Unidad N° 2: Cromatografías especiales

UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA
KM 4, 9000, COMODORO RIVADAVIA
PATAGONIA SAN JUAN BOSCO
CHUBUT, ARGENTINA
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES
TEL/FAX: (++54-297)4550339
CARRERA DE FARMACIA
CATEDRA DE FARMACOGNOSIA
E-mail: fargnosi@unpata.edu.ar
www.fcn.unp.edu.ar/sitio/farmacognosia/
COMPLEMENTO TEORICO. CROMATOGRAFIAS ESPECIALES
CROMATOGRAFIA PLANAR CENTRIFUGA
Utiliza un flujo de Fase Móvil (FM) acelerado por la acción de la fuerza centrífuga.
En el transcurso del tiempo, se han ido perfeccionando los equipos en cuanto a la
practicidad de su utilización y a los resultados que permiten obtener.
1- Cromatografía centrífuga en papel. En 1955 consistía en un rotor con dos platos
conteniendo en el medio una lámina de papel para cromatografía circular. Utilizaba
rotores horizontales, por lo que la colección de las muestras eluidas era difícil.
2- Cromatofuga. Consistía en una especie de columna horizontal cilíndrica rellena de
material adsorbente (óxido de aluminio, BaCO3). La colección de las fracciones eluidas
era dificultosa, causando remezclas. Se utilizó para separar sustancias tales como
xantinas, amino ácidos, hasta en cantidades de gramos.
3- Cromatografía en capa fina o delgada centrífuga. Surgieron dos equipos
comerciales, siendo el segundo el de mayor aplicación:
3.1- Hitachi CLC-Centrifugal Chromatography, de origen japonés. En este caso, el
adsorbente se mezcla con el eluyente y se introduce en un espacio ubicado entre 2
láminas horizontales de 30 cm de diámetro. El exceso de eluyente se remueve por
acción de la fuerza centrífuga y a continuación se introduce la muestra en la parte
central. La FM se deja gotear en el lugar de siembra generando una separación de las
sustancias en bandas concéntricas acelerada por la acción de la fuerza centrífuga merced
a un rotor. El espesor de la capa fina puede ser variado, permitiendo trabajar a pequeñas
y grandes escalas. La disposición del rotor hace dificultosa la colección de las
fracciones separadas.
3.2- Chromatotron, de origen estadounidense. Se utiliza principalmente para realizar
cromatografía de tipo preparativa, radial, de capa fina (TLC), en donde la FM es
obligada a eluir con una aceleración dada por la fuerza centrífuga aplicada
(generalmente de 800 r.p.m.), alcanzando un flujo de 1-10 ml/min. Las dimensiones
generales del equipo son 30 x 35 x 30 cm. La diferencia con los anteriores es que el
rotor se halla inclinado, lo cual favorece la colección de los eluidos.
Principios de la operación: la muestra se aplica en solución, en el centro del disco o
plato circular de vidrio que posee la FE sorbida en forma de capa fina. La elución se
realiza mediante el solvente que se aplica en el centro, definiendo bandas circulares
correspondientes a los componentes que se van separando a medida que el sistema gira
mediante el rotor inclinado. Las pérdidas de eluido por los bordes se evitan por un
cuello de cinta gruesa engomada que rodea la circunferencia del plato.
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El rotor está guardado en una cámara, cubierto por un plato de cuarzo o de otro material
que permite la observación del desarrollo al UV, dejando entrever las zonas de
separación de las sustancias. A través de la cámara pasa un flujo constante de N 2 para
prevenir la condensación del eluente y la oxidación de la muestra.
Capacidad: en general se pueden separar de 50 hasta 500 mg de muestra, utilizando
una capa fina de 2 mm de espesor. Posee menor resolución que un HPLC, pero a
diferencia de una TLC planar, en este tipo de cromatografía el producto es eluido y por
lo tanto se evita el tener que raspar la capa fina para obtener las sustancias separadas.
FE: sílica gel, alúmina o sílica gel – nitrato de plata. No se utiliza en general para FR.
FM (solventes): es compatible con todos los solventes usados habitualmente en
cromatografía, incluyendo ácido acético. No se deben usar ácidos minerales.
Ventajas:
- Permite variar la FM y el gradiente de elusión. La atmósfera de N 2 previene
oxidaciones de los compuestos.
- Separaciones rápidas, aproximadamente en 20 - 30 min.
- Permite observar las zonas de separación durante el desarrollo con una lámpara UV o
al visible.
- Las sustancias separadas eluyen fácilmente debido a la inclinación del rotor.
