C5-Aplicaciones en medicina

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5. APLICACIONES EN MEDICINA
5.1 Radiación láser sobre el tejido vivo.
Las características principales de la luz láser (coherente y monocromática) permiten
enfocar el haz emitido por estos sistemas de manera muy precisa y a dimensiones muy
pequeñas. El poder concentrar una gran cantidad de energía en una pequeña región en el
espacio es de suma importancia para aplicaciones quirúrgicas, ya que, entre otras cosas,
permite realizar cortes con gran precisión.
Los tipos de sistemas láser que tienen aplicaciones médicas varían de acuerdo a la
aplicación en particular. Es necesario determinar, por ejemplo, de acuerdo al problema a
tratar, cual es la longitud de onda más adecuada así como la potencia requerida.
Fundamentalmente, estos parámetros y la interacción de la luz con los organismos vivos a
tratar determinan la utilidad de un sistema láser para aplicaciones médicas y de análisis
clínico.
5.1.1 Interacciones entre la luz y el tejido.
Procesos básicos que causan atenuación y ocurren durante la interacción de un haz de luz
con una muestra de material:
• Reflexión: dependiendo del tipo de superficie (suave o rugosa) puede ser similar
a la reflexión de un espejo o difusa.
• Absorción: por lo general se debe a agentes de color dentro de la muestra
(cromóforos) y generalmente, la luz absorbida se transforma en calor.
• Esparcimiento (scattering): la trayectoria del haz se divide en distintas
direcciones; es obvia, por ejemplo, cuando el haz de luz pasa a través de humo o
niebla.
Todos estos procesos son altamente dependientes de la longitud de onda del haz de luz
incidente.
El tejido biológico atenúa la luz por los mismos procesos: se presenta reflexión del
haz en la superficie del tejido (e.g., la piel), y hay además un efecto dispersivo grande
dentro del tejido. La absorción, que es altamente dependiente de la longitud de
onda, se presenta debido a agentes cromóforos como el agua, hemoglobina y melanina.
• Agua: absorción alta en el UV y en partes del espectro IR, transmisión alta en el
visible.
• Hemoglobina: absorción en el UV y en la parte azul-verde del espectro (λ<0.6
µm); no absorbe en el rojo.
• Melanina: varía dependiendo del tipo; el pigmento de melanina en la piel absorbe
en las partes visible y NIR del espectro.
En general, la interacción entre la luz y el tejido puede ser de dos tipos: térmica y notérmica. Esta última es la que se genera por medio de otros agentes que se suministran al
tejido para analizarlo o para realizar algún tipo de tratamiento (e.g., terapia
fotodinámica). Existe también el proceso de foto-ablación, en el que el tejido se expone
a un haz enfocado proveniente de un láser de excímero produciéndose un corte limpio
del tejido. Este proceso se produce por una interacción en la que aparentemente no se
genera calor, en principio, debido a la alta energía que contienen los fotones a esta
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longitud de onda (UV). Sin embargo, este efecto ha sido observado también con otros
tipos de láser (CO2 y Er:YAG).
Interacción térmica: se genera debido a la absorción de luz en el tejido; este
intercambio de energía se manifiesta en forma de calor, causando un incremento en la
temperatura. Los efectos importantes originados por este tipo de interacción son la
coagulación, el daño térmico (quemaduras) y la vaporización del tejido. La
descripción teórica de este tipo de interacción, por ejemplo, las variaciones de la
temperatura del tejido en función del tiempo (T(t)), se basa en las teorías desarrolladas
para la ciencia de materiales (transferencia de calor).
Para temperaturas menores a los 40°°C, generalmente se observan efectos que
no son dañinos. Al aumentar la temperatura a un rango mayor y mantenerla por
un tiempo largo se pueden presentar daños en las células. Para temperaturas mayores
a los 100°°C el agua comienza a evaporarse y si esta se evapora por completo la
temperatura sigue elevándose hasta la temperatura de ablación (TA), a la cual los
otros componentes del tejido se comienzan a evaporar. Este proceso es el que se sigue
para remover tejido.
En la cirugía láser, el haz se enfoca en un punto muy pequeño y si la densidad
de potencia es lo suficientemente grande, la temperatura se eleva hasta un valor
mayor al de TA. En toda la región cercana al punto de exposición se genera un
gradiente de temperatura, localizándose el máximo en la región central de exposición,
mientras que en las regiones vecinas comienza a decrecer. En la región central se
forma un agujero y se remueve el tejido, mientras que la variación de temperaturas
en las regiones vecinas genera distintos efectos como daño térmico al tejido y
coagulación.
Para entender los efectos que ocurren durante la interacción de un haz de luz láser
con el tejido, es conveniente revisar que pasa cuando un haz de luz de este tipo interactúa
con un material de manera general.
Transmisión de luz láser a través de materiales
Cuando un haz de luz colimado pasa a
través de una muestra de material,
únicamente una fracción de la energía se
transmite. El resto se pierde por tres
procesos
fundamentales:
reflexión,
absorción y esparcimiento (scattering).
Conociendo la intensidad o irradiancia del
haz y por conservación de energía
podemos establecer que:
Ii = Ir + Is + Ia + It
(1)
en donde se desprecian reflexiones en la segunda superficie del material.
