Extracción y caracterización parcial de pigmentos de hongos

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Extracción y caracterización parcial de
pigmentos de hongos biodeteriorantes
aislados de patrimonio documental
cartográfico
María P Marín 1, Luz Stella Villalba 2* y Catalina Arévalo 3
{
En el presente estudio se realizó la caracterización parcial de pigmentos producidos por hongos deteriorantes de
material cartográfico patrimonial. Se trabajaron tres géneros de hongos: Penicillium Morfotipo 2, Chaetomium
Morfotipo 1 y Stachybotrys Morfotipo 1; los cultivos se realizaron sobre papel y en medio líquido. Únicamente
Penicillium Morfotipo 2 produjo el pigmento característico encontrado sobre el papel, bajo las condiciones de estudio,
la caracterización parcial de este pigmento se realizó mediante espectrometría de masas por impacto electrónico y
se observó que el pigmento está formado por una mezcla de dos derivados de antraquinona: “parietin” y “emodin”.
{
Palabras Clave: pigmentos, papel vegetal, microbiodeterioro, hongos biodeteriorantes, acervo documental.
Introducción
A lo largo de la historia de la humanidad, hechos
de gran trascendencia han sido registrados sobre
papel en libros, cartas, mapas y planos entre otros,
y hoy forman parte importante de la memoria de
nuestras ciudades.
Para preservar estos registros y evitar su deterioro
con el paso del tiempo, entidades como el Archivo
de Bogotá protegen los recursos documentales del
Distrito Capital a través del acopio, la conservación
y la organización de fondos y colecciones con valor
de patrimonio documental para la ciudad (1).
El acervo documental está expuesto a numerosos
factores intrínsecos y extrínsecos de deterioro por
reacciones fisicoquímicas y biológicas, evidentes a
nivel macroscópico y estructural, dichas reacciones
determinan la velocidad del deterioro y el estado de
conservación de los documentos o unidades (2).
Los factores intrínsecos están directamente
relacionados con la composición de los materiales
utilizados en la fabricación de los soportes (3).Dada
la naturaleza orgánica del acervo documental,
se originan reacciones de degradación de las
fibras naturales como la lignina y la celulosa. Estas
reacciones son muy lentas y se manifiestan en los
soportes con un amarillamiento leve sumado a la
pérdida de resistencia del material (2).
Los factores extrínsecos se pueden clasificar en
cuatro grandes grupos: antropogénicos, desastres,
ambientales y biológicos. Como (i) factores antropogénicos se cuentan las malas prácticas de limpieza y almacenamiento, además de la manipulación
inadecuada de la unidad, (ii) entre los desastres se
agrupan cualquier serie de eventos circunstanciales
naturales ó humanos que sean de carácter súbito y
devastador, (iii) los factores ambientales son inherentes al medio en el que se encuentra el soporte
y son parámetros susceptibles de modificación para
lograr condiciones estables para la conservación del
material; entre estos encontramos la temperatura, la
humedad relativa, la luz, los contaminantes atmosféricos y el material particulado y (iv) los factores
biológicos principalmente los microorganismos y
las sustancias secretadas (ácidos, micotoxinas y pig-
1y 3 Universidad Nacional de Colombia. Facultad de Ciencias. Departamento de Química. Bogotá, Colombia.
2 Villalba Corredor, Luz Stella
MSc. Microbiología Ambiental - Universidad Nacional de Colombia. Actualmente responsable del Laboratorio de Ciencias del Centro de Conservación de
la Biblioteca Nacional de Colombia
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mentos, entre otros) por ellos, que afectan en gran
medida el soporte y pueden ocasionar pérdida total
de colecciones (3).
rium oxysporum, el amarillo verdoso del Penicillium
notatum, el café opaco del Chaetomium globosum y
el negro mate de algunos Aspergillus sp. (10, 11).
