VEHICULOS DE TRANSPORTE PARA MACROMOLECULAS

k
OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
19
k
2 137 623
kInt. Cl. : C07D 213/20
11 Número de publicación:
6
51
ESPAÑA
k
A61K 31/44
TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA
12
kNúmero de solicitud europea: 96202095.4
kFecha de presentación : 24.07.1996
kNúmero de publicación de la solicitud: 0 755 924
kFecha de publicación de la solicitud: 29.01.1997
T3
86
86
87
87
k
54 Tı́tulo: Vehı́culos de transporte para macromoléculas.
k
73 Titular/es:
k
72 Inventor/es:
k
74 Agente: Gil Vega, Vı́ctor
30 Prioridad: 25.07.1995 NL 1000884
Stichting voor de Technische Wetenschappen
Van Vollenhovenlaan 661 P.O. Box 3021
3502 GA Utrecht, NL
Rijksuniversiteit te Groningen y
STICHTING SCHEIKUNDIG ONDERZOEK
IN NEDERLANS (SON)
45 Fecha de la publicación de la mención BOPI:
16.12.1999
45 Fecha de la publicación del folleto de patente:
ES 2 137 623 T3
16.12.1999
Aviso:
k
k
Engberts, Jan Bernard Frederik Nicolaas;
Wagenaar, Anno;
Hoekstra, Dirk;
van der Woude, Irene y
Ruiters, Marcel Herman Jozef
k
En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletı́n europeo de patentes,
de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina
Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar
motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de
oposición (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
ES 2 137 623 T3
DESCRIPCION
Vehı́culos de transporte para macromoléculas.
5
10
15
La presente invención se refiere a nuevos compuestos capaces de introducir macromoléculas en células
eucariotas.
La introducción de macromoléculas, incluyendo DNA, proteı́nas y similares, en células eucariotas
puede realizarse de diversas maneras, por ejemplo por medio de vehı́culos de transporte. Tales vehı́culos
introducen una molécula en la célula, por ejemplo mediante endocitosis. Los vehı́culos pueden ligar o
también, por ejemplo, encapsular las moléculas a transportar. En el último caso, los vehı́culos se denominan vesı́culas. Entre las vesı́culas ya conocidas se hallan los liposomas, que constan de una bicapa de
fosfolı́pidos.
El documento EP-A516 194 da a conocer preparados farmacéuticos que contienen compuestos anfifı́licos catiónicos y además un anión monovalente y un compuesto antivı́rico.
El documento US-A-4,824,850 describe compuestos adaptados para el suministro continuo/de acción
especı́fica de especies de fármacos de acción central al cerebro.
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Los liposomas se utilizan, por ejemplo, para introducir medicamentos en la célula. Se comprobó que
los liposomas se incorporan a la célula tanto in vivo como in vitro por medio de endocitosis (Nandi, P.K.
et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 16722; Heath, T.D. (1987) Methods Enzymol. 149:111). Esto significa
que la mayor parte del material incorporado a la célula aparecerá finalmente en el aparato liposomal,
donde se descompondrá. Esto supone obviamente una gran desventaja, en particular para sustancias que
tienen su efecto en el citoplasma del núcleo.
Si las sustancias a introducir son hidrofı́licas será muy difı́cil introducirlas en liposomas. La mayor
parte del material permanece en la fase acuosa. Ésta es una desventaja obvia, especialmente en el caso
de sustancias caras, como sondas y una gran cantidad de medicamentos.
Para impedir que las sustancias a introducir en la célula acaben en ésta por medio de endocitosis,
se han realizado diversos intentos de utilizar fosfolı́pidos fusogénicos como vehı́culos de transporte. La
utilización de fosfolı́pidos fusogénicos deberı́a resultar en la fusión de las vesı́culas formadas a partir de
los fosfolı́pidos fusogénicos con la membrana celular, introduciéndose ası́ su contenido en la célula. Sin
embargo, dichos intentos no han tenido mucho éxito, debido a que los liposomas fusogénicos tienen una
gran tendencia a unirse entre sı́ en lugar de fusionarse con la membrana celular (Fonteijn, T.A.A., Ph.