Reflexión: Puede caracterizarse por un coeficiente que es función del índice de refracción
del material. Puede demostrarse que para una incidencia normal a la superficie del
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material con índice de refracción n, y considerando que el haz no es absorbido por el
material, la reflectancia está dada por:
I r (n − 1)
=
I i (n + 1)2
2
R=
(2)
Absorción: El proceso de absorción puede presentarse de diferentes maneras incluyendo
transiciones electrónicas y vibraciones moleculares. En la gran mayoría de los casos, la
atenuación del haz debida a la absorción se expresa en términos de la ley de BeerLambert:
I ( x) = I (0) Exp[− αx]
(3)
El factor α (unidades de L-1) se conoce como coeficiente de absorción y es
característico para cada material. Un par de cantidades importantes derivadas de esta
expresión son la profundidad de penetración (longitud a la cual se obtiene un tercio de
la intensidad de entrada) y la longitud de extinción (longitud a la cual se obtiene el 1%
de la intensidad a la entrada).
En general, el coeficiente de absorción, y por lo tanto las longitudes antes
mencionadas, son dependientes de la longitud de onda.
Dispersión: se relaciona con el cambio de dirección que sufre alguna fracción del
rayo; esta fracción eventualmente se absorbe o se escapa de la muestra. Puede
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dividirse en dispersión de superficie (superficies rugosas sin pulir) y dispersión del
grueso del material (defectos en la muestra como fracturas o impurezas). La
atenuación de un haz de luz por dispersión puede aproximarse con la fórmula:
(3)
I ( x) = I (0) Exp[− β x]
en donde β es el coeficiente de dispersión del material.
Si hay atenuación por absorción y por dispersión podemos escribir:
I ( x) = I (0) Exp[− (α + β ) x ] = I (0) Exp[− γx ]
(4)
A partir de la ecuación (1) podemos definir los siguientes parámetros:
It = Ii − Ir − Ia − I s
It
I
I
I
= 1− r − a − s
Ii
Ii Ii Ii
de donde pueden reconocerse:
Ir
→ reflectancia
Ii
Ia
→ absorbancia
Ii
Is
→ razón de dispersión
Ii
Ir + Ia + Is
→ razón de atenuación
Ii
Procesamiento de materiales con sistemas láser.
Consideremos un haz de luz láser con sección
L
transversal A [cm2] e irradiancia I [W/cm2] que
incide en un material. Supongamos que el rayo se
absorbe totalmente a una longitud L [cm] dentro
del material. Despreciando efectos de dispersión
podemos calcular la potencia total absorbida como:
A
Material
P=I A [W]
P representa entonces la potencia absorbida en el cilindro cuya base tiene área A y altura
L. Suponiendo que el periodo de tiempo de exposición es t, la energía depositada en el
cilindro es:
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E=P t [J]
De aquí podemos obtener la fluencia (energía por unidad de área):
E
F= =It J 2
cm
A
[
]
Las propiedades térmicas relevantes del material son la masa (m) y la capacidad térmica
(C). El cambio de temperatura por absorción de energía puede estimarse como:
∆T =
E
,
mC
que es una expresión válida para paredes con aislamiento térmico, y sin considerar
cambios de fase en el material. Esto se puede expresar en términos de la densidad del
material como:
E = Pt = mC∆T = (ρLA)C∆T
Pt
= ρC∆T
ε=
LA
It
ε
∴ ∆T =
=
ρC ρLC
La temperatura final (Tf) se calcula como la temperatura inicial mas el incremento en la
temperatura. Si Tf es lo suficientemente grande, el material puede evaporarse. El
cambio de fase en el material puede considerarse con el calor latente de evaporación
(entalpía, H). Despreciando pérdidas térmicas, la energía requerida para que el tejido
cambie de fase (i.e., se evapore) puede calcularse como:
E = mC∆T + mH = ρLA(C∆T + H )
F=
E
= It = ρL(C∆T + H )
A
Con esto podemos finalmente calcular la razón a la cual se remueve el material
(espesor de la capa evaporada por unidad de tiempo):
E = IAt → IAdt = dE = ρCA∆Tdx + ρHAdx
dE representa la energía necesaria para vaporizar una capa de tejido de espesor dx durante
un tiempo dt. La razón de vaporización es entonces:
u=
dx
I
=
dt ρC∆T + ρH
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De esta expresión se puede distinguir que el procesamiento de materiales está basado
en incrementos de temperatura. El incremento necesario para procesar el material está
determinado por la combinación de parámetros del material y del láser (longitud de onda,
diámetro del haz, tiempo de exposición).
Los efectos de los parámetros del sistema láser pueden describirse de la siguiente forma:
i)
ii)
iii)
iv)
v)
Operación pulsada: los pulsos cortos se absorben casi totalmente en el
material. Si el material se aísla térmicamente pueden reducirse las pérdidas
por calor.
CW: hay más tiempo para que se presenten pérdidas por convección,
conducción y radiación. Eventualmente, se alcanza un equilibrio (energía
absorbida por unidad de tiempo igual a pérdidas de energía).
Longitud de onda: se elige dependiendo del objetivo y del material
(profundidad de penetración, longitud de extinción, etc.)
Potencia: a mayor potencia el incremento de temperatura es mayor.
Diámetro del haz: si el haz es gaussiano, puede enfocarse en un área
pequeña. Si el volumen de exposición es pequeño, ∆T es grande y es más
fácil vaporizar el material.
Interacción de luz láser con el tejido.
• La mayoría de los tejidos del cuerpo humano contienen más del 70% de agua.
• Cada tejido tiene un espectro de absorción característico.
• Aproximación de primer orden: propiedades similares a las del agua (ver figura).