Los microorganismos son capaces de colonizar y
degradar fácilmente los materiales constituyentes
del patrimonio documental de un archivo o
biblioteca, pues estos encuentran en el papel, la
tinta y diferentes recubrimientos los nutrientes
necesarios para su desarrollo. Esta acción microbiana
tiene un doble efecto negativo en los soportes, por
un lado se destruyen las fibras de celulosa que sirven
como fuente de carbono y durante el metabolismo
secretan sustancias orgánicas que aumentan su
efecto deteriorante.
El propósito de la presente investigación fue caracterizar parcialmente los pigmentos, pues su conocimiento permite establecer procesos idóneos de
intervención para el material documental con esta
problemática. Para el desarrollo de la investigación
se consideraron las siguientes fases: (i) inducción de
la producción de pigmentos sobre muestras de papel vegetal y la realización de cultivos líquidos, (ii)
extracción de los pigmentos obtenidos sobre papel
vegetal utilizando diferentes solventes, (iii) purificación de los pigmentos obtenidos en los medios líquidos por medio de técnicas cromatográficas y (iv)
análisis espectroscópico del pigmento purificado.
De la microflora deteriorante reportada en la
literatura, los hongos prevalecen sobre otros tipos
de microorganismos como las bacterias, debido
a que estas necesitan de sustratos con una alta
actividad de agua (aw) para su desarrollo (4).
Particularmente, los hongos han desarrollado
mecanismos de adaptación que les facilitan la síntesis
de una gran variedad de sustancias complejas a partir
de un simple suministro de Carbono y Nitrógeno.
Entre sus productos de síntesis se encuentran no solo
proteínas celulares y materiales de reserva, también
producen metabolitos secundarios como ácidos
orgánicos, pigmentos, antibióticos y micotoxinas
(5).
Dentro de los agentes biodeteriorantes encontrados
en bibliotecas y archivos alrededor del mundo, son
aproximadamente 234 especies de hongos de 84
géneros diferentes que habitan en los diversos
materiales como pergamino, cuero, pegantes y
papel. Entre los moradores mas comunes están
los géneros Alternaria, Fusarium, Chaetomium y
Penicillium entre muchos otros (6, 7,8).
Como manifestaciones del proceso de biodeterioro, se presenta un grupo de indicadores, los más
frecuentes son las manchas coloreadas, las cuales
se observan con frecuencia en los libros y documentos, estas suelen ser producidas por pigmentos
excretados por los hongos durante su crecimiento.
Estas manchas son características y de diferentes
colores, texturas y tonalidades (9). Ejemplos claros
de pigmentos son el rosa pálido que excreta el Fusa-
MATERIALES Y MÉTODOS
Microorganismos
A partir del banco de cepas de hongos filamentosos
del Laboratorio de Física, Química y Biología del Archivo de Bogotá, se seleccionaron 3 géneros de mayor frecuencia de aislamiento: Penicillium Morfotipo
2, Chaetomium Morfotipo 1 y Stachybotrys Morfotipo
1, para inducir la producción del pigmento deteriorante sobre el papel y en medio líquido.
Los microorganismos conservados en agua, se
sembraron en Agar Papa Dextrosa (PDA) pH 5.5 y se
incubaron a 28ºC durante 7 días.
Obtención de los pigmentos sobre papel vegetal
Selección del papel vegetal: las probetas (fragmentos)
de papel vegetal se seleccionaron de planos
descartados de los fondos, luego del estudio de
valoración documental.
Producción de pigmentos sobre papel vegetal: Luego
de seleccionados los planos se cortaron 15 probetas
de 3cm x 3cm y se esterilizaron a 121ºC y 15 psi
durante 20 minutos. A partir de cultivos jóvenes
de los aislamientos de Penicillium Morfotipo 2,
Chaetomium Morfotipo 1 y Stachybotrys Morfotipo 1,
se sembraron de cada uno cinco plugs sobre Agar
PDA pH 5.5 por caja. Posteriormente en cada punto
de siembra se colocó un fragmentos del papel
vegetal previamente esterilizado, de tal manera que
los microorganismos se encontraran a lo largo de la
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interfase papel – agar. Estos medios se incubaron a
una temperatura de 28 ºC y humedad relativa 100%
(8).
controlando por conductimetría. Posteriormente, el
pigmento se eluyó con etanol al 96% (1L) y llevando
a sequedad el extracto en un rotavapor (12).
