Nueva técnica de identificación

Nueva técnica de identificación
.
,
crcmesermea
Dr. Fabio
Salamanca
Dr. Miguel
Dr. Ernesto
Barboso
Iné Martínez
finales
A
presente
siglo,
estudios
heteropicnosis
en interfase
Sin
cuando
fue
solo
Barr y Bertran
establecer
este
(2
hallazgo
una célula
individuo
del sexo
procedente
primeras
posee
*
**
***
Jefe
Jefe
del
·INPES·
Jefe del Su~Grupo
Trabajo
a
realizado
de Bioquímica
en el Instituto
de
REV.
MED.
COLOMBIA
U.N.
Salud
de tal
igual
al
X menos
el
X
tiene
hombre
gonosómico
1,
un
cuyo
XY
es
(Alteraciones
cromosómico
que
del
número
haploide
de
cromosomas)
los gonosomas
en
los
son
simple
o
que
también
a la misma relación
ejemplo
conocidos
en el
no
múltiplos
por
casos
y así
bien
de monosomía del cromo-
soma X (Síndrome de Turner) no hay
cuerpo de Barr, en el Síndrome de
para
·INPES·
VOL.
de
de cuerpo de Barr, y pacientes
obedecen
.INPES.
Nacional
Especiales
célula,
siempre
Barr;
comprometen
de Microbiología
Programas
FAC.
en
de Genética ·INPES·
Su~Grupo
era
de
número
interior de la membrana
del Su~Grupo
la
de cromosomas
con aneuploidías
poseen el cuerpo de croma-
la superficie
pudieron
presencia
dos cromosomas
carece
las
adherida
en
complemento
femenino y una
una porción de cromatina
la
con el número de cromosomas
cuerpo
de un
tina (cuerpo de Barr) consistente
de
por lo cual, la mujer que normalmente
en células
del sexo masculino:
de
Cito genétic a
posteriores
presentes
número
l pudieron
procedente
de
que
cromatina
1949
de mamífero y señalaron la diferencia
entre
carecen
manera que el número de cuerpos de
(1 l.
hasta
técnicas
estrecha
X
por una masa de cromati-
embargo,
***
Pb, D.
cuerpos de Barr guardaba una relación
en la célula
intranuclear
**
de Barr. Con el progreso
establecer
de un cromosoma
o cromocentro
M., M.D.,
últimas
investigaciones
de
habían revelado
X, que se manifestaba
na
las
de la tercera década del
Citología en insectos
la
cuerpo
*
MSC.
MSC.
P. (Bacteriólogo)
nuclear y las
INTRODUCCION
G., M.D.,
Guzmán U., M.D.,
37 Nº 3 1971
-236-
Klinefeltter
(XXY) hay un cuerpo de
cromatina;
en los complementos
reconocido
XXX
encontrar
no había sido posible
(8).
un método fácil que permi-
ó XXXV hay dos cuerpos de Barr, en
tiera
los casos
ocurría con el procedimiento
XXXX ó XXXXY hay tres
su
identificación
técnica
por
Barr para
para encontrar este dimorfismo sexual
los
cromosomas
Sin
embargo,
cuerpos
de
Barr,
en la especie
La
humana se simplificó
y se generalizó
células
etc.
con la utilización
de la mucosa
bucal
(3),
de
de Caspersson
10
cromosomas
que ha sido de enorme ayuda en el
esclarecimiento
el desarrollo
La
de anormalidades
fico
en
sexual.
relación
del
número
de
de
replicación
tardía
cromosomas
X en la mujer, utilizando
el
de
método de timidina
tritio, La explicación
cuerpo
lleva
(5)
su
de
marcada
fué dada
con la hipótesis
nombre,
los
las
técnicas
que
hizo
según
la
con
del
con
intensa
inactiva,
al
por
somas
cual
13-14-15)
comportamiento
cuyo lucus
están
cromosoma
X,
X en la
de algunas
esta
(6.
renciación
sexual
está
Y muestra
la
largos
la
más
en el cario-tipo
grupo
D
también
(cromosomas
fluorescen
especialmente
inten-
en las regio(10).
se utilizó para estudiar
La
celu-
ha
y fueron Pearson et al
Y George
( 1 1)
demostrar
los
(12)
primeros en
que la fluorescencia
del
cromosoma y también se evidenciaba
en
7).