El tejido absorbe bastante la luz UV
y la azul, pero transmite la luz roja.
Además, la luz que se absorbe en el
tejido
casi
no
experimenta
dispersión. Este parámetro se vuelve
importante únicamente cuando se
utilizan sistemas láser operando en el
visible o en el cercano infrarrojo.
Otro efecto importante es la
luminiscencia del tejido. Existen
básicamente
dos
tipos
de
luminiscencia:
•
Intrínseca (endógena): existen
varios fluoróforos internos como
las proteínas, ácidos nucléicos.
Las proteínas, por ejemplo, tienen una energía de excitación pico a los 280 nm y
emiten en el rango de 320 a 350 nm. En el colágeno la emisión ocurre a los 380 nm
mientras que la melanina tiene un pico de emisión amplio centrado a los 540 nm.
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•
Extrínseca (exógena): cuando el tejido se excita con luz UV, todos los diferentes
fluoróforos pueden emitir luz simultáneamente. Esto hace complicado el estudio de
la luminiscencia intrínseca. Para poder utilizar técnicas como la espectroscopia de
fluorescencia, se deben incorporar fluoróforos extrínsecos que permitan identificar el
tejido que se desea estudiar.
Es evidente que el efecto de un haz de luz láser con el tejido depende de todos los
parámetros del sistema láser.
Tarea:
1. Calcular el incremento de temperatura en una muestra de agua expuesta al haz de un
láser Nd:YAG con los siguientes parámetros:
Sección transversal: 1mm2
Potencia de salida: 1 W
Tiempo de duración del pulso: 2 s
Considerar una temperatura inicial del agua de 20 °C y una profundidad de absorción
de 1 cm. Despreciar la dispersión y las pérdidas por calor.
Solución.
ε
It
El incremento en la temperatura puede evaluarse con ∆T =
=
ρ C ρ LC
Evaluando la densidad de energía: ε =
(1W )( 2 s ) = 200  J 
Pt
=
 cm3 
LA (1 cm ) ( 0.01 cm 2 )
 cal 
 g 
La densidad del agua es ρ = 1  3  , y la capacidad térmica es C = 1  o  .
 cm 
g C
Considerando que 1 J ≈ 0.25 cal , el incremento de temperatura es entonces:

 J  
 cal  
200  3    0.25 


ε
 cm   
 J  
∆T =
=
= 50 oC
ρC


  g    cal 
1  cm3   1  g oC  
  
 

Si la temperatura inicial del agua es de 20 °C, la temperatura final será entonces de 70 °C.
Nótese que la profundidad de penetración puede obtenerse también de las gráficas del
coeficiente de absorción del agua utilizando la longitud de onda del laser (en este caso el
Nd:YAG). También, hay que enfatizar que no se consideran efectos de esparcimiento ni
pérdidas térmicas.
2. Calcular la energía necesaria para vaporiza 1 cm3 de agua iniciando a la temperatura
corporal (Ti=37 °C). A partir de este resultado, obtener una expresión que permita
determinar la energía de umbral de vaporización, la densidad de energía de umbral de
vaporización y la fluencia de umbral de vaporización. Evaluar estos parámetros para
cuando se utiliza un sistema láser de CO2 con una sección transversal de haz de 1 mm2,
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cuya profundidad de absorción es de 0.004 cm. ¿Cuánto tiempo de exposición se
necesita para llegar al umbral de vaporización? ¿Cuál es la razón de vaporización?
Solución.
Para llegar a la temperatura de vaporización (100 °C), se requiere un incremento de
temperatura de 63 °C. Para 1 g de agua, se requieren entonces 265 J de energía para
llegar de la temperatura corporal (37 °C) a la temperatura de vaporización. El calor
latente de vaporización del agua es H=540 cal/g, por lo cual se requieren 2270 J para
convertir 1 g de agua a 100 °C de líquido a vapor (1 cal = 4.2 J). Esto implica que se
necesitan aproximadamente 2500 J para vaporizar 1 cm3 de agua a partir de la
temperatura corporal.
Con este resultado podemos evaluar (para el agua) el umbral de energía de vaporización
para un haz láser con sección transversal A y profundidad de penetración L:
ETH = Pt = 2500 AL [ J ]
El umbral de densidad de energía es entonces ε TH =
Pt
= 2500 [ J ] .
LA
El umbral de fluencia de energía para vaporización es:
 J 
FTH = It = 2500 L  2 
 cm 
Supongamos que utilizamos un laser de CO2 con sección transversal del haz (A) de 1
mm2. El coeficiente de absorción del agua para la longitud de onda de este laser es α =
1000 cm-1, y podemos asumir (arbitrariamente) que L = 4/α =0.004 cm. Con estos datos
podemos calcular:
a) Energía de umbral para ablación (evaporación del agua): ETH=100 mJ
b) Fluencia de energía mínima para ablación: FTH=10 J/cm2
c) Supongamos que el laser tiene una potencia constante P = 10W. Esto implica
que se requiere un tiempo de exposición de 10 ms para alcanzar el umbral de
ablación.
d) Si consideramos que en 10 ms se evapora un disco de agua de espesor de 40
µm, podemos estimar que la razón de remoción de agua es de 0.4 cm/s.
Alternativamente podemos establecer que si un pulso de 100 mJ remueve
4x10-5 cm3 de agua, la remoción de “bulto” es entonces de 4x10-4 cm3/J.