Extracción de los pigmentos obtenidos sobre papel
vegetal
Finalmente, el sólido obtenido se redisolvió en
metanol, se separó por CC sobre Sephadex LH20
(600 x 50 mm), eluyendo con metanol a un flujo de
1 mL/min. Las fracciones recogidas se agruparon de
acuerdo a su coloración y se concentraron a presión
reducida almacenándose a 4°C.
Para la extracción de los pigmentos del papel se
utilizaron los siguientes solventes: i) 1,4-Dioxano
y ii) N,N - Dimetilformamida, de acuerdo con el
reporte de Szczepanowska y Lovett, 1992 (8) . A cada
fragmento de papel vegetal de las cajas de Petri se
le retiró el exceso de micelio por raspado con un
escalpelo y se introdujo en un erlenmeyer de 100mL
que contenía 5mL de solvente; estos permanecieron
en agitación a 150rpm por un periodo de 24 horas.
Posteriormente los extractos crudos y el papel
se evaluaron por inspección visual y se tomaron
registros fotográficos.
Determinación de las condiciones óptimas y medio
de cultivo para la obtención de los pigmentos a
partir de cultivos líquidos
Con el fin de establecer el medio de cultivo y las
condiciones a las cuales se producen los pigmentos
para cada género se consideraron los siguientes
medios: (a) caldo Czapeck (NaNO3 0.2%, KH2PO4
0.1%, MgSO4 0.05% y solución de elementos traza
1% [Mo, Mn, Fe y Zn]) en ausencia de luz a 25ºC y
sin agitación, (b) caldo Czapeck en presencia de
luz a temperatura ambiente y 150 rpm; (c) caldo
Sabouraud-Glucosa 2% (Merck) en presencia de
luz a temperatura ambiente y 150 rpm y (d) caldo
Carboximetilcelulosa 1% p/v (Sigma Chemical Co.)
en presencia de luz a temperatura ambiente y 150
rpm.
Purificación del pigmento obtenido en medio
líquido
Después de 7 días el cultivo inicialmente fue filtrado
con una gasa previamente esterilizada para eliminar
el micelio presente. Posteriormente, el sobrenadante
se filtró en un equipo de vacío con una membrana
Milipore de 0.22mm (Nitrato de celulosa) para
eliminar las esporas presentes en el extracto.
El extracto obtenido se cargó en una columna
empacada con resina Amberlita XAD-2 (300 x 50
mm) eluyendo con agua (2L) a un flujo de 1mL/min,
Caracterización parcial del pigmento obtenido en
medio líquido
La caracterización parcial del pigmento se realizó
por espectrometría de masas en modo impacto
electrónico y RMN 1H. El EM-IE fue obtenido en un
equipo Shimadzu modelo QP-5050A con un voltaje
de ionización de 70eV, detectando iones positivos
con m/z entre 50 y 400.
El espectro de RMN 1H se registró en un equipo Bruker
Avance 400 (400 MHz para RMN 1H) empleando
como solvente CDCl3 (99,5%).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Obtención y extracción de pigmentos a partir de
papel vegetal
Durante la primera etapa de la investigación se
pretendía producir los pigmentos sobre papel
vegetal a partir de los tres aislamientos de hongos
seleccionados, pero como se muestra en la Figura
1, no hubo producción aparente de pigmento en los
cultivos de Chaetomium Morfotipo 1 y Stachybotrys
Morfotipo 1, probablemente debido a que el papel
vegetal fue tratado en su momento para la técnica
de reproducción planimétrica conocida como
diazotipia, la cual utilizaba una serie de compuestos
entre ellos ácidos y vapores amoniacales, que puede
afectar el crecimiento, así como la producción de
pigmentos de los microorganismos (13, 14).