A pesar de que en el hombre el
cromosoma
mencionado
próximas al centrómero
las
división
papel del
En
encontraron
de los brazos
de quinacrina
en el
hipótesis
tenido amplia confirmación
agente
para
Y.
las en interfase empleando hidroc Ioruro
el
enzimas
localizados
sino
un método
cromosoma
autores
el
del
técnica
esta
Siguiendo
en
Somas como el número 3 y los cromo-
que
embriona-
ocurriendo
azar.
no solo
humano, a pesar de que otros cromo-
nes
se
tratarlos
importante
fluorescencia
samente,
mujer
el
distal
tempranamente en la vida embrionaria
inacti vación
posible
cromosoma
(12 - 16 días de desarrollo
rio) uno de los cromosomas
al
de citogenética,
estos
porción
a la función del
de cromatina
Mary Lyon
uno
toman un patrón especí-
avance
que
sobre
(4)
hallazgo
de que los
(9)
de quinacrina,
los
German
reciente
et al
un
efecto,
de
el
con mostaza
X tuvo un nuevo y valioso soporte en
de
X supernumerarios.
permitió
identificar
como
utilizado
la identificación
fluorescencia
cuerpos de Barr con el de cromosomas
estudios
tal
Y en la dife-
-237·
que
no
(interfase),
están
en
apareciendo
como
un pequeño corpúsculofluores-
cente
muy cerca
nuclear.
plenamente
células
Había
de
la
surgido
membrana
así
otro
método
para
masculinas
diferenciar
de las femeninas por
presencia
en las
Se
células
primeras
estudió
clormetacrina
la
del cro-
interfase
mosoma Y.
La
la
acción
tanto
en
células
como en células
técnica
empleada
de
la
en
en división.
consta
de los
pasos siguientes:
La-
técnica
con mostaza
cloruro
en
fluorescencia
de quinacrina
de quinacrina
el
estudio
numéricas
soma
de
ha sido
de
Los
tan
dos
células
de
nosotros
un caso
del
con
con
en
u ai.
Uno
(F.S.G.)
ha
de anormalidad
la
substancias
la identificación
fijan durante
descrito
el
cual
del
análisis
fluorescentes
se
esclarecimiento
técnica
por
tienen
selectivas
en
los
cubren
las
de
los
con
clormetacrina
0.4% (concentración
al
con la cual se
mejores
resultados)
durante 6 minutos.
al
4.- Se
lava
s.-
cubren
Se
buffer
con
agua
las
corriente
láminas
con
pH . S. 3
fosfato
y
se
montan en Buffer fosfato pH 7.4.
cual estas
cromosomas,
Cito genética
técnica
Se
incorporaciones
6.- Se
y
de esta
en
observa
utilizando
nuestro
al
microscopio
lámpara
de
luz
ultravioleta.
el primer estudio
aparecido en la Literatura,
la
láminas
mecanismo
el
la realización
medio, presentamos
do
10 minutos en una
3.-
obtuvieron
para
de contribuír
del
mecanismos)
para facilitar
se
de este cromosoma
Con el objeto
substancias
y las láminas
acético 1: 1.
solución
(14).
(o
mujeres
y
solución de etanol-ácido
estructural
en
Y
utilidad
hombres
2.- Se hacen frotis
dos
fluorescentes
en interfase
cromosoma
demuestra
de
de mucosa
del cromo-
hombres
cuerpos
toman muestras
mediante raspado con escobillón.
cromosomas y (síndrome YY) presenlas
Se
bucal
útil
anormalidades
y estructurales
Y.
1.-
o hidro-
de
empleo
modifican-
Para
fluorescencia
mediante
el
substancia
la CLORMETACRINA. (Ba
estudiar
clormetacrina
de una nueva
la acción
en células
utilizamos cultivo
sangre periférica
yer).
la conocida
al
MATERIAL Y METODOS
Los
-238-
de linfocitos
realizados
técnica
( 15) con algunas
cultivos
se
de la
en división
de
mediante
de Moorhead et
modificaciones.
cosecharon
a
19;
72
horas
de
preparadas
la
siembra.
