UNIVERSIDAD PERUANA CAYETANO HEREDIA FACULTAD DE CIENCIAS Y FILOSOFIA DEPARTAMENTO BIOQUIMICA, BIOLOGIA MOLECULAR Y FARMACOLOGIA SECCION DE BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR PRACTICAS DE LABORATORIO EN BIOQUIMICA SEGUNDO SEMESTRE – 2007-II ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS Introducción La electroforesis de proteínas se basa en la migración de proteínas a través de un campo eléctrico. Esta técnica es útil como un método analítico, ya que las proteínas pueden ser separadas y visualizadas, sean analizadas en su conformación nativa como denaturada. La electroforesis permite determinar el peso molecular de una proteína o si está formada por varias subunidades. Estas características pueden determinarse dependiendo del tipo de electroforesis que se realice. La electroforesis de proteínas es llevada a cabo generalmente en un gel de poliacrilamida el cual actúa como un tamiz molecular. Electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes El gel SDS-PAGE está compuesto principalmente por los reactivos Acrilamida y bisacrilamida y SDS. Las acrilamidas son agentes que forman polímeros en forma de una red, dejando poros a través de los cuales pasarán las proteínas. El tamaño del poro depende de la concentración de estas acrilamidas. Para manipularlo se debe utilizar mascarilla y guantes ya que es neurotóxica al contacto y por vía respiratoria. El SDS es un detergente que posee carga negativa e interactúa fuertemente con las proteínas, favoreciendo su desnaturalización. La proteína desnaturalizada en presencia de SDS es así recubierta por una carga negativa uniforme (1.5 g de SDS por g de proteína, una molécula de SDS para dos aminoácidos aproximadamente). De esta manera las propiedades eléctricas de cualquier proteína se hacen uniformes y la migración de la proteína en el campo eléctrico no depende de su secuencia particular de aminoácidos si no de su tamaño. Eliminadas otras variables, el factor de migración (Rf) de la proteína será función únicamente de su peso molecular (PM). Al graficar el logaritmo del peso molecular versus la distancia recorrida se observará una recta. La preparación de los geles de poliacrilamida para SDS-PAGE se realiza con el equipo Mini Protean II de Bio-Rad. Dependiendo del tamaño de las muestras que queramos separar se utilizara un gel separador con diferente concentación de acrilamida. Rango efectivo de separación de proteínas en geles de poliacrilamida Rango de tamaños % acrilamida-bisacrilamida separables (kDa) en el gel separador 36-205 5 24-205 7.5 14-205 10 14-66* 12.5 14-45* 15 * las proteínas más grandes no se mueven significativamente en el gel Componentes para la preparación de Geles de Poliacrilamida DENATURANTE NO - DENATURANTE Reactivo Agua Acrilamida:Bisacrilamida (30:0.8 p/v) Tris-HCl 1.5 M pH 8.8 Tris-HCl 1.0 M pH 6.8 SDS 10% TEMED APS (10%) Gel concentrador (5%) (ml) (2geles) Gel separador (12.5%) (ml) (2geles) Gel concentrador (5%) (ml) (2geles) Gel separador (12.5%) (ml) (2geles) 3.4 0.83 3.3 4 3.45 0.83 3.4 4 ---0.63 0.05 0.005 0.05 2.5 ---0.1 0.006 0.1 ---0.63 ---0.005 0.05 2.5 ------0.006 0.1 Objetivos 1. Conocer los principios de la técnica de electroforesis SDS-PAGE. 2. Observar el perfil de proteínas de las diferentes fracciones obtenidas durante la purificación de la Pirazinamidasa por cromatografía de intercambio iónico. Materiales y Reactivos - Azul brillante de Coomassie (tinción del gel) - Buffers: Tris-HCl 1.5M pH 8.8 (gel separador) /Tris-HCl 0.5M pH 6.8 (gel apilamiento) - Buffer de Corrida electroforética (Trizma base 0.025M, SDS 0.1%, Glicina 0.2M) - Buffer