Por otra parte, del cultivo a partir de Penicillium
Morfotipo 2 (Figuras 1 y 2) se observó producción
significativa del pigmento amarillo fluorescente;
este género fúngico presenta una gran facilidad de
adaptación y capacidad metabólica representada
en sus enzimas lo que le permite utilizar una gran
diversidad de sustratos y crecer rápidamente (15).
(Figura 2)
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Como no se observó producción aparente de
pigmentos en los cultivos de Chaetomium Morfotipo
1 y Stachybotrys Morfotipo 1, no se realizaron ensayos
de extracción a los fragmentos de papel vegetal
colocados sobre los medios de cultivo.
La extracción del pigmento producido por Penicillium Morfotipo 2 sobre el papel vegetal, se realizó
con N,N-dimetilformamida y 1,4-dioxano (8). En este
caso, más que el tiempo de contacto con el solvente
es fundamental el tipo de interacción que presenta
el pigmento con el mismo. Los resultados mostraron
que con N,N-dimetilformamida se logra una mayor
extracción que la que se alcanza con 1,4-dioxano (Figura 3), por lo cual se puede concluir que el pigmento es de naturaleza polar debido a su afinidad con la
N,N-dimetilformamida.
Por otra parte, la cantidad de pigmento que se extrajo
de los fragmentos de papel vegetal no era detectable
por los equipos utilizados en espectroscopía, razón
por la cual se decidió inducir la producción de los
pigmentos en medios de cultivo líquidos. (Figura 3).
Determinación de las condiciones óptimas y medio
de cultivo para la obtención de los pigmentos en
cultivos líquidos
En los cultivos de los tres morfotipos de hongos
inoculados en caldo Czapeck e incubados durante
15 días a 25ºC, en ausencia de luz y sin agitación
se observó un crecimiento muy lento de los
morfotipos Chaetomium Morfotipo 1 y Stachybotrys
Morfotipo 1 sin producción aparente de pigmento y
para el cultivo de Penicillium Morfotipo 2 se observó
crecimiento lento y producción de una mínima
cantidad del pigmento amarillo. Simultáneamente,
se variaron las condiciones de incubación de caldo
Czapeck , y se encontró que en un tiempo de
incubación de 7 días a temperatura ambiente, en
presencia de luz y con agitación a 150rpm(Figura
4), los aislamientos de Chaetomium Morfotipo 1 y
Stachybotrys Morfotipo 1 no presentan cambios con
respecto al ensayo mencionado anteriormente,
incluso después de una semana más de incubación.
Por otra parte, en el cultivo de Penicillium Morfotipo
2 se observó crecimiento acompañado de una gran
producción de pigmento amarillo fluorescente.
En los cultivos de los hongos filamentosos Chaetomium Morfotipo 1 y Stachybotrys Morfotipo 1 inocu-
lados en caldo Sabouraud – Glucosa 2% e incubados
durante 15 días a Temperatura ambiente, en presencia de luz y con agitación 150rpm(Figura 4) el color
del medio no fue modificado aparentemente por la
producción de pigmentos, aunque se apreció la formación de la estructura micelar. Por otra parte, para
el género Penicillium Morfotipo 2 incubado a las mismas condiciones se observó una gran producción
de micelio, sin presencia evidente del pigmento.
En caldo Carboximetilcelulosa 1%, bajo las mismas
condiciones del cultivo en Sabouraud – Glucosa 2%
(Figura 4) no se observó crecimiento ni producción
de pigmentos para los morfotipos fúngicos evaluados.
Los microorganismos Chaetomium Morfotipo 1 y
Stachybotrys Morfotipo 1, no crecieron de forma
óptima en ninguno de los medios de cultivo
estudiados posiblemente por a las altas exigencias
de nutrientes requeridas por estas dos especies.
Según reportes previos realizados por Andersen
y Nissen (16), estos hongos crecen en medios con
actividades de agua superiores a 0.9 y necesitan altos
contenidos de celulosa debido a su fuerte actividad
celulolítica, sin embargo, estas no son las únicas
condiciones, pues algunas especies necesitan de un
medio específico que contenga vitaminas y otros
compuestos adiciónales para su óptimo desarrollo
(16, 17, 18).