5.1.2 Ablación, regeneración y reestructuración de tejido.
El uso de sistemas láser para modificar el tejido es parte de un campo llamado
“Ingeniería del tejido”, en el que interactúan diversas disciplinas como la química, la
ingeniería y la ciencia de materiales. Los procesos que pueden realizarse con sistemas
láser son:
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•
Reestructuración y conformación de tejido: los sistemas láser se utilizan para
evaporar, dar forma o cambiar la pigmentación del tejido.
•
Fusión o unión de tejidos: los sistemas láser se utilizan para inducir la unión de
los tejidos (“soldadura”) con el fin de reparar desgarramientos o inhibir
crecimiento vascular.
•
Generación de tejido: el láser se utiliza para activar el crecimiento de tejido, o
bien para realizar incisiones que estimulen el crecimiento de nuevos tejidos.
Reestructuración y conformación de tejido.
Las aplicaciones con más desarrollo se encuentran en la dermatología y en la
oftalmología.
Dermatología: El desarrollo de sistemas láser para estas aplicaciones se ha basado en la
teoría de fototermólisis selectiva (Anderson y Parrish, 1983). Fundamentalmente, se han
establecido las condiciones para la destrucción altamente localizada de “blancos”
absorbentes de luz en la piel, causando un daño mínimo al tejido de los alrededores. La
idea básica es elegir la longitud de onda, tiempo de exposición adecuados, así como
también la fluencia de energía suficiente para que los blancos elegidos sean los únicos
que absorban la energía del láser.
Ejemplos de aplicación:
• Malformaciones vasculares (manchas o lunares rojos de gran tamaño). El
cromóforo a atacar es la oxi-hemoglobina. La luz láser la absorbe la hemoglobina y
se convierte en calor; este a su vez daña las paredes vasculares y se presenta un
bloqueo de los vasos sanguíneos.
• Remoción de lesiones pigmentadas y tatuajes. El blanco es la melanina o el
pigmento del tatuaje. La luz láser causa un calentamiento extremadamente rápido de
la melanina o el pigmento, lo que fractura estas partículas matando a las células que
los contienen.
• Resurgimiento de tejido (resurfacing). El cromóforo a atacar es el agua. En el caso
de remoción de arrugas se evapora una capa superficial de la piel (1 µm o 20 µm) por
medio de la absorción de energía en el contenido de agua de la piel.
• Remoción de cabello. Se ataca la melanina folicular. Hasta la fecha, no se han
establecido los procedimientos para garantizar que este proceso es permanente.
Oftalmología: Este campo de aplicación es el que tiene más antecedentes y lleva más o
menos tres décadas de haberse iniciado. Los mecanismos de interacción entre el tejido y
los sistemas láser utilizados son muy variados debido a la estructura del ojo humano.
Los ejemplos de aplicación pueden agruparse en dos categorías:
• Tratamiento de enfermedades retinales o glaucoma. Se utilizan sistemas láser que
operan en el visible o en el cercano infrarrojo. Con estos pueden tratarse retinopatías
diabéticas, oclusiones de venas retinales, degeneración macular, rasgados retinales, y
el glaucoma.
• Cirugía para correcciones refractivas. Se utilizan longitudes de onda invisibles
(UV) para darle la forma correcta a la córnea con el fin de corregir la miopía, la
hipermetropía y el astigmatismo. Fundamentalmente se utilizan dos tipos de
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procedimientos: PRK y LASIK. Recientemente se ha aprobado también el uso de
LTK (keratoplastía térmica) que se basa en el calentamiento de regiones anulares
concéntricas en la córnea para incrementar su curvatura (no hay ablación del tejido de
la córnea).
Fusión de tejidos.
Los tejidos que se han tratado con estas técnicas son hasta la fecha tejidos blandos.
Procedimientos típicos:
a) Fusión directa. Calentamiento local a 60-80 C por absorción de energía láser
para inducir la unión del colágeno.
b) Soldadura láser. Se emplean proteínas que tienen propiedades de soldadura que
se activan por la interacción con luz láser. La longitud de onda se selecciona de
tal forma que las proteínas la absorban para calentarse y sellar el tejido
circundante.
c) Soldadura láser mejorada por tintes. Se añaden tintes que aumentan la
absorción del láser haciendo más eficiente el proceso de soldado.
Los sistemas láser utilizados son el Nd:YAG, CO2, y el uso de tintes ha permitido el uso
de diódos láser operando a 808 nm. Estos procedimientos pueden usarse en conjunto con
endoscopía o lamparoscopía, lo que ofrece ventajas como:
•
•
•
•
•
Posibilidad de realizar microcirugía
Inflamación reducida
Recuperación más rápida que con otro tipo de tratamiento
Sellado impermeable
Facilidad y rapidez de aplicación
Aplicaciones:
• Cirugía cardiovascular
• Cirugía toráxica (sellado de fugas de aire en pulmones después de biopsias)
• Dermatología (sutura de piel con mejor cosmética y sanado más rápido)
• Neurocirugía (reparación y fusión de nervios periféricos)
• Oftalmología (sellado de incisiones en la esclerótica y la córnea)
• Urología (sellado de la uretra y próstata, en ambos casos es importante la
impermeabilidad)
Regeneración de tejidos.
Este tipo de tratamiento se encuentra todavía en etapa de investigación y es un gran
prospecto para la reparación de tejido después de que se ha sufrido alguna lesión. La
investigación en este campo se ha iniciado gracias a reportes que han estudiado los
efectos de la luz para sanar heridas y regenerar tejido. En general, se ha establecido
que con fluencias bajas de radiación visible e IR se puede estimular el crecimiento
capilar y la granulación durante la formación del tejido.