D. Thesis (1992)).
Una de las aplicaciones más importantes en las que se introducen moléculas en una célula es la transfección de la célula (eucariota) con DNA o RNA. La transfección se utiliza para estudiar la función y la
regulación de genes y proteı́nas, pero también para la modificación genética de microorganismos, plantas
y animales. Existen un gran número de técnicas artificiales que permiten la introducción de DNA en una
célula, incluida la microinyección de DNA, la coprecipitación de DNA dentro de sales inorgánicas o con
policationes, la encapsulación de DNA en liposomas y la permeabilización de la membrana celular por
medios quı́micos o fı́sicos.
Una técnica más reciente (Felgner, P.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 1987 vol. 84, 7413-7417)
implica la utilización de moléculas anfifı́licas de amonio cuaternario como vehı́culos de transporte. Uno de
los anfifilos más conocidos es el anfifilo de amonio cuaternario DOTMA (cloruro de N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetil-amonio) que, en combinación con dioleil-fosfatidil-etanol-amina (DOPE), está disponible comercialmente con el nombre de LipofectineT M . Ambas moléculas son lipı́dicas (análogas), que
forman liposomas, que formarán complejos con los ácidos nucléicos cargados negativamente. Según cabe
suponer, los liposomas se unen con la membrana plasmática e introducen de este modo ácidos nucléicos
en la célula. Sin embargo, también podrı́a realizarse por medio de endocitosis. El mecanismo exacto aún
no se conoce. Con la ayuda de LipofectineT M puede aumentarse la eficacia de la transfección en un factor
de 30 con respecto a otros sistemas conocidos, incluido el método clásico de precipitación de fosfato de
calcio. Sin embargo, la desventaja de LipofectineT M es su toxicidad y, por lo tanto, su utilización in vivo
puede resultar dificultosa o imposible. Por consiguiente, sigue existiendo una demanda de otros y mejores
métodos de transfección.
El propósito de la presente invención es proporcionar nuevos compuestos anfifı́licos catiónicos de gran
2
ES 2 137 623 T3
eficacia para la introducción en una célula de ácidos nucléicos y otras macromoléculas, incluidos, por
ejemplo, proteı́nas y medicamentos.
5
10
15
La invención logra dicho propósito mediante compuestos según la reivindicación 1. El objeto de las
reivindicaciones 2 a 13 son compuestos preferidos. Un compuesto particularmente ventajoso según la
invención es cloruro de 1-metil-4-(19-cis,cis-heptatritiaconta-9,28-dienil)-piridinio (SAINT-2). Los compuestos según la invención están basados todos en un anillo de piridina, sustituido en una o dos posiciones
por una cadena de ar(alquilo) larga. Se ha descubierto que con los anfifilos según la invención, y especialmente con el compuesto aquı́ denominado “SAINT-2”, puede lograrse una eficacia de transfección que,
dependiendo del tipo de célula, es como mı́nimo ocho veces mayor que la de LipofectineT M .
Con SAINT-2/DOPE se ha demostrado también la posibilidad de introducir proteı́nas, en particular
gelonina (30kD), en la célula. Pueden transfectarse otros tipos de células, en particular células renales
de crı́as de hámster (BHK (Baby Hamster Kidney). Esto es imposible con LipofectineT M para células de
BHK. SAINT-2/DOPE proporciona incluso mejores resultados con células de BHK que LipofectineT M
con células de COS-7.
Los compuestos según la invención pueden sintetizarse de un modo bien conocido. La sı́ntesis se
ilustrará posteriormente con ejemplos.
20
Los anfifilos según la invención pueden utilizarse en un gran número de aplicaciones.
