tecnología del adn recombinante tecnología del adn recombinante

TECNOLOGÍA DEL
ADN RECOMBINANTE
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE
Algunas preguntas (elementales):
- ¿Para que sirve?
- ¿Qué preguntas puede responder?
Algunas aplicaciones:
- “Aislamiento” o knockout de un gen de su contexto genético para
ver su actividad, función, interacción, etc., en forma individual.
- Producir grandes cantidades de una proteína  industria
- Generar un organismo genéticamente modificado (con gen/genes
de interés)  levaduras, plantas, bacterias, virus, etc.
- Herramientas para la mejora en el diagnóstico, tratamiento, etc.
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE
- Tecnología del ADN recombinante: Es la aplicación de un paquete
de herramientas moleculares para obtener un microorganismo
modificado genéticamente o “aislar” un gen.
- Vector: Elemento que utilizo como soporte para contener,
expresar y utilizar el material genético de interés.
- Clon: Población de microorganismos (modificados genéticamente)
idénticos entre sí.
Solo
algunas
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE
-Enzima de restricción Tipo II  sitio específico de restricción:
EcoRI
5´-G/AATTC-3´
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE
-Enzima de restricción Tipo II  sitio específico de restricción:
extremos cohesivos
EcoRI
GAATTC
CTTAAG
5’
Secuencias
Palindrómicas
3’
G↓A A T T C
C T T A A↑G
3’
5’
C C G G
G G C C
extremos romos
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE
Vectores de clonado y de expresión
• Vectores de clonado:
- Moléculas de ADN en las cuales se pueden introducir o
“clonar” fragmentos (genes) de ADN
- Generalmente son plásmidos y bacteriófagos
• Vectores de expresión:
- Son vectores de clonado especializados para expresar un
gen en la célula hospedadora (generalmente E. coli)
- Contiene secuencias reguladoras que regulan/estimulan la
expresión de un gen --> Elementos necesarios:
PROMOTOR, SITIO DE UNION A RIBOSOMA (RBS), INICIO
TRANDUCCIÓN, TERMINACIÓN DE TRANDUCCIÓN.
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE
Vector de clonado
MCS (multi-cloning site)
o polylinker
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE
Ejemplo de clonado
Gen
resistenci
a
EcoRI
ADN cromosomal
ADN cortado en miles
de fragmentos con
extremos EcoRI
Ligación
G
G AATTC
G AATTC AATTC
Inserto
CTTAA CTTAA G
G
CTTAAG
EcoRI
plasmido
Inserto
Plásmidos
pBR322
BamHI
SpHI
SalI
Amp R= MCS
Cepa: S/ampR
Tamaño: 4361 pb
ColE1, no
Relajado
Tet R
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE
Ejemplo de clonado
Plasmido pBR322
Inserto en sitio pstI
Plásmidos
pUC19
LACI
BamHI
EcoRI
Frag  LacZ
5-ATG AAT GGA TCC CCC GAA TTC CAG CAT TAG-3
5-CAT TTA CCT AGG GGG CTT AAG GTC GTA ATC-3
p Lac
BamHI
EcoRI
O Lac
Amp R
ColE1, no
Relajado/
relajado
Cepa: complem.
DH5Xl1Blue
Tamaño: 3162 pb
Ejemplo de clonado:
- Plasmido pUC19
- Placa de agar con:
Ampicilina + X-gal + IPTG
Sin
inserto
Con
inserto
Colonia a ser
estudiada
Ejemplo de clonado:
- Plasmido pGEM-T / TOPO
- Placa de agar con:
Antibiótico +
X-gal + IPTG (opcional)
Producto de PCR
5´
5´
Taq-polimerasa: deja una A extendida en extremo 3´ del amplicon
5´
A
A
5´
T
+
 Extremo cohesivo!!!