La idea básica de este tratamiento es tratar de deshacer los coágulos en el tejido de
las cicatrices para favorecer la regeneración del tejido nativo. Con ablación láser,
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por ejemplo, los coágulos se minimizan y por lo tanto puede favorecerse la regeneración
de tejidos.
5.2 Corrección de la visión.
5.3 Cirugía con técnicas laser.
5.4 Terapia fotodinámica.
La terapia fotodinámica (PDT) ha emergido como un tratamiento promisorio del cáncer
y otras enfermedades. Este tipo de terapia se basa en el empleo de un agente químico
externo llamado fotosensibilizador (droga PDT) que se activa por luz.
Suministro de medicina PDT:
• Intravenoso
• Tópico
Etapas claves de la PDT:
• Suministro del fotosensibilizador
• Retención selectiva durante tiempos largos de la droga PDT por parte del tejido a
tratar
• Llevar la luz (generalmente láser) a la zona afectada
• Absorción de luz en el fotosensibilizador para generar oxígeno de alta reacción
que destruya células cancerígenas con daño mínimo al tejido vecino
• Eliminación del fotosensibilizador para reducir la sensibilidad a la luz solar
En general, todos los tejidos absorben la droga PDT, sin embargo, sólo el tejido
maligno lo retiene por un tiempo mucho más prolongado. Se debe seleccionar
también la longitud de onda adecuada para la activación de la droga. Dado que la luz que
se utiliza es generalmente luz láser, pueden utilizarse sistemas de fibra óptica para llevar
la luz a las zonas afectadas. En el caso de cáncer de piel, puede utilizarse iluminación
directa. El proceso de generación de oxígeno en las células se conoce como fotooxidación, y es el responsable de destruir las células malignas.
5.4.1 Fotosensibilizadores.
Características:
• Habilidad para acumularse selectivamente en el tejido a tratar.
• Debe ser capaz de dispersarse en el torrente sanguíneo y de penetrar membranas
celulares (puede lograrse químicamente)
• Absorción considerable en la región espectral de máxima transparencia para
tejidos biológicos (de 800 a 1300 nm). Esto permite que la luz penetre más
profundamente en el tejido para activar la droga. Debe considerarse también que
las longitudes de onda mayores a los 900 nm son de energía muy baja como para
lograr la generación de oxígeno en las células.
• Capacidad de ser expulsadas del cuerpo rápidamente después del tratamiento.
Algunos ejemplos de drogas comerciales:
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•
•
•
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Derivados de fotoporfirinas: se utiliza para tratar una variedad de tumores
cancerígenos. Se excita con luz roja (630 nm) aunque esta longitud de onda no
penetra más de 2 mm en el tejido biológico. A pesar de que algunos tumores
gruesos pueden tratarse con la ayuda de fibras ópticas, no puede ser utilizada para
tratamientos de tumores que se extiendan más de 4 mm. Por lo general se
requieren de 4 a 6 semanas posteriores a la aplicación de la inyección para
eliminarla y durante este periodo se debe evitar la luz directa del sol, luces
artificiales muy brillantes o luces muy fuertes.
Fotosensibilizadores catiónicos: la carga positiva permite que sean atraídos por
las mitocondrias celulares, aunque su efectividad para generar oxígeno es baja.
Para esto se añaden otras moléculas que permiten aumentar la eficiencia de
producción de oxígeno. Ejemplo: azul de metileno.
Fotosensiblizadores dendríticos: los dendrímeros son estructuras con
ramificaciones que están ligadas secuencialmente para formar varias capas de
crecimiento.
Estas estructuras proveen sitios múltiples para enlazar
fotosensibilizadores y, en algunos casos, pueden incorporarse varios de ellos en
diferentes ramas.
5.4.2 Aplicaciones.
Potenciales (no han sido aprobados por la FDA):
• Algunos tipos de cáncer pulmonar
• Cáncer de esófago
• Algunos tipos de cáncer de piel
• Cáncer de mama
• Cáncer colo-rectal
• Tumores cerebrales
En la actualidad, para tratamientos de cáncer, el único fotosensibilizador autorizado es la
Fotoporfirina.
Otras enfermedades:
• Cardiovasculares (alternativa a la angioplastía)
• Enfermedades crónicas en la piel (psoriasis)
• Degeneración macular
• Antibacterial
5.4.3 Mecanismos de acción.
Los mecanismos que producen la destrucción de las células cancerígenas no han sido
exactamente determinados. Sin embargo, se reconocen tres mecanismos involucrados en
la acción fotodinámica:
•
Celulares: los fotosensibilizadores atacan directamente a ciertos organelos de las
células tales como las mitocondrias o los plasmas de las membranas. En este
caso, se produce necrosis y las células vecinas destruyen a las células
“pulverizadas” por la acción fotodinámica.
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•
•
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Vasculares: se produce daño vascular provocando la activación de plaquetas y un
incremento en la permeabilidad vascular. La sobreproducción de sangre genera
exceso de oxígeno en las células hasta que estas mueren.
Inmunológicos: estimulan la producción de sustancias que atacan las zonas
inflamadas por los tumores y eventualmente matan el tejido cancerígeno.
5.4.4 Luz para terapia fotodinámica.
Los primeros estudios de esta tipo de terapia utilizaban lámparas de filamentos
incandescentes (tugsteno) y lámparas de arco (xenón o mercurio), ya que no se requiere
una fuente coherente ni con alta potencia pico. Sin embargo, los sistemas láser ofrecen
ventajas tales como:
• Luz monocromática para activar selectiva y eficientemente fotosensibilizadores
específicos.