A partir de estos ensayos se concluyó que el caldo
Czapeck a temperatura ambiente, en presencia de
luz y con agitación a 150rpm por siete días, presentó
las mejores condiciones para el crecimiento y
producción del pigmento de Penicillium Morfotipo
2. Este resultado coincide con lo obtenido por otros
investigadores, que reportan como medio de cultivo
óptimo el Czapeck (17) (15) (Figura 4).
Caracterización del pigmento obtenido en medio
líquido
El espectro de masas del aceite amarillo aislado
mostró la presencia de dos iones en m/z 284 y
m/z 270, indicando la presencia de al menos dos
componentes. La mezcla se analizó por CGAR-EM,
usando una columna DB-1, sin que se pudieran
separar, por lo anterior fue necesario hacer el análisis
del espectro de la mezcla en el que se reconoció
un compuesto mayoritario (1) y un compuesto (2)
como el minoritario.
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Compuesto 1. El espectro de masas del pigmento
mostró un ión molecular en m/z 284, correspondiente
a una fórmula C16H12O5 indicando 11 grados de
instauración. Además, se observaron fragmentos
en m/z 255 que corresponde a la pérdida de CHO
a partir del ion molecular [M-CHO]+ que indica la
presencia de un carbonilo en la molécula, en m/z
241 correspondiente a la pérdida de CH3 y CO a
partir del ion molecular [M-CO-CH3]+ que indica
la presencia de un metilo y un carbonilo, y en m/z
213 correspondiente a la pérdida de C2H2O a partir
del fragmento m/z 255 [M-CHO-C2H2O]+ esto indica
la presencia de un metoxilo aromático (Figura 5).
Todo este análisis indica que el compuesto es de
tipo fenólico con grupo metóxido sustituyente.
Una búsqueda en la base de datos Wiley indicó que
este compuesto podría ser “parietin” (1,8-dihidroxi6-metil-3-metoxiantraquinona). En el espectro de
RMN 1H se observa la presencia de una señal en
2,16 (singlete), atribuible a un metilo sobre anillo
aromático, un singlete en 3.48, correspondiente
a los protones de un metoxilo, y una serie de
señales entre 7.16 y 7.76 atribuibles a los protones
de antraquinona. Estos resultados coinciden con
reportes previos para la molécula “parietin”, no
obstante, la baja calidad del espectro de RMN 1H, por
la presencia de impurezas, no permitió identificar
inequívocamente al compuesto antes propuesto
(Figura 5).
Compuesto 2. El espectro de masas del pigmento
mostró un ión molecular en m/z 270 consistente con
una fórmula C15H10O5 con 11 grados de insaturación.
Adicionalmente, se observaron fragmentos en m/z
242 por la pérdida de CO a partir del ion molecular
[M-CO]+ que indica la presencia de un carbonilo en la
molécula, en m/z 241 correspondiente a la pérdida
de CHO a partir del ion molecular [M-CHO]+ esto
también indica la presencia de un carbonilo en la
molécula, y en m/z 213 correspondiente a la pérdida
de CO a partir del fragmento m/z 241 [M-CHO-CO]+
ó de la perdida de CHO a partir del fragmento m/z
242 [M-CO-CHO]+ esto indica la presencia de dos
carbonilos (Figura 6).
Este análisis muestra que el compuesto es también
de tipo fenólico. Una búsqueda en la base de datos
Wiley indicó que este compuesto podría ser “emodin” (1,3,8-trihidroxi-6-metilantraquinona). En el
espectro de RMN1H se observa la presencia de una
señal en 2,16 (singlete), atribuible a un metilo sobre
anillo aromático y una serie de señales entre 7.16 y
7.76 atribuibles a los protones de la antraquinona
presentes en los carbonos 2, 4, 5 y 7. Estos resultados coinciden con reportes previos para la molécula “emodin”, sin embargo, no fue posible identificar
contundentemente el compuesto propuesto, debido a la calidad del espectro de RMN 1H, por la presencia de impurezas (Figura 6).
