Área de Posgrado Ciencias de las Plantas y Recursos Naturales Pre-proyectos de Tesis Ciclo 2009 Título: BASES GENÉTICAS DE LAS BARRERAS PRE-CIGÓTICAS A LA HIBRIDACIÓN EN ESPECIES TUBEROSAS DE SOLANUM Lic. Genética Juan Federico Maune Introducción La papa común, Solanum tuberosum spp. tuberosum (tbr, 2n=4x=48), es uno de los cultivos de mayor importancia mundial en cuanto a superficie plantada y uno de los principales componentes de la dieta humana, junto al trigo, el maíz y el arroz. En la Argentina, se cultivan alrededor de 100.000 has. por año; 80% de esa superficie se ubica en las provincias de Córdoba y Buenos Aires y el resto se distribuye en Mendoza, Santa Fe y Tucumán. La estrecha base genética de esta especie y su herencia tetrasómica hacen que los avances en el mejoramiento sean lentos. Pero hay aproximadamente 200 especies tuberosas y etuberosas silvestres emparentadas (Hawkes, 1990), que constituyen un importante reservorio de diversidad genética y una valiosa fuente de resistencias heredables a agentes bióticos y abióticos adversos (Ross, 1986). Estas especies crecen desde el sur de Estados Unidos, pasando por América Central y siguiendo la línea de los Andes, hasta el sur de Chile, extendiéndose hacia el este, a través de nuestro país, hasta Paraguay, Uruguay y Brasil. Las especies tuberosas de Solanum son alógamas y se reproducen por semillas y tubérculos. La alogamia es debida a un sistema de autoincompatibilidad gametofítica, gobernado por el locus S, que previene la fecundación cuando el polen lleva un alelo S igual a uno de los alelos S del pistilo. Este gen es polimórfico y ha sido clonado en varias especies silvestres, revelando una estructura común con cinco regiones conservadas y regiones hipervariables, que determinan la especificidad de los alelos S (Kirch y col., 1992; Matton y col., 1999). En especies del género Nicotiana (familia Solanaceae), se ha determinado que el locus S codifica una ribonucleasa, determinante de la reacción de incompatibilidad a nivel del estilo (de Nettancourt, 2001). En general, es posible realizar cruzamientos controlados entre las especies silvestres y las formas cultivadas. En su mayoría, los híbridos que se obtienen son vigorosos y presentan un alto porcentaje de apareamiento cromosómico debido, principalmente, a que no existe una importante diferenciación cromosómica entre especies (Ramanna y Hermsen, 1979; Masuelli y Camadro, 1992). Por ello, es posible incorporar pequeños segmentos cromosómicos de las especies silvestres a las formas cultivadas, tanto para introducir resistencias heredables como para ampliar la base genética e incrementar la heterocigosis, positivamente relacionada con el rendimiento. Sin embargo, cerca del 70 % de las especies silvestres de papa son diploides (2n=2x=24) y muchas de ellas no se pueden cruzar en forma directa con la papa común debido a la presencia de barreras internas a la hibridación. Estas barreras pueden ser pre-cigóticas, que inhiben la germinación del grano de polen o el crecimiento del tubo polínico en el pistilo, y post-cigóticas, que producen muy frecuentemente el aborto del endosperma en cruzamientos interploides o, en mucha menor frecuencia, el aborto del embrión (Masuelli y Camadro, 1997). La principal barrera pre-cigótica a la hibridación es la incompatibilidad cruzada o incongruencia (de Nettancourt, 2001, Camadro y col., 2004, y Kermicle, 2006). Esta barrera puede resultar de la falta de información, en una de las partes (polen o pistilo) con respecto a la otra, para una función determinada (Hogenboom, 1973), o pude deberse a genes que funcionen específicamente para reconocer el origen externo del polen y bloquear una reacción que, de otro modo, sería compatible (Kermicle, 2006). Esta incompatibilidad cruzada, a su vez, puede ser unilateral (es decir, el cruzamiento recíproco es compatible) o bilateral. A diferencia del sistema de autoincompatibilidad, extensamente estudiado en diversas especies tanto a nivel genético como molecular y fisiológico (ver de Nettancourt, 2001), el conocimiento de las bases de la incompatibilidad cruzada es aun fragmentario. Al respecto, algunos autores han propuesto la hipótesis de una función dual del locus S (Camadro y col., 2004). Sin embargo, los sitios de inhibición del crecimiento del tubo polínico difieren entre la reacción de autoincompatibilidad y la de incompatibilidad cruzada y tanto la incompatibilidad cruzada, unilateral como la bilateral, existen en especies con o sin sistemas de autoincompatibilidad. Así, numerosos autores se han inclinado por la hipótesis alternativa del control genético de la incompatibilidad cruzada mediante un sistema independiente del locus S (Camadro y col., 2004). Por ejemplo, Camadro y Peloquin (1981) propusieron un modelo en Solanum, en el que genes dominantes de incompatibilidad cruzada en el estilo previenen la fertilización por parte de aquel polen que posee genes específicos complementarios. Además, Evans y Kermicle (2001) identificaron una región cromosómica en teosinte (especie autocompatible) que controla en forma dominante la restricción a su cruzamiento con el maíz (también autocompatible). No existe información alguna, sin embargo, sobre las bases moleculares o fisiológicas de la incompatibilidad cruzada. Para poder determinar el control genético y molecular de las barreras pre-cigóticas a la hibridación Área de Posgrado