- Puede utilizarse un espesor de capa fina de 1, 2, 4 o 8 mm, aumentando la capacidad
del sistema. Además el adsorbente puede regenerarse in situ para su reutilización.
- Utiliza un equipo compacto, de fácil transporte y de menor precio que un HPLC.
Ejemplo: la separación de estricnina y brucina (250 mg) sobre una capa fina de sílica
gel de 2 mm de espesor, se observa con muy buena resolución mediante las bandas
concéntricas más abajo indicadas. El revelado se realiza con lámpara UV.
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CROMATOGRAFIA LIQUIDA EN COLUMNAS
1- Convencional de laboratorio a presión hidrostática (presión normal). Las
partículas de la FE poseen en general un diámetro de 60 – 200 µm. El uso principal es
como cromatografía preparativa y la mayor desventaja es el tiempo que demanda el
desarrollo.
- Soporte: cilindro de vidrio o metal o plástico, en todos los casos es un soporte inactivo
o inerte. La relación óptima de longitud – d.i. es de 8:1.
- FE: sólida, constituida por un adsorbente polar (sílicagel, alúmina, ambos como tal en
el caso de las cromatografías comunes o con la polaridad aún más aumentada por ej. por
grupos nitrilos o aminos, para FN) o de menor polaridad (C18, C8, para cromatografías
en FR); también pueden ser resinas de intercambio aniónico o catiónico, geles para
cromatografía por filtración, material para cromatografía de afinidad o partículas de
celulosa microcristalina para partición.
- FM: líquida, la cual se puede variar ampliamente durante el desarrollo, siempre en
forma gradual. En el caso de las cromatografías comunes y de aquellas en FN, la FM se
debe variar de menor a mayor polaridad; en el caso de FR, se varía de mayor a menor
polaridad.
- Proceso: dependerá de la FE, pudiendo ser de adsorción, intercambio iónico, filtración,
afinidad, partición.
- Empacado: puede ser en seco (ya sea directamente en la columna vacía o en la
columna llenada previamente con la primera FM a usar), o FE en suspensión (en la
primera FM a usar).
- Siembra: muestra disuelta o suspendida en un solvente + el doble de peso del
adsorbente, formando una pastilla que al evaporarse el solvente, contendrá el polvo de
adsorbente con la muestra sobre su superficie.
- Desarrollo: en general descendente.
- Detección: las sustancias separadas se obtienen a la salida de la columna, de tal forma
que la detección se realizará sobre las fracciones eluidas. Puede realizarse por métodos
físicos (luz natural o UV), o químicos, o sembrando las distintas fracciones en un
sistema de TLC y revelando allí.
- Factores que afectan la separación: grado de activación del adsorbente para el caso de
adsorción; granulometría de la FE o viscosidad del gel cuando corresponda,
homogeneidad del empacado, inercia química de la FE y de la FM. La velocidad de
elusión ideal es de 2 ml / min; la relación entre largo y d.i. de la columna de 8:1; la
temperatura deberá ser constante y homogénea en toda la columna durante todo el
proceso ya que afecta la volatilidad y solubilidad de las sustancias. La humedad y
presión son las normales del ambiente.
2- Instrumental: HPLC, CG, FSC.
Ver el material correspondiente entregado como Complemento Teórico y lo que se
desarrolle en los grupos de metabolitos de mayor aplicación en cada caso.
3- Cromatografía en Columnas especiales.
Dado los largos tiempos de desarrollo de las cromatografías líquidas en columnas
convencionales y por otro lado, los costos elevados del equipamiento requerido para las
instrumentales, se buscaron otros sistemas que no siendo tan costosos, ofrecieran alguna
ventaja sobre las columnas convencionales. Surgieron así las llamadas COLUMNAS
ESPECIALES.
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3.1- CROMATOGRAFIA EN COLUMNA SECA.
Es semejante a una TLC, sólo que se realiza en columnas en general de material plástico
o nylon, que permiten ser cortadas en las bandas en que se separan las sustancias.
Se empacan en seco. La muestra se siembra también en seco, recubierta o mezclada con
el adsorbente en una proporción de muestra / adsorbente de 1:100. En algunos casos se
siembra la muestra apenas humectada con la FM. A continuación se deja que la FM
avance por capilaridad o simple humectación hasta que llega al final de la columna. Las
sustancias se separarán en bandas y luego se procederá a cortar las partes de la columna
que contengan cada banda. Permite mejor resolución y reproducibilidad.