las
cultivos
se
Una vez
láminas
siguen
los
de
los
pasos
CUADRO
Ng 1 CELULAS
EN INTERFASE
CON CLOR
CULTIVO
MUCOSA
Ni
Las preparaciones
Hombres
lámpara de luz ultravioleta
Y filtros
barrera
de
preparaciones
microfotografías
las
procesaron
el
por
METAFASE
Nl! DE CELULAS
,
-
'"
717
283
300
380
620
lOO
500
500
BG 12
Todas
530 K. De algunas
se
INTERFASE
Ng DE CELULAS
-
Mujeres
DE SANGRE
PE.PIFERICA
DE
,
Fluorescencia
Leitz Orthoplan,
HBO 200, con filtro excitador
BUCAL
CELULAS
se observaron
en un fotomicroscopio
las
ANALIZADAS
des-
critos anteriormente.
utilizando
Y METAFASE
- METACRINA
analizadas
tomaron
cuales
las metafases
de
se
un
revelaron
de
usual.
los
en
la
la
brazos
presencia
Y con intensa
cromosoma
fluorescenci a
procedimiento
masculinas
porción
largos
distal
según
se
observa en las Figuras Nºs. 6, 7 y 8.
RESUL TADOS y DISCUSION
No se observó
fluorescencia
similar
femeninos
analiza-
en los cariotipos
Los
Cuadro
el
resultados
aparecen
Nº 1. Puede
62% de las
mostró
en estas células y en las células
masculinas
también
presentan
células
masculinas
positi va
en
fluorescencia
de mucosa bucal mientras
que de 500 células
lizadas
femeninas
ninguna
fluorescente.
positivas
mostraron
llante
dos, a pesar de que otros cromosomas
que
apreciarse
fluorescencia
las células
en el
mostró
Se
tomaron
aquellas
células
un
pequeño
adosado
terístico,
ana-
avance
lo cual constituye
de la técnica
identificación
de
como
(cromosomas
distintos
cuerpo
que
somas
bri-
objeto
de la
membrana nuclear con una fluorescen-
los
generalmente
es
menos
la
Nºs.
periférica
el
masculinas
fluorescencia
nuevamente
de
sangre
71.7% de las
células
cultivos
en
interfase
del
positiva,
las
no mostraron esta
células
mientras
con
Figura
normal
que
habitual
femeninas
se
-239-
esta
Y (Figuras
nueva
muestra
según
la
masculino
técnica
de Glemsa,
en el cual
diferenciar
los
técnica
en
la
con coloración
pueden
La
intensa
comparar
Nº 9 un cariotipo
procedimiento
fluorescencia.
Para
se
obtenido
y será
ón.
autosomas
cromosoma
6, 7, 8,).
fluorescen te,
mostró
y Y),
de
resultados
los
autosomas
publícací
otra
de
un gran
a los cromo-
X
sexuales
carac-
al permitir la
los
fluorescencia
que
tal como se muestra
en las Figuras Nºs. 1, 2, 3, 4 y 5.
En
un patrón
cuerpo
o muy cerca
cia muy intensa
con
solamente
los distintos
FIGURAS
N!s,
1 y 2 Se
aprecia
interfase
el cuerpo
de la mucosa
fluorescente
bucal
que evidencia
de un individuo
-240-
el cromosoma
normal
de sexo
Y. en células
masculino.
en
FIGURAS NOs. 3, 4 y 5
Fluorescencia
cultivo
de sangre
del cromosoma
periférica
·241·
y en linfocitos
en un individuo
normal
(interfase)
de sexo
procedentes
masculino.
de
FIGU.RA
NO 6 Metaf~se
derecha
cencia
de la metafase
FIGURA
Nº 7
de una célula
Fluorescencia
metafase
de un sujeto
de la porción
distal
de los
un núcleo en interfase.
de
la
de una célula
porción
distal
n orm al de sexo
brazos
de
de varón normal.
los
largos
masculino.
del
brazos
A la izquierda
·242·
Se muestra
crom os om a Y.
largos
del
se aprecia
la fluores-
Se aprecia
a la
cromosoma
y en una
un núcleo
en interfase
"
3
2
'1
7
·6
14
13
5
4
9
8
10
17
16
FIGURA
N9 9
Metafase
técnica
Se aprecia
y cariotipo
citogenética
el complemento
mas (cromosomas
distintos
22
.21
20
sexual
correspondiente
habitual
XY del varón
a los cromosomas
a un individuo
los cromosomas
normal.
sexuales
-243-
Los
solo
l.