Ciencias de las Plantas y Recursos Naturales Pre-proyectos de Tesis Ciclo 2009 en especies tuberosas del género Solanum es necesario: a. Realizar cruzamientos recíprocos entre especies tuberosas silvestres del género Solanum y entre éstas y la papa cultivada, S. tuberosum ssp. tuberosum b. Determinar las relaciones de compatibilidad polen-pistilo en dichos cruzamientos c. Identificar el momento de inhibición del crecimiento de los tubos polínicos en los cruzamientos incompatibles d. Seleccionar una muestra de cruzamientos compatibles en ambas direcciones, incompatibles unilateralmente e incompatibles en ambas direcciones y analizar la expresión diferencial de genes en pistilos polinizados e. Clonar, secuenciar y anotar ADNc polimórficos en combinaciones genotípicas de los tres tipos de cruzamientos f. En una muestra mayor de combinaciones genotípicas, establecer la relación entre los polimorfismos que se observen y las reacciones de compatibilidad polen-pistilo Estas actividades exceden los tiempos acotados para la realización de una tesis de maestría. Por ello los objetivos que se establecen son los mencionados en los incisos a, b y c, para poner a prueba las siguientes hipótesis: En cruzamientos interespecíficos de especies tuberosas de Solanum, incompatibles en el nivel polen-pistilo: 1. el tiempo que transcurre desde la polinización hasta la detención del crecimiento del tubo polínico es función del sitio en el que se produce la reacción de incompatibilidad; 2. las reacciones de incompatibilidad están controladas por genes dominantes en el polen y genes complementarios dominantes en el pistilo, que pueden segregar. Materiales y Métodos: (a) Cruzamientos controlados entre especies silvestres del género Solanum y S. tuberosum: Se utilizarán las especies silvestres S. chacoense (chc, 2n=2x=24, 2NBE), S. gourlayi (grl, 2n=2x=24, 2NBE y 2n=4x=48, 4NBE) y S. spegazzinii (spg, 2n=2x=24, 2NBE), y S. tuberosum (tbr, 2n=2x=24, 2NBE y 2n=4x=48, 4NBE). Se cultivarán diez plantas en macetas individuales por cada una de dos introducciones por especie silvestre, tres haploides de tbr y tres variedades comerciales de papa en una jaula antiáfidos. Se realizarán cruzamientos intra- e interespecíficos recíprocos en todas las combinaciones genotípicas posibles bajo un diseño dialélico incompleto. (b) Determinación de las relaciones de compatibilidad polen-pistilo en los cruzamientos mencionados en (a): Se utilizará la técnica de Martin (1958). Transcurridas 48 h después de la polinización, se fijarán tres pistilos polinizados por combinación de genotipos en FAA (1 formaldehído: 8 etanol: 1 ácido acético glacial, v/v/v), se los incubará a temperatura ambiente por 4 h en una solución de NaOH 8 N, y, tras haber sido sometidos a una serie de enjuagues en agua destilada se los teñirá por inmersión en azul de anilina decolorada durante 2-4 h. Posteriormente serán montados sobre una gota de glicerina en un portaobjetos, aplastados con un cubreobjetos, y visualizados en un microscopio con luz ultravioleta. Las reacciones serán clasificadas en: (1) compatibles (los tubos polínicos alcanzan los óvulos) o (2) incompatibles a nivel del (A) estigma (el polen no germina o germina pero el tubo polínico no se desarrolla), (B) primer tercio, (C) segundo tercio o (D) tercer tercio del estilo (los tubos polínicos se detienen en el primero, segundo o tercer tercio del estilo, respectivamente). (c) Identificación del momento de inhibición del crecimiento de los tubos polínicos en cruzamientos incompatibles: A partir del análisis realizado en (b) se seleccionará una muestra de combinaciones genotípicas incompatibles de manera que estén representados los distintos sitios de detención del crecimiento de los tubos polínicos en el pistilo. Se realizarán nuevas polinizaciones y se fijarán pistilos en intervalos de 1 h Área de Posgrado Ciencias de las Plantas y Recursos Naturales Pre-proyectos de Tesis Ciclo 2009 a partir de los 30 min posteriores a la polinización y hasta las 24 h post-polinización. Los pistilos serán procesados de acuerdo con la técnica descrita en (b), y se tomarán fotografías digitales de cada uno con una cámara montada en el microscopio. Posteriormente se determinará la longitud de los tubos polínicos y del pistilo mediante la utilización de un programa de edición y procesamiento de imágenes en una computadora. Los valores de longitud de los tubos polínicos serán corregidos por la longitud del pistilo, de ser necesario. Se analizarán estadísticamente los promedios de longitud de los tubos polínicos en cada momento de muestreo comparado con el inmediatamente anterior, y se estimará el momento de detención de su crecimiento de acuerdo con los momentos de muestreo entre los que no haya diferencias significativas. Bibliografía: Camadro, E.L.; Peloquin, S.J. 1981. Cross-incompatibility between two sympatric polyploid Solanum species. Theor Appl Genet 60: 65-70. Camadro, E.L.; Carputo, D.; Peloquin, S.J. 2004. Substitutes for genome differentiation in tuber-bearing Solanum: interspecific pollen-pistil incompatibility, nuclear-cytoplasmic male sterility, and endosperm. Theor Appl Genet 109:1369-1376. de Nettancourt, D. 2001. Incompatibility and incongruity in wild and cultivated plants (2 nd. ed). Springer Verlag Berlin Heidelberg New York; 322 p. Evans, M.M.S.; Kermicle, J.L. 2001. 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