• Eficiencia de acoplamiento a fibras alta, haciendo posible el uso de
endoscopios para uso intersticial.
Tipos de sistemas láser utilizados: Láser de tinte (Rodamina 6B, 665 nm, CW y
pulsado)
En el futuro:
• Diodos láser (CW y cuasi-CW, 780-850 nm)
• Barras de diodos láser de alta potencia (100 W)
• Sistemas láser de estado sólido en el NIR (cáncer subcutáneo)
• Sintonizables de estado sólido (Ti:zafiro, 690-1100 nm, Alejandrita, 720-800 nm)
• Osciladores paramétricos ópticos
Requerimientos para luz láser
La dosis apropiada de luz para un tratamiento específico depende del tamaño,
localización y tipo de tumor. Para fotoporfirinas excitadas a 630 nm los
requerimientos son:
• Fluencia de 25-500 J/cm2 para tratamientos de superficie, 100-400 J/cm2 para
aplicaciones intersticiales.
• Irradiancia máxima de 200 mW/cm2 para tratamientos superficiales, 400
mW/cm2 para aplicaciones intersticiales
• Potencia de salida de la fuente de 1-2 W
Las nuevas generaciones de fotosensibilizadores tendrán los mismos requerimientos ya
que el objetivo es incrementar la longitud de onda de excitación con el fin de lograr
mayor penetración en el tejido.
5.5 Estudio y diagnóstico de organismos vivos.
Los estudios bioquímicos se encargan de determinar el contenido de diversos tipos de
moléculas en sistemas de todo tipo. Existen varios campos de investigación e industrias
que requieren del análisis rápido y preciso de distintos productos o muestras; algunos
ejemplos son:
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•
•
•
•
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Investigación: Determinación de contenido molecular (concentraciones) en
sustancias de interés.
Diagnóstico clínico y medicina deportiva: Medición del contenido de niveles de
glucosa en sangre y plasmas, así como el contenido de otras sustancias en fluidos
corporales como el cerebro-espinal.
Industria de bebidas y alimentos: Establecer el contenido en cantidades
correctas de elementos alimenticios claves en los productos durante la etapa de
producción (tiempo real).
Bio-procesamiento: Se requiere del control preciso de nutrientes y productos
secundarios para optimizar el crecimiento de células en cultivos y maximizar los
productos finales a obtener.
En general, todo este tipo de estudios se realiza con distintas tecnologías, y las
aplicaciones biológicas y bioquímicas de estas se conocen como BIOTECNOLOGÍA.
La industria de la biotecnología se ha desarrollado rápidamente en los últimos años
gracias a las innovaciones tecnológicas en áreas que tienen aplicación directa en dicha
industria. Tal es el caso de la optoelectrónica, en la que gran parte del gasto de inversión
ha sido destinado a aplicaciones de biotecnología.
Los sensores desarrollados para el estudio de organismos vivos en un sistema
biológico se llaman BIO-SENSORES. Estos detectan la interacción de moléculas
biológicas básicamente en tiempo real, y lo hacen mediante un elemento sensor de
origen biológico que se integra a un transductor que proporciona una señal física
que puede medirse más fácilmente. La señal generada en el transductor es causada por
la interacción entre el elemento sensor biológico (una molécula de bioreconocimiento
inmovilizada) y la molécula bajo análisis (analyte).
Existen diversas técnicas de análisis que se basan en el empleo de dispositivos
optoelectrónicos. En algunos casos, pueden utilizarse dispositivos de uso general para
desarrollar aparatos de uso específico, aunque también se desarrollan dispositivos para
satisfacer necesidades específicas de detección y análisis de diversos tipos. Algunas de
las técnicas relacionadas con optoelectrónica son:
•
•
Fluorescencia: Se basa en la detección de luz
emitida específicamente por moléculas de
interés, ya sea de manera natural, o por medio de
tintes que se introducen al sistema biológico. El
efecto fluorescente se presenta al excitar a las
moléculas (o en su caso al tinte) por medio de
luz láser o, en algunos casos, utilizando fuentes
de luz de otro tipo (e.g., LEDs, lámparas de
mercurio). Por lo general se utilizan técnicas
espectroscópicas para analizar las muestras.
Cromatografía: En general, la cromatografía se encarga de estudiar el
desplazamiento de distintos componentes en una solución. El método utilizado
para determinar el desplazamiento de un componente en particular se basa en el
monitoreo de el índice de refracción o la absorción de luz UV en una columna que
contiene la muestra en estudio. La información se presenta en una gráfica
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llamada cromatograma que grafica los cambios en índice de refracción o
absorción en función del tiempo. Esta información se compara con cálculos
teóricos para determinar las velocidades de desplazamiento de las distintas
especies contenidas en la columna y así poder identificar alguna en particular.
La cromatografía por afinidad se basa en la interacción de un ligando con el
soluto de interés. Existen dos tipo de ligandos: específicos (se liga únicamente a
una especie) y generales (se ligan a grupos específicos contenidos en las especies
de estudio). Ejemplos de ligandos:
o Antígenos, virus o células: se ligan con aticuerpos.
o Proteínas, polimerasas: se ligan con ácidos nucléicos.
o Proteínas portadoras: se ligan con distintos tipos de hormonas.