18
Xy
normal
de sexo
se diferencian
números
X y Y),
12
II
11/11
19
I
11
II
,15
o
del
masculino.
Con la
por su morfología ...
1 al 22 indican
los a ut os o-
cromosomas
fluorescentes? .
por sus características
morfológicas.
En el hom1:ireel papel determinante
masculino
está
plenameate
La
regulación
del
cromosoma Y
aceptado
(8).
de la diferenciación
sexual en la vida embrionaria se ha
atribuído
a
la
interacción
heterocromatinas
de
de
los
somas heterocromáticos
crottW-
X y Y
han
las.
(16).
Algunos
autores
evidencia
de que en el hombre los
factores
determinantes
están
localizados
cortos
del croaaosoma Y
tros
zados
lDMCulin06
en
en un reeiente
señalado
presentado
brazos
factores
brazos
porción
mero
del
(14).
más
tamaño
se
refiere
aparentemente
expensas
Y,
normales
de
se
variaciones
hace
a
en
la
de los brazos largos.
porción
es
la
intensamente
hoy
que
con
uniera
ricos
Esta
fluoresce
las
utilizadas
más
substancias
(mostaza
substancia
en
el
presente
algunos
la
gran
quinacrin a
los
segmentos
Guanina
de Hidrocloruro
Por
del
distal
de
los
por las
del
DNA
Nº 10).
(Figura
H3
CI
-,
OCH3
2HCI
FIGURA
Sin
embargo
fluorescencia
et al
(I
/
N
n
hidrocloruro
N° 10
hallazgo
el
similar
Y George
por
(I2)
de quinacrina
de
una
Pearson
utilizando
molécula
que ha perdido el grupo alquilan te
en la cadena lateral (Figura N!l 11),
e
b ) Hidrocloruro
de Quinacrina.
pH
NHCH-(CH2)3N(CH2CH}
~
qué
brazos
2
OCH:1
2HCI
CI
/
cromosoma Y muestran
afinidad
el
de Quinacrina.
r
empleado
estudio.
fuera
afinidad y se
cromosomas y especialmente
porción
largos
hemos
de la moleeula de
NH CH-(CH )3N(CH CH CIl
2
2 2
también con ésta nueva
que
fluorescen-
pensando que el
de ésta
a
en
a) Mostaza
hiároc1oruro de quinacrina, proflavina)
y lo hace
de
al
, en indi viduos
longitud
hasta
mostaza
responsable
en
en cuanto
Citosina-
de la molécula del DNA (ácido
grupo alquilante
La variación morfológica
cromosoma
de los pares
desoxiribonuléico),
«ortos del
próxima al centro
se debe a una
Guanina en los sepentos
tes
locali-
cromosoma Y, no están situados
la
prevalencia
Noso-
(17).
et al han postulado
afinidad
trabajo hemos
que estos
sobre los
los
Caspersson
que dicha
substancias
N
FIGURA
N° 1 l
FIGURA
Nº 8
Intensa
metafase
FIGURA
Nº 13 Cuerpo
zoides
fluorescencia
de-la
de una célula
fluorescente
porción
distal
de un individuo
en un espermatozoide
que portan cromosoma
X na presentan
-245-
de los
normal
brazos
de sexo
que porta
este
largos
del cromo s oma
y en una
masculino.
el cromosoma
corpúsculo
Y. Los
fluorescente.
espermato-
está
en
contra
sugerida
de
posibilidad
siguiendo
y su grupo.
timidina
la
por Caspersson
Nuestro hallazgo utilizando
erina,
molécula
una
que
modificación
lateral
clormeta-
también
en
la
sufre
cadena
(Figura Nº 12) habla en favor
la
triatida
fluorescente
más
exacta
de
tipo
está
que
por la cadena
por
estructura-
ejemplo
de
la
en la cual se intercamde distintos
cromoso-
mas. Por este método se ha establecido
lateral.
cromosomas
les
bia segmentos
central
los
en alteraciones
translocación,
núcleo
Con el método
(18).
envueltos
del
con
se logra la identificación
de que la afinidad química específica
dada más bien por el anillo o
incorporación
igualmente
que
el
cromosoma
extra en el síndrome de la Trisomía
el Cl or-Met acrin a,
OH
G1 (mongolismo) no es el mismo que
I
N HC H 2"eH-eJl2N(C2HS)2
se encuentra en la leucemia mieloidecrónica
y que tiene
amputación
en
una delesión
sus
brazos
(cromosoma Philadelphia
o
largos
o Ph 1)
(19),
como se venía afirmando hasta ahora.