- Soporte: inactivo. Columna plástica o de nylon, tubo fácil de cortar o extruir y que
puede verse al UV. En general de longitud importante y de d.i. pequeño (10:1; 25:1).
- Principio: una TLC ofrece mayor resolución que la columna para una misma FE y FM
y menor tiempo de desarrollo; pero la columna permite variar la FM. Por ello esta
columna especial combina las ventajas características de una TLC con las de una
columna.
- FE: en general adsorbente sílicagel 60 F254 (70 - 230 µm) con 40 % de humedad
(grado de actividad III). Se empaca en seco. La relación adsorbente – muestra varía de
40:1 hasta 300:1.
- FM: el solvente en cada plato teórico que se genera, va encontrando material seco. La
muestra se incorpora en la solución o suspensión de FM (o seca en algunos casos) y se
eluye por humectación con la FM que avanza hasta llegar al final de la columna.
- Muestra: seca o recubierta o mezclada con el adsorbente o bien apenas humectada con
la FM; hasta 500 mg en general.
- Proceso: temperatura y humedad ambiente. Presión en general normal, pero puede
combinarse con vacío para acelerar el proceso. En general, el tiempo de desarrollo es de
30 min.
- Revelado: pueden observarse las bandas correspondientes a las sustancias que se van
separando, mediante luz natural o con luz UV. Ello permite cortar las zonas separadas y
luego fluir de la FE con solventes apropiados.
3.2- CROMATOGRAFIA EN COLUMNA BAJO VACIO.
Básicamente se aplica una succión a la base de la columna para forzar el flujo de la FM
a través de una columna empacada con FE para TLC. Si se pretendiera utilizar FE para
TLC en columna, el proceso sería extremadamente lento, pero optimizaría la separación,
por ello una estrategia es utilizar esta FE forzando el flujo de FM merced a la aplicación
de vacío. En general las columnas son de poca longitud, pero de mayor diámetro
(columnas cortas, pero anchas).
- Soporte: inactivo. Columna de vidrio, semejante a un embudo separador, en general de
longitud baja y de d.i. grande (5:1).
- Principio: se utiliza vacío (aproximadamente de 25 mm de Hg) para acelerar el flujo
de la FM, por lo que el tiempo de desarrollo se limita a 2 – 3 h como máximo.
- FE: en general adsorbente grado TLC (10 - 40 µm), por lo que bajo vacío logra la
máxima densidad. Se empaca en seco, luego se aplica solvente de mediana o baja
polaridad, se aspira a seco con vacío y estará lista para sembrar la muestra e iniciar el
proceso cromatográfico. La relación adsorbente – muestra está alrededor de 50:1 o
menos.
- FM: el solvente debe ser de punto de ebullición medio y poco viscoso para evitar
pérdidas por evaporaciones ligeras o un entorpecimiento del proceso por la viscosidad.
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- Muestra: seca o recubierta o mezclada con el adsorbente o disuelta o suspendida en un
pequeño volumen de la FM.
- Proceso: temperatura y humedad ambiente. Presión de aproximadamente 25 mm de
Hg, es decir reducida a condiciones de vacío. En general, el tiempo de desarrollo es de
2 - 3 h.
- Revelado: como en las columnas convencionales.
3.3- CROMATOGRAFIA EN COLUMNA CON PRESION.
Según la presión por encima de la normal que se emplee, se clasifica en:
3.3.1.
FLASH CROMATOGRAFIA
3.3.2. CROMATOGRAFIA DE PRESION BAJA (LOW
CHROMATOGRAPHY)
3.3.3. CROMATOGRAFIA DE PRESION MEDIA (MEDIUM
CHROMATOGRAPHY)
3.3.4. CROMATOGRAFIA DE ALTA PRESION (HIGH
CHROMATOGRAPHY)
PRESSURE
PRESSURE
PRESSURE
La tabla siguiente destaca los principales parámetros que definen cada una de ellas, en
comparación con la columna convencional o común de laboratorio (open column).
En todos los casos se logra optimizar el proceso aumentando el flujo merced a un
aumento de la presión aplicada. Ello permite trabajar con menor cantidad de muestra,
con partículas de tamaño muy pequeño (lo cual genera un consecuente aumento de la
resolución), con columnas pequeñas y un flujo mayor, lo que a presión normal no sería
posible.
En flash cromatografía se aplica presión a partir de un cilindro de N 2 o de aire de
calidad para cromatografía. Las columnas son de vidrio, con longitudes en general que
varían entre los 7 y los 15 cm y d.i. entre 3 y 7 cm.
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