25
El transporte al interior de la célula de ácidos nucléicos y sus derivados es importante para la transfección, El objeto de la transfección es, por ejemplo, producir proteı́nas o realizar investigaciones. Además,
los ácidos nucléicos transfectados, tal vez marcados con estreptavidina o radioactivamente, pueden utilizarse para la hibridación in situ. Una aplicación más avanzada es influir en la expresión génica, por
ejemplo bloqueando genes mediante cadenas antisentido. La expresión génica puede también estimularse.
Además pueden reemplazarse los genes defectuosos. Las últimas dos aplicaciones son de particular importancia en la terapia génica.
30
La ventaja de los compuestos según la invención es que, comparados con los vehı́culos de transporte
ya conocidos, pueden utilizarse en concentraciones mucho menores, no tóxicas. Probablemente no provoquen tampoco respuesta inmunológica.
35
Si se ha de introducir en una célula DNA y/o RNA, los compuestos y los ácidos nucléicos se han de
mezclar en una cierta relación. Se ha descubierto que para los anfifilos ya conocidos, incluido DOTMA,
existe una concentración de anfifilo óptima (Felgner, P.L. et al. (1987) Proc. Natl. Acade. Sci. EE.UU.
84:7413). La eficacia de transfección se reduce de nuevo si se excede cierta cantidad. Para los compuestos
según la invención la situación es comparable.
40
Los anfifilos catiónicos según la invención pueden utilizarse también para transportar proteı́nas cargadas negativamente, incluida la gelonina en particular, al interior de la célula.
45
50
Los anfifilos pueden utilizarse también para transportar sustancias como los citostáticos. Los citostáticos lipofı́licos en particular interaccionan con los compuestos según la invención y pueden introducirse ası́ en la célula con una gran eficacia.
En una realización preferida de la invención, los vehı́culos de transporte pueden llevarse de forma intencionada a un sitio especı́fico mezclando los anfifilos con una molécula de elección de objetivo, tal como,
por ejemplo, un anticuerpo dirigido contra un epı́topo en las proximidades del sitio donde la sustancia
incorporada ha de ejercer su actividad. El anticuerpo se acopla preferentemente al compuesto anfifı́lico,
pero también puede acoplarse, por ejemplo, por medio de un espaciador, a la sustancia que se ha de
transportar. Los compuestos según la invención pueden mezclarse también con un fosfolı́pido o entre sı́,
con el fin de facilitar las traslocaciones de DNA u otras macromoléculas en toda la membrana celular.
55
A continuación se explica la invención más detalladamente por medio de los ejemplos adjuntos, los
cuales sirven únicamente como ilustración y no limitan el alcance de la invención.
60
3
ES 2 137 623 T3
Ejemplos
Ejemplo 1
5
Sı́ntesis
Los compuestos de fórmula estructural general
10
15
20
pueden dividirse en un cierto número de grupos, dependiendo de sus sustituyentes. A continuación se
indica la sı́ntesis de cuatro de estos grupos a modo de ejemplo.
25
1.Sales de N-alquil-piridinio sustituidas en 4
1.1. Sı́ntesis de cloruro de 1-metil-4-(1-octadecil-nonadecil)-piridinio
30
El compuesto se sintetiza de acuerdo con el esquema 1 siguiente, según lo descrito por E.J.R. Sudhölter
en su Ph.D. thesis en la universidad de Groningen, 1981, página 37.
Esquema 1
35
40
45
1.2. Sı́ntesis de cloruro de 1-metil-4-(19-cis,cis-heptatritiaconta-9,28-dienil)-piridinio (SAINT-2)
El esquema 2 describe la secuencia de las reacciones.