T
Plásmido linealizado con T
Si no hay ligación  la bacteria no tiene
la Resistencia del plasmido no crece
Si hay ligación  la
bacteria crece  ver si el
inserto es el esperado!!!!
Cepa: complem.
DH5Xl1Blue
pGEM-T
LACI
EcoRI
EcoRI
Frag  LacZ
-T
p Lac
O Lac sP6
Tamaño: 3015 pb
TT3
ColE1,
relajado
Amp R
Plásmidos
Plásmidos
pCR-TOPO
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE
Clonado para expresión de un gen
Promotor regulable
Gen de
resistencia
RBS (sitio unión de ribosoma)
His-tag
(opcional)
Polylinker
T1: terminador traducción
T2: terminador traducción
OriC
lac Expression Regulation
RNA polymerase
Promoter lac site
X
RBS
IPTG (or lactose, etc)
lac repressor
Promoter lac site
RBS
mRNA
ATG- your gene
Transcription
IPTG
Promoter lac site
ATG- your gene
RBS
ATG- your gene
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE
A tener en cuenta!
Genes eucariotas tienen intrones-exones!!!
En procariotas la secuencia del gen no debe tener intrones. Debe estar la
secuencia a expresar.
Modificaciones post-traduccional
¿Cuál es la diferencia entre la expresión en procariotas y eucariotas?
- Modificación post-traduccional de la mayoría de las proteínas eucariotas
- Las células procariotas no pueden realizar esas modificaciones!!!
–
–
–
–
Formación de uniones disulfuro correctas
Clivaje proteolítico del precursor inactivo
Glicosilación- agregado de residuos de azúcar
Alteración de aminoácidos en la proteína
•fosforilación
•acetilación
•agregado de grupos sulfato
•Agregado de ácidos grasos
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Codon Usage in E. coli & humans
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE
A clonar!!!
Metionina
inicial
His-Tag
NcoI
BtgI
51 CTTTAATAAG GAGATATACC ATGGGCAGCA GCCATCACCA TCATCACCAC
M G S S
H H H
H H H
Polylinker
SacI
AscI SbfI
SalI
NotI
BamHI EcoRI EcoICRI BssHII PstI AccI
HindIII
101AGCCAGGATC CGAATTCGAG CTCGGCGCGC CTGCAGGTCG ACAAGCTTGC
S Q D P
N S S
S A R
L Q V D
K L A
Y encima hay clonar in frame???!!!
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE
Y encima hay clonar in frame???!!!
NcoI
BtgI
51 CTTTAATAAG GAGATATACC ATGGGCAGCAGCCATCACCATCATCACCAC
M G S S H H H H H H
SacI
AscI SbfI
SalI
NotI
BamHI EcoRI EcoICRI BssHII PstI AccI
HindIII
101AGCCAG/GATCCGAATTCGAGCTCGGCGCGCCTGCAGGTCGACAAGCTTGC
S Q
D P N S S S A R L Q V D K L
…G/GATCCtccatgcaacatggatgcgatc…G/GATCC…
D P P C N M D A I
Inserto …G/GATCCNtccatgcaacatggatgcgatc…G/GATCC…
D P S M P H G C D
…G/GATCCNNtccatgcaacatggatgcgatc…G/GATCC…
D P X H A T W M R
TECNOLOGÍA DEL ADN
RECOMBINANTE
Como ingresa el “vectorADN clonado” a la célula?
Natural
COMPETENCIA
Inducida
Bacillus,
Streptococcus,
Haemophilus,
Neisseria
Modificación artificial de la pared celular
(ingeniería genética en E. coli):
1. Transformación por Calcio: cultivo en presencia de
Ca+2 + “shock térmico”:
Nº transformantes
Eficiencia =
= 106 transf./g ADN
input de ADN
2. Electroporación: formación de poros en la membrana
celular por exposición a pulso eléctrico de alto voltaje:
V = 2.500 V - (2 mm)
T = 4 - 5 mseg.
Eficiencia = 1010 transf./g ADN