el
El método ha sido úti 1 también en el
estudio
FIGURA
La
técnica
fluorescente
nuevo
con
substancia
ha permitido no solo un
método
evidenciar
des
Nº 12
el
cito genético
dimorfismo
para
sexual en
el hombre, tal como lo demuestra el
presente
trabajo, sino que además ha
revolucionado
ticas,
las técnicas
citogené-
al permitir una identificación
más precisa del cariotipo humano ya
que
la substancia
manera
se incorpora
específica
de
en los distintos
cromosomas (Figuras
N2s. 6, 7 y 8).
De ésta manera se pueden diferenciar
los cromosomas que pertenecen
a los
grupos C, F y G, los cuales
no se
diferenciaban
por
estudios
de
modo concluyente
de
autorradiografía
de la relación de anormalida-
cromosómicas
habiéndose
trabajos
con
encontrado
el
cáncer,
en
algunos
una mayor frecuencia
esperado de translocaciones
nes cromosómicas,
técnica
es
el
de lo
y delesio-
Otro empleo de la
averiguar
el
sexo
genético del feto durante el embarazo,
investigación
varios
en
adelantada
desde hace
años por muchos laboratorios
el
mundo.
Gracias
método
es
identificación
más adecuada y segura
del sexo genético
de estos estudios
posible
al
fluorescente
hacer
una
del feto. Algunos
se están adelantan-
do en nuestro laboratorio.
Una
empresa
ambiciosa
en el
campo de la Genética ha sido la de
separar
los
espermatozoides
que
portan cromosoma Y de los que portan
cromosoma X, con el objeto de hacer
estudios
cito genéticos
en nuestro
medio, ya que la clormetacrina es de
fecundaciones
más
selectivas
en cuanto
fácil
obtención
que
otras
al sexo se refiere. La técnica descri-
substancias
fluorescentes
que
se
ta en este trabajo permite identificar
incorporan
sel ecti vamen te
en
los
los
espermatozoides
que
portan
cromosomas,
el
sino
que
además
cromosoma y tal como se muestra en
permite estudios
la figura Nº 13 en donde se aprecia
en el campo de la Biología y particu-
un
espermatozoide
corpúsculo
que
fluorescente
porta
larmente
el
parte
correspon-
cias
La
técnica
presente
reportada
trabajo
de la
Genética.
contribuye
a
mecanismo
diente al cromosoma Y.
no
solo
en
Por otra
precisar
el
por el cual las substan-
fluorescentes
nes específicas
el
de gran importancia
se unen a porcio-
del Genoma Humano.
facilita
SUMMARY
RESUMEN
This
Se
presenta
informe
literatura
sobre
el
aparecido
en
una nueva
técnica
Cromosómica
primer
la
de Identificación
el
empleo
la
Clor-Metacrina.
Se
señalan
algunos
usos de esta
técnica
campo
de la Biología
de
mente
mediante
de
la
como Identificación
Anomalías
de Desarrollo
y
del
del
Sexo
Embarazo.
mecanismos
de esta
Feto
Se discuten
substancia
in detecting
foetus
cells
the genetic sex
during
pregnancy,
sex oí patients
and
in
in
with sex
detecting
(Zpermatozoa)
chromosome
this
male
germ
bearing
Y-
other
branches
of Biology are discussed.
Sexual
durante
In the other hand, this study ís
el
one approach to clarify the chernical
los posibles
de la acción
a
Utility
malformations,
del Sexo Genético
en
Cytogenetic
of
detecting
tales
first
Clor-Metacrine.
of
en el
the
compound
technique
y particular-
Citogenética
is
Study using the fluorescent
Mechanism
específica
of
sobre el genoma
fluorescent
specífic
Humano.
responsable
for binding
compounds
AGRADECIMIENTOS:
Los autores ."preson
sus agradecimientos
Villomizor H., Hemondo Graot L, Augusto
(oci lidodes otorgocJos pora
'A
a los doctores Pablo Morillo C., Luis J.
Corredor A. y Alfredo Lleras P., por las
realización
de éste trabajo
-247-
to
the
portions of human Karyotype.
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