•
La preparación de las muestras involucra distintas etapas que hacen el proceso
relativamente laborioso. Los componentes de la muestra son transportados por
una fase móvil (líquido o gas) a través de una fase estacionaria. Las especies
individuales retardan su desplazamiento a través de la fase estacionaria por medio
de las interacciones con el ligando. Las interacciones fundamentales son
adsorción en la superficie, solubilidad y carga. Generalmente se utilizan
columnas que contienen todos los componentes. El análisis se basa en medir el
índice de refracción de la columna, o en algunos casos, la absorción de luz
ultravioleta. Se utiliza luz láser o lámparas UV y un detector que se monitorea en
tiempo real para detectar picos de absorción o reflexión.
Resonancia superficial de plasma: (Surface Plasmon Resonance, SPR) Este
fenómeno ocurre cuando un haz de luz se refleja al incidir sobre películas
delgadas de materiales metálicos (generalmente oro). Una fracción de la energía
incidente a un ángulo específico interactúa con los electrones libres de la película
metálica y esto genera una reducción en la intensidad de luz reflejada por el
arreglo óptico. Para poder utilizar este efecto, se requiere la generación de un
campo evanescente entre la película y la interfaz opuesta a la superficie de
incidencia (cara sensora del areglo). Esto implica que las sustancias colocadas en
la porción de sensado debe tener un índice de refracción menor.
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Los aparatos basados en SPR miden la intensidad de luz reflejada por el
arreglo en función del ángulo de incidencia. El ángulo al cual ocurre la reducción
de intensidad reflejada se le conoce como ángulo SPR, y es función del índice de
refracción de la sustancia colocada en la cara sensora del arreglo. El índice de
refracción cambia al ligarse macromoléculas a la superficie y, como resultado, se
produce un cambio en el ángulo SPR en función del número de macromoléculas
ligadas. La relación entre la cantidad de material que se liga y el desplazamiento
en el ángulo es lineal.
Existen aparatos que barren el ángulo de incidencia del haz de luz láser
para determinar el ángulo SPR. Estos miden el desplazamiento del ángulo en
miliradianes como una unidad de respuesta para cuantificar el ligado de las
macromoléculas en la superficie del sensor. La respuesta depende también del
índice de refracción de toda la solución utilizada. Un cambio de 120 miliradianes,
por ejemplo, representa un cambio en el recubrimiento de la superficie por
proteínas de aproximadamente 1 ng/mm2, o equivalentemente, un cambio en el
índice de refracción de aproximadamente 10-3.
SPR parameter
•
Equivalent
value
SPR angle shift
120
millidegrees
Change in
protein surface
concentration
1 ng/mm
Change in bulk
refractive index
0.001
2
La parte clave de este tipo de
sensores es la superficie de ligado.
Aquí es donde la interacción
molecular se lleva a cabo y un
evento de ligado se traduce en una
señal optoelectrónica. Es por esta
razón que la arquitectura a nivel
nanométrico de esta superficie es de
gran importancia. Por lo general se
utilizan
distintos
tipos
de
recubrimientos
que
incorporan
agentes biológicos que ligan ciertas
moléculas de manera preferencial.
Estos pueden incorporarse en capas de material poliméricos o en otros tipos de
materiales.
Otros métodos: Diferentes técnicas espectroscópicas y de fluorescencia.
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5.1 Análisis celular
Las técnicas de análisis celular se basan en análisis de fluorescencia. Estas se combinan
con técnicas de microscopía que permiten identificar las células contenidas en un grupo.
Existen diferentes métodos con diferentes resoluciones para identificación de células.
Independientemente de la técnica utilizada, cualquier tipo de microscopio puede
modificarse de manera simple para que proporcione imágenes más claras y definidas.
Entre las opciones más sencillas se encuentra el manipular la luz que llega al objeto que
se desea observar. Esta manipulación requiere únicamente de filtros espaciales que
permiten definir los colores o los niveles de oscuridad en las distintas alturas del objeto
iluminado.
La microscopía se basa en la absorción de la luz en cada
célula. En algunos casos, la absorción de distintas células es
similar, por lo que basarse en el efecto de absorción de cada
una de las células que conforman un grupo no proporciona
mucha información. En estos casos se debe aprovechar otra
característica que permita establecer diferencias que puedan
distinguirse en las imágenes. Un ejemplo es la microscopía
de contraste de fase, en la que el objetivo incorpora una
región anular que modula la fase de la luz utilizada para
iluminar la muestra. Esta modulación permite aumentar el
contraste en las imágenes. Otra técnica similar aunque más elaborada es la de contraste
diferencial interferométrico, que permite obtener imágenes con aspecto de tercera
dimensión y agregar colores.
La microscopía de fluorescencia se basa en la emisión de luz de tintes o
dispositivos de prueba que se mezclan con la muestra. Se han desarrollado diferentes
materiales que pueden ser ligados no sólo por células específicas, sino también por
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organelos intracelulares para hacer posible su identificación. En la figura se muestra una
célula de una arteria pulmonar de bovino etiquetada con tres tintes fluorescentes
diferentes. Pueden distinguirse claramente el núcleo (azul), los microtubos que forman el
esqueleto celular (verde) y las mitocondrias (rojo).
5.2 Técnicas ópticas no invasivas para biopsia
Los métodos ópticos utilizados para biopsias se basan en la interacción de las células
cancerígenas con la luz. Los efectos que proporcionan información importante son:
•
Luminiscencia (fosforescencia y fluorescencia)
•
•
Efecto de Raman
Dispersión (Rayleigh, Mie)
********
Técnicas para obtención y análisis de imágenes.