Con este análisis, así como la comparación con
la base de datos Wiley fue posible aproximarse a
la identificación de los componentes principales
del pigmento amarillo fluorescente producido
por Penicillium Morfotipo 2, microorganismo
deteriorante del patrimonio documental (“parietin”
y “emodin”).
El cromatograma obtenido por CGAR-EM, no mostró
evidencia de la existencia del pigmento, aunque se
obtuvieron señales correspondientes a impurezas
presentes en la fracción inyectada. Atribuimos
que la ausencia de señales correspondientes al
pigmento se deben a que la técnica de separación
no es la indicada para esta clase de compuestos, que
por su alto peso y alta polaridad son determinados
comúnmente por CLAE (Cromatografía Líquida de
Alta Eficiencia) (19, 20, 21, 22).
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Conclusiones
En el presente trabajo se logró la producción del pigmento amarillo
fluorescente de Penicillium Morfotipo 2, (indicador característico en
material documental con biodeterioro), sobre fragmentos de papel
vegetal obtenidos de los fondos documentales del Archivo de Bogotá y
en cultivos líquidos.
Está investigación es el primer estudio en el país de caracterización
preliminar de pigmentos biodeteriorantes y es de gran importancia en
la disciplina de la restauración y conservación de material documental,
pues se logró la extracción de los pigmentos producidos sobre papel
utilizando N,N-dimetilformamida; lo anterior permite una alternativa
de tratamiento para papel afectado por esta patología.
Con respecto a la producción de pigmentos en los cultivos líquidos,
se encontró que en caldo Czapeck incubado durante siete días a
temperatura ambiente, en presencia de luz y con agitación a 150rpm,
Penicillium Morfotipo 2 creció y produjo cantidad significativa de
pigmento, mientras que los otros dos morfotipos de hongos no
crecieron ni produjeron pigmentos.
Finalmente, el análisis espectroscópico del extracto purificado, permite
sugerir la existencia de una mezcla de dos derivados de antraquinona
(“parietin” y “emodin”) como componentes principales del pigmento
producido por Penicillium Morfotipo 2.
El componente parietin se ha referenciado con actividad anti fúngica
para el moho de la cebada y el pepino y hace parte de ciertos líquenes,
ofreciendo protección contra los rayos ultravioletas al alga simbionte.
Para el caso del emodin, es ya conocida su acción en la terapia anti
cáncer. Lo anterior determina perspectivas de investigación en este
campo para el uso de los pigmentos fúngicos en farmacología.
AGRADECIMIENTOS
Los autores desean expresar sus agradecimientos al grupo
de investigación Estudio y Aprovechamiento de Productos
Naturales Marinos y Frutas de Colombia, en especial al
profesor Leonardo Castellanos por su valioso aporte y
asesoría durante el desarrollo de la investigación.
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Figura 1. Producción de pigmentos sobre papel vegetal en Agar PDA incubados a 28ºC durante 7 días. De izquierda a derecha: Penicillium Morfotipo 2,
Chaetomium Morfotipo 1 y Stachybotrys Morfotipo 1.
Figura 2. Anverso de la caja de Petri de Penicillium Morfotipo 2 cultivado para la producción de pigmento sobre papel vegetal en Agar PDA
Figura 3. Extracción de los pigmentos producidos sobre papel vegetal con 1,4-dioxano y N,N-dimetilformamida (DFM).
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Figura 4. Cultivos líquidos evaluados para la producción de pigmentos de hongos filamentosos deteriorantes: Czapeck, Sabouraud y Carboximetilcelulosa
1%(CMC).
Figura 5. Propuesta de fragmentación del primer compuesto bajo EM de
impacto electrónico.
Figura 6. Propuesta de fragmentación del segundo compuesto bajo EM
de impacto electrónico.