Esquema 2
50
55
60
4
ES 2 137 623 T3
5
10
15
La sı́ntesis se realizó bajo nitrógeno. 2,226 gr (0,022 moles) de diisopropil-amina se disolvieron en
15 ml de dietil-éter seco. Luego se añadieron gota a gota 13,8 ml (1,6 M) de n-butil-litio en n-hexano
a 0◦ C. Acto seguido se agitó la mezcla durante 10 minutos. Esta mezcla se añadió gota a gota a 0,931
gr (0,01 moles) de 4-picolina en 10 ml de dietil-éter a -20◦ C. Después se agitó durante otros 30 minutos.
La mezcla de reacción adquirió un color naranja intenso. Luego se añadieron de una vez 7,567 gr (0,020
moles) de yoduro de oleı́lo (85 % cis) en 5 ml de dietil-éter. La temperatura aumentó a 0◦ C durante la
agitación. Acto seguido se agitó la mezcla durante una noche a temperatura ambiente. Al dı́a siguiente se
añadieron 100 ml de dietil-éter a la mezcla de reacción y a continuación 40 ml de H2 O. La capa orgánica
se separó y se lavó con 3 porciones de 30 ml de H2 O. La capa de éter se secó en Na2 SO2 , se filtró y se
condensó. El residuo (5,9 gr) es un aceite marrón viscoso, que se purificó sobre una columna de 100 gr
de Al2 O3 neutro (act. 2-3). Como eluyente se utilizó una mezcla de n-hexano-dietil-éter (8:2). Se obtuvieron 4,32 gr (0,0073 moles) de 4-(19-cis,cis-heptatritiaconta-9,28-dienil)-piridina (producto intermedio
1b2, rendimiento 73 %).
Datos de NMR (resonancia magnética nuclear): 1 H NMR(CDCl3 ): δ 0,89 (t, 6H); 1,27 (cadena, 52H);
2,0 (m, 8H); 2,43 (tr, 1H); 5,34 (m, 4H); 7,06 (d, JH,H =6Hz, 2H); 8,49 (d, JH,H =6Hz, 2H). 13 C NMR: δ
14,0 (CH3 ); 22,6; 27,1; 27,3; 29,1; 29,2; 29,4; 29,5; 29,6; 29,7; 31,8; 36,1 (cadena CH2 ); 45,5 (CH); 123,1
(CH) 129,7 (CH); 129,8 (CH); 149,5 (CH); 155,3 (C).
20
1,527 gr (0,0025 moles) de producto intermedio 1 se disolvieron en 10 ml de acetona. Acto seguido se
añadieron 2 ml de yoduro de metilo y se mantuvo la mezcla en ebullición durante 3 horas. Después de
evaporar el disolvente se obtuvo un aceite viscoso de color marrón amarillento claro, con un rendimiento
de 0,8 gr (producto intermedio 1b1, rendimiento 97 %).
25
Datos de NMR: 1 H NMR(CDCl3): δ 0,85 (t, 6H); 1,23 (cadena, 44H); 1,55 (m, 4H); 1,73 (m, 4H);
2,00 (m, 8H); 2,77 (m, 1H); 4,7 (2, 3H); 5,31 (m, 4H); 7,74 (d, JH,H =6,7HZ, 2H); 9,31 (d, JH,H =6,7Hz,
2H). 13 C NMR: δ 13,9 (CH3 ); 22,4; 26,9; 27,2; 28,9; 29,1; 29,3; 29,4; 29,5; 31,6; 35,4 (cadena CH2 ); 46,4
(CH); 48,3 (N-CH3 ); 126,8 (CH); 129,5 (CH); 129,7 (CH); 144,9 (CH); 167,1 (C).
30
0,4 gr (0,00054 moles) de producto intermedio 2 se disolvieron en 3 ml de metanol y esta solución se
eluyó con metanol sobre una columna Dowex (1*8, 200-400 mesh forma Cl− ). Se obtuvo el compuesto
1b en forma de un aceite viscoso, con un rendimiento de 0,319 gr (0,00049 moles, 92 %).
