25- 33.
Watkins, J.C. y Olverman, H.J. (1987) Agonist and antagonist for excitatory amino acid
receptors. TINS. 10, 265-272.
Watkins, J.C. y Olverman, H.J. (1989) NMDA agonists and competitive antagonists. En:
Watkins, J.C., y Collingridge, G.L. The NMDA Receptor IRL press.
Willams, K., Romano, C., Ditcher, M. y Molinoff, P. (1991) Modulation of the NMDA
receptor by polyamines. Life Sciences. 48, 6, 469-498.
Zucca, G.P., Valli, P. y Casella, C. (1982) Ionic Mechanism sustaning activity in ampullar
receptors of the frog. Acta Otolaryngol. 93, 355-362.
49