Las técnicas ópticas para adquirir imágenes pueden ser utilizadas para estudiar un
amplio rango de especimenes biológicos en un rango que cubre varias escalas de
tamaño. En general, las técnicas ópticas utilizadas para adquirir imágenes biológicas
utilizan contrastes generados por diferencias entre la luz transmitida, reflejada y la
fluorescencia de la región que quiere estudiarse y la zona aledaña.
5.5.1
Técnicas de microscopia.
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Los métodos utilizados en la microscopia óptica se basan en el monitoreo de las
propiedades ópticas de las muestras a analizar. Una clasificación general de estos
métodos puede hacer de la siguiente manera:
• Transmisión (transiluminación): se basa en la variación espacial de la absorción
y dispersión de luz generada por las estructuras microscópicas y macroscópicas
del tejido. Durante su propagación en el tejido, la luz se descompone en:
o Luz sin dispersar (dispersa coherentemente): se propaga en la dirección del
haz incidente y por lo tanto siguen la trayectoria más corta para salir del
tejido. Estos fotones contienen la máxima información sobre la estructura
interna del tejido.
o Dispersa débilmente: siguen trayectorias oscilantes y también se copropagan con el haz de luz incidente. Estos fotones tienen un retraso
temporal con respecto a los que componen la luz sin dispersar, y también
contienen información sobre el tejido como medio dispersor.
o Dispersa en forma múltiple: compuesta por los fotones que viajan
distancias muy largas debido a dispersión con las diferentes que componen
el tejido. Esta luz es la que no trae ninguna información útil sobre el tejido
y por lo tanto debe discriminarse.
Para eliminar la luz dispersa en forma múltiple pueden utilizarse las siguientes
técnicas:
o Filtrado espacial (micoscopía confocal): método más simple, se utiliza un
filtro que elimina la luz que se propaga fuera del eje óptico del microscopio
(una fibra, un pinhole).
o Filtrado por polarización: la luz difusa pierde su polarización inicial y se
elimina con filtros de polarización.
o Filtrado por tiempo: utiliza un láser pulsado y una compuerta óptica
sincronizada con el láser (e.g., efectos no-lineales).
o Métodos en el dominio de la frecuencia: se modula en intensidad el láser y
se mide el cambio de fase de la señal transmitida utilizando métodos como
la mezcla heterodina.
•
Reflexión (retro-dispersión): esta se basa en la recolección de la luz retro-dispersa
por la muestra. Al igual que en el caso anterior, la luz que contiene la información
importante es la que contiene la luz que se dispersa de manera coherente. La
discriminación se logra mediante dos técnicas:
o Microscopía confocal (filtrado espacial): misma idea que para microscopía
de transmisión.
o Microscopía interferométrica: esta técnica ha llevado al establecimiento de
la tomografía por coherencia óptica (OCT). Con esta, es posible obtener
imágenes de tejido con alto coeficiente de dispersión.
•
Fluorescencia: es la técnica más utilizada para la obtención de imágenes biológicas
ya que proporciona el sondeo más detallado de la estructura y la dinámica de
especimenes biológicos tanto in vitro como in vivo.
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Tarea:
• Explicar cómo están constituidos un microscopio simple y un microscopio
compuesto.
• ¿En qué consiste el método de iluminación de Kohler?
• ¿Qué representan la resolución y la abertura numérica en un microscopio?
• Investigar las siguientes técnicas de microscopía:
o Contraste de fase (Phase contrast microscopy)
o Campo obscuro (dark-field microscopy)
o Fluorescencia (fluorescence microscopy)
o Tomografía por coherencia óptica (optical coherence tomography)
o Campo cercano (near-field optical microscopy)
o Reflexión total interna de fluorescencia (Total internal reflection
fluorescence microscopy)
Fuentes de información:
o http://micro.magnet.fsu.edu
o http://www.microscopyu.com
o http://www.olympusmicro.com
Microscopio simple.
Este es básicamente una lente que magnifica la imagen. El principio de funcionamiento
se basa en la formación de la imagen por medio de una lente. Si un objeto se coloca a
una distancia u de una lente, se forma una imagen real de este a una distancia v al otro
extremo de la lente. Esta imagen es la versión magnificada por un factor v/u. En un
microscopio, el objeto se coloca en el plano focal para formar la imagen magnificada y
ser observada por el ojo o grabada en una cámara. Para obtener una imagen bien
definida el objeto debe colocarse dentro de una distancia cercana al plano focal
conocida como profundidad de foco.
Microscopio compuesto.
Utiliza una combinación de lentes para mejorar significativamente la magnificación de
las imágenes. La imagen magnificada por el objetivo se vuelve a magnificar con otro
sistema de lentes (el ocular). La magnificación final está dada entonces por el producto
de las magnificaciones de ambas etapas. La resolución del microscopio depende no sólo
de los objetivos sino también de la iluminación. El método más utilizado de
iluminación es el método de Kohler.
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5.5.2 Técnicas en el dominio del tiempo y espectrales.
Las técnicas anteriores permiten obtener imágenes de alta resolución a niveles subcelulares. Sin embargo, el sondeo de funciones biológicas requiere de la combinación
de todas las técnicas anteriores con técnicas en el dominio del tiempo y en el dominio
de la frecuencia. Esto permite estudiar la dinámica de las funciones biológicas. Estas
técnicas se usan principalmente en conjunto con la detección de fluorescencia.
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