35
Datos de NMR: 1 H NMR(CDCl3 ): δ 0,87 (t, 6H); 1,26 (cadena CH2 , 44H); 1,57 (m, 4H); 1,75 (m, 4H);
2,00 (m, 8H); 2,77 (m, 1H); 4,77 (s, 3H); 5,32 (m, 4H); 7,15 (d, JH,H =6,2Hz, 2H); 9,50 (d, JH,H =6,2Hz,
2H).
1.3. Sı́ntesis de cloruro de 1-(1-butil-N,N,N-trimetil-amonio)-4-(17-tritiacontanil)-piridinio
40
Este compuesto se sintetizó según el esquema 3 siguiente.
Esquema 3
45
50
55
2. Sales de N-alquil-piridinio disustituidas 3,5
60
La sı́ntesis general según el esquema 4 siguiente ha sido descrita en la literatura por Sudhölter (vide
supra) y Wang et al., J. Org. Chem. 42, 1286 (1977).
5
ES 2 137 623 T3
Esquema 4
5
10
15
2.1. Cloruro de 1-metil-3,5-dicarbo-N-octadeciloxi)-piridinio
20
Este compuesto se sintetizó según el esquema 4.
Datos de NMR: 1 H NMR(CDCl3): δ 0,85 (t, 6H); 1,30 (cadena, 64H); 4,40 (t, 4H); 5,03 (s, 3H); 9,20
(t, 1H); 10,00 (d, 2H).
25
3. Sales de N-alquil-piridinio sustituidas en 4
La sı́ntesis ha sido descrita por F.J.A. Hundscheid y J.B.F.N. Engberts, J. Org. Chem. 49, 3088
(1984).
30
3.1. Yoduro de 1-metil-4((n-hexadeciloxi)-carbonil)-piridinio
La sı́ntesis de este compuesto y su caracterización han sido descritas por Hundscheid y Engberts (vide
supra).
35
Datos de NMR: 1 H NMR(CDCl3 ): δ 0,9 (t, 3H); 1,25 (m, 28H); 4,35 (t, 2H); 4,70 (s, 3H); 8,35 (d,
2H); 9,35 (d, 2H).
4. Sales de N-aralquil-piridinio sustituidas en 4
40
45
4.1. Yoduro de 1-(3-fenil-1-propil)-4-n-dodecil-piridinio
El compuesto se sintetizó hirviendo una mezcla de 2,26 gr (9,2 mmoles) de 1-iodo-3-fenil-propano y
2,57 gr (10,0 mmoles) de 4-n-dodecil-piridina en 35 ml de acetona seca durante 16 horas. Se evaporó el
disolvente y se recristalizó la sustancia amarilla sólida a partir de THF/éter. El rendimiento es de 3,06
gr (6,2 mmoles), punto de fusión 79,0-80,0◦C.
Datos de NMR: 1 H NMR(CDCl3 ):δ 0,83 (t, 3H); 1,21 (cadena, 20H); 1,61 (m, 2H); 2,36 (m, 2H); 2,78
(m, 2H); 4,89 (t, 2H); 7,05-7,20 (m, 5H); 7,73 (d, 2H); 9,30 (d, 2H).
50
Ejemplo 2
Formación de vesı́culas unilamelares
55
60
Se secó bajo N2 (g) una cantidad adecuada de lı́pido. En caso de combinaciones de sustancias, éstas
se mezclan primero y luego se secan. A continuación se seca la pelı́cula de lı́pido adicionalmente bajo
vacı́o. Después se suspenden los lı́pidos, se someten a torbellino y acto seguido a una sonicación en un
volumen adecuado de agua hasta que la solución se vuelve transparente.