Tris-HCL 75mM pH 7.5 - Buffer de muestra 2X- No denaturante (20% glicerol, 0.2% Azul de bromofenol - Buffer de muestra 2X- Denaturante (20% glicerol, 0.2% Azul de bromofenol, 4% SDS y 0.2% B-mercaptoetanol). - Dodecil sulfato de sodio (SDS) al 10% - Persulfato de amonio (APS) 10% - N,N,N´,N´- tetramethyl etilen diamina (TEMED) - Solución de Acrilamida:bisacrilamida (30:0.8) - Cámara electroforética y Fuente de poder - Micropipetas - Guantes, mandil, regla, calculadora, papel milimetrado Preparación del gel SDS-PAGE El gel está compuesto por dos fases (ver figura adjunta): 1) Gel de apilamiento, el cual presenta menor concentración de acrilamida y por lo tanto poros de mayor tamaño. 2) Gel de separación, de mayor concentración y poros de menor tamaño. Para la polimerización (gelificación) del gel, se mezclan las acrilamidas, el buffer Tris, el persulfato de Amonio y el TEMED, en cantidades adecuadas. El persulfato de amonio (APS) dona los radicales necesarios para la polimerizacion de la acrilamidabis-acrilamida, reacción que es acelerada por el TEMED. Esta reacción se inhibe a pH ácido. Tratamiento de la muestras para geles denaturantes 1. Tomar 100 uL de la fracción de purificación y colocar en un tubo de microcentrífuga 2. Agregar 200 uL de Etanol absoluto helado. 3. Dejar en hielo por 10 minutos 4. Centrifugar a 13000 rpm por 5 minutos. 5. Lavar el precipitado con 200ul buffer Tris HCl pH 7.5. 6. Centrifugar a 13000 rpm por 5 minutos, descartar el sobrenadante y volver a centrifugar por 5 segundos para eliminar el resto de buffer. 7. Resuspender el precipitado en 20 ul de buffer Tris HCl pH 7.5 8. Tomar 10 uL de la muestra y mezclar con 10 uL del Buffer de carga de la muestra 2X (Denaturante y No denaturante) , colocar en las tapas parafilm. 9. Hervir la muestra por 5 minutos, transcurrido el tiempo centrifugar durante 5 segundos. 10.Sembrar 10 uL en los pocillos del gel de poliacrilamida. 11. 12.Hacer la electroforesis a 85 Voltios. 13.Detener la corrida cuando el frente de corrida haya llegado ala parte interior del gel. 14.Colorear con Azul de Coomassie R-250 por espacio de 20 minutos. 15. Desteñir los geles con agua caliente. 16. Analizar el gel y discuir los resultados. Tratamiento de la muestras para geles No-Denaturantes El procedimiento para preparar los geles no denaturantes y para el tratamiento de las muestras a correr es el mismo, con la diferencia que el Buffer de carga para el gel NO-denaturante no tiene β-mercaptoetanol, ni DTT (Ditiotreitol), así como los buffers utilizados no tienen SDS. Las muestras tampoco se hierven para evitar su denaturación. CUESTIONARIO 1. ¿Cuál es la función del β-mercaptoetanol? 2. ¿Cuál es el propósito de hervir la muestra antes de la corrida en los geles SDSPAGE? 3. Usted analiza una mezcla de proteínas: la proteína A es dimérica con subunidades de 25 kDa y 55 kDa, y la otra proteína B es dimérica con subunidades idénticas de 35 kDa. Haga un gráfico de los perfiles de corrida que espera encontrar si hace una corrida en gel SDS-PAGE y una corrida en gel PAGE no denaturante. 4. Analice los geles que se han obtenido en la práctica. Se observa diferencia entre los geles denaturante y no denaturante? Qué diferencias observa entre los perfiles de proteínas obtenidos en el extracto crudo y en las fracciones obtenidas durante la purificación? Cómo ha resultado la purificación de la Pirazinamidasa? Discuta los resultados. 5. Grafique en papel milimetrado el peso molecular (MW) de las proteínas del Estándar vs el factor de migración (Rf). Utilizando su gráfico, determine el peso molecular de la enzima Pirazinamidasa.