Ejemplo 3
Transfección de células eucariotas mediante compuestos según la invención
6
ES 2 137 623 T3
5
10
15
20
25
DNA y vesı́culas unilamelares, preparadas según el ejemplo 2, se introducen ambos en una salina
con tampón Hepes (HBS (Hepes Buffered Saline), pH 7,4; ambos 0,5 ml) y acto seguido se mezclan. El
complejo DNA/anfifilo se forma directamente. En un experimento de transfección tı́pico se utiliza 1 µg
de DNA y 7,5-10 µg del anfifilo SAINT-2 (cloruro de 1-metil-4-(19-cis,cis-heptatritia-contadienil-9-28)piridinio) o 1 µg de DNA y 10-15 µg de anfifilo total (SAINT-2/DOPE 1:1).
Unas células en placas de seis cavidades, cofluentes un 70-80 %, se lavaron dos veces con 1 ml de
HBS y a continuación se añadió 1 ml del complejo DNA/anfifilo por cavidad. Se incubaron las células
durante 4 horas a 37◦C, después de lo cual se añadió 1 ml de medio de Eagle modificado con Dulbecco
(DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium)), al que se habı́a añadido un 10 % de suero bovino fetal
(FCS (Foetal Calf Serum)). Después de una incubación de 16 horas a 37◦ C se cambió el medio por 2
ml de DMEM fresco con un 10 % de FCS. Después de una incubación posterior de 28 horas a 37◦ C se
recogieron las células, que se lavaron dos veces con una salina con tampón fosfato (PBS (Phosphate Buffered Saline)) y se rasparon en 300 µl de tampón 1x lisis (Promega). Las células raspadas se incubaron
durante 10 minutos a 56◦C y a continuación se centrifugaron a velocidad máxima durante dos minutos a
temperatura ambiente. En el sobrenadante se realizó una determinación enzimática (ensayo CAT) y una
determinación proteı́nica (Lowry).
Se incubaron 100 µl del extracto celular junto con 3 µl de 14 C-cloranfenicol (25 mCi/l), 5 µl de Nbutiril-CcoA (2 mg/ml) y 17 µl de Tris.HCL 0,25 M (pH 8,0) durante 90 minutos a 37◦C. Se interrumpió
la reacción mediante la adición de 0,3 ml de xilenos mixtos (Aldrich). Se sometieron las muestras a
torbellino durante 30 segundos y acto seguido se centrifugaron a máxima velocidad durante 3 minutos a
temperatura ambiente. Se extrajo de nuevo la fase orgánica con 0,1 ml de Tris.HCL 0,25 M, se sometió a
torbellino durante 30 segundos y se centrifugó durante 3 minutos. Se añadieron 4 ml de fluido de recuento
a 0,2 ml de la fase orgánica y se midió la radioactividad.
Se descubrió que la transfección de células COS-7 con el nuevo anfifilo (SAINT-2 y SAINT-2/DOPE)
es ocho veces más eficaz que la transfección con vesı́culas DOTMA/DOPE (ver figura 1).
30
Se comprobó que con el nuevo anfifilo también pueden transfectarse otros tipos de células, incluidas
por ejemplo las células BHK (fig. 2). Se comprobó que si se realiza una transfección estable con el
nuevo anfifilo es posible transfectar un 42-45 % de las células COS-7. Con vesı́culas DOTMA/DOPE se
transfectan, por término medio, un 25-29 % de las células.
35
Ejemplo 4
Transporte de proteı́nas en una célula eucariota
40
45
El anfifilo sintético SAINT-2 es, en combinación con DOPE, un agente adecuado para el suministro
de proteı́nas a células. La eficacia de la internalización proteı́nica con SAINT-2/DOPE como portador
puede comprobarse con la ayuda de la proteı́na gelonina. La gelonina internalizada inhibe especı́ficamente
la sı́ntesis proteı́nica de las células y esta inhibición es una medida directa de la cantidad de gelonina
introducida en la célula. Se obtienen vesı́culas unilamelares del agente sintético anfifilo SAINT-2 y DOPE
mediante sonicación en baño. Se añade gelonina a una concentración determinada (0,20 µM) de SAINT2/DOPE en HBS desde una solución madre (2 mg/ml).
Unas células CV-1, cultivadas en placas de doce cavidades, se lavan tres veces con HBS. A continuación se incuban las células durante 1 hora a 37◦C con el complejo anfifilo/gelonina en HBS obtenido
de este modo, después de lo cual se lavan las células de nuevo tres veces con HBS.
50
55
60
La inhibición de la sı́ntesis proteı́nica por la gelonina se sigue mediante la determinación de la incorporación de metionina marcada radioactivamente a las células tratadas. Esto se realiza incubando las
células durante 30 minutos con 1 µCi35 S-metionina. Acto seguido se lavan las células tres veces con PBS
y por último se raspan en un 10 % de TCA. El lisado celular ası́ obtenido se lava tres veces con un 10 %
de TCA y se determina la cantidad de metionina radioactiva presente en la célula con la ayuda de un
contador de centelleo.
La incubación de células CV-1 con el complejo anfifilo/gelonina da como resultado una fuerte inhibición de la sı́ntesis proteı́nica con respecto al experimento de control, en el que las células se incubaron
sólo con el anfifilo sintético. Con una concentración de 5 µM de SAINT-2/DOPE y 1,6 µM de gelonina
se obtuvo un 50 % de inhibición de la sı́ntesis proteı́nica.
7
ES 2 137 623 T3
Ejemplo 5
Estudios de toxicidad
5
10
Para determinar la toxicidad del compuesto SAINT-2 según la invención con respecto a DOTMADOPE se incubaron las células COS-7 con diferentes concentraciones de ambas muestras de lı́pido. El
contenido proteı́nico residual se toma como medida de la cantidad de células supervivientes.
Para DOTMA-DOPE se observó una disminución del contenido proteı́nico de 2 a 1 mg/ml a partir
de 71 µM de lı́pido. Para SAINT-2 se observó una disminución de 1 a 1,75 mg/ml a partir de 90 µM.
Esto demuestra claramente que SAINT-2 es menos tóxico que DOTMA-DOPE.
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
8
ES 2 137 623 T3
REIVINDICACIONES
1. Compuestos de fórmula general I
5
10
15
en la que:
R1 es un grupo (C1 -C5 )alquilo, ar(alquilo) o alquilo con un grupo funcional catiónico, como
|
(C1 -C5 )N+ -;
|
20
25
o
R1 es (C1 -C5 alquileno)R5, donde R5 una estructura con la fórmula general I excepto R1
30
X es un contraion de haluro; elegido entre Cl−; I− ; Br; y donde
o bien R3 es hidrógeno y R2 y R4 son idénticos o diferentes y se han elegido del grupo que comprende
(C10 -C20 )alquilo lineal o ramificado, un (C10 -C20 )alquenilo mono o poliinsaturado, O=C-O-alquilo,
35
O-C-alquilo,
k
O
40
o ar(alquilo),
o bien R2 y R4 son hidrógeno y R3 es -CH(R5 )2 , comprendiendo (C10 -C20 )alquilo, (C10 C20 )alquenilo mono o poliinsaturado, O=C-O-alquilo,
45
O-C-alquilo,
k
O
50
o aralquilo,
quedando excluidos los compuestos con la fórmula general I en la que R1 es CH3 , R2 y R4 son
hidrógeno, R3 es (C16 H33 )2 CH y X es todos los contraiones mencionados (Cl− , I− , Br− ) y quedando
excluidos los compuestos en los que R1 es CH3 , R2 y R4 son C16 H33 -O-C(O), R3 es hidrógeno y
X es todos los contraiones mencionados (Cl− , I− , Br− ), y yoduro de 3,5-bis-(deciloxi)-carbonil-1metil-piridinio.
55
2. Compuestos según la reivindicación 1, caracterizados porque R1 es CH3 , R2 y R4 son hidrógeno,
R3 es (C18 H37 )2 CH y X es Cl−, Br− , I− .
3. Compuestos según la reivindicación 1, caracterizados porque R1 es CH3 , R2 y R4 son hidrógeno,
R3 es (C18 H35 )2 CH y X es Cl−, Br− , I− .
60
4. Compuestos según la reivindicación 1, caracterizados porque R1 es (CH2 )4 -N-(CH3 )3 , R2 y R4
son hidrógeno, R3 es (C18 H35 )2 CH y X es Cl− , Br− , I− .
9
ES 2 137 623 T3
5. Compuestos según la reivindicación 1, caracterizados porque R1 es CH3 , R2 y R4 son C18 H37 O-C(O), R3 es hidrógeno y X es Cl− , Br− , I− .
5
6. Compuestos según la reivindicación 1, caracterizados porque R1 es CH3 , R2 y R4 son R5 -O-C(O),
donde R5 es una cadena alifática C10 -C20 saturada, R3 es hidrógeno y X es Cl−, Br− , I− .
7. Compuestos según la reivindicación 1, caracterizados porque R1 es CH3 , R2 y R4 no son idénticos
y cada uno representa un grupo con la fórmula R5 -O-C(O), donde R5 es un alquilo C10 -C20 , R3 es
hidrógeno y X es Cl−, Br− , I− .
10
8. Compuestos según la reivindicación 1, caracterizados porque R1 es CH3 , R3 es un grupo con la
fórmula R5 -O-C(O), donde R5 es un alquilo C10 -C20 , R2 y R4 son hidrógeno y X es Cl− , Br− o I− .
9. Compuestos según la reivindicación 8, caracterizados porque R5 es C16 H33 .
15
10. Compuestos según la reivindicación 1, caracterizados porque R1 es (CH2 )n -C6 H5 , donde n =
3-6, R2 y R4 son hidrógeno, R3 es alquilo o alquenilo y X es Cl− , Br− o I− .
20
11. Compuesto según la reivindicación 10, caracterizado porque R1 es (CH2 )3 -C6 H5 , R2 y R4 son
hidrógeno, R3 es n-C12 H25 y X es Cl−, Br− o I− .
12. Compuestos según la reivindicación 1, caracterizados porque R1 es (CH2 )4 , R2 y R4 son
hidrógeno, R3 es (C18 H35 )2 CH, X es Cl−, Br− , I− y R5 es el grupo con la fórmula general I, ligado
mediante R1 , donde R2 y R4 son hidrógeno, R3 es (C18 H35 )2 CH y X es Cl− , Br− , I− .
25
13. Compuestos según una de las reivindicaciones anteriores para su utilización como herramienta
para introducir macromoléculas en células.
30
14. Composición para introducir macromoléculas en células, que comprende vesı́culas u otro tipo de
agregado formado por, como mı́nimo, un compuesto según una de las reivindicaciones anteriores en un
disolvente.
15. Composición según la reivindicación 14, caracterizada porque, como mı́nimo, una macromolécula
se incorpora y/o se une a las vesı́culas.
35
16. Composición según la reivindicación 14 ó 15, caracterizada porque además se une a las vesı́culas,
como mı́nimo, una molécula de elección de objetivo.
40
17. Composición según la reivindicación 15, caracterizada porque la molécula de elección de objetivo es un anticuerpo.
18. Composición según la reivindicación 16, caracterizada porque el anticuerpo está marcado radioactivamente o con estreptavidina.
45
50
55
60
NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE)
y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la
aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a
España y solicitadas antes del 7-10-1992, no producirán ningún efecto en España en
la medida en que confieran protección a productos quı́micos y farmacéuticos como
tales.
Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluı́da en la mencionada
reserva.
10
ES 2 137 623 T3
11
ES 2 137 623 T3
12
ES 2 137 623 T3
13