RAPIDPCR INTRODUCCIÓN, BASE Y CARACTERÍSTICAS rapidPCR Introducción Definición de rapidPCR Amplificación de DNA mediante una PCR realizada de mánera rápida, mediante ciclos de incremento y disminución de la temperatura muy rápidos. 30 ciclos de amplificación en < 30min [Witwer et al., 1994] PCR estándar rapidPCR 1-2 °C/seg >8 °C/seg 3-5 min./ciclo 20 seg/ciclo 2-3 h/PCR < 30min/PCR rapidPCR Características ▪ Reducción de errores en la hibridación de los primers (cebadores) ▪ Resultados de alta calidad y mayor especificidad de los productos amplificados ▪ Mejor recuperación de la muestra incluso en volúmenes muy pequeños (2 µl) debido a la presión automatizada de la tapa sobre la placa / tubos ▪ Hasta diez veces más rápido debido al control de temperatura de alta velocidad ▪ Velocidad de calentamiento de hasta 15°C/seg y velocidad de enfriamiento de hasta 10°C/seg ▪ Alta transferencia de energía ▪ Sistema de Protección de la muestra (SPS) ▪ Incrementos / decrementos de tiempo y temperatura rapidPCR Objetivos del rapidPCR Mayor precisión en los ciclos – temperatura medida en el interior de la muestra Perfil de Temperatura de la muestra ------Competencia (E) ------SpeedCycler Tempertaura [°C] 95 °C – 3 seg 56 °C – 3 seg 72 °C – 12 seg Tiempo [seg] Rampa de temperatura (E) vs. picos definidos (AJ) En el mismo lapso de tiempo: 1 ciclo (E) vs. 3 ciclos (AJ) ¿Cómo se alcanzan esos objetivos? rapidPCR Características técnicas Bloques para placas de muestras Efecto Peltier (termoeléctrico) Consumibles especiales para PCR con Reducción de la masa térmica Fundamental para rápidas variaciones de Tª Mejora la transferencia de calor paredes ultrafinas Primer termociclador para rapidPCR basado en el efecto peltier ▪ Ventajas de la tecnología peltier ▪ Empleo de equipamiento estándar ▪ Protocolos rápidos de PCR para ganar tiempo rapidPCR Material Fungible La velocidad lograda mediante esta PCR se debe a la combinación del termociclador y el material fungible empleado + Placas y tubos de plástico ultrafino Bloques LPR/LP – Bloques Rápidos Low Profile Rapid Blocks Empleo únicamente con plásticos ultrafinos rapidPCR Low Profile Rapid (LPR) blocks Bloque ultrafino 96 pocillos Microplaca ultrafina 96 pocillos Tiras ultrafinas de 8 pocillos ▪ 5 mm altura = Ultrafino (Low Profile) con reducción muy significativa de masa térmica ▪ Recubrimiento de oro, bloque de muestras de plata de ley (aumenta la conductividad) ▪ De alta potencia, elementos peltier de alta durabilidad ▪ Technología SAC (* se verá luego) ▪ LPR: únicamente acepta consumibles de AJ (los pocillos son más pequeños) rapidPCR Low Profile Rapid (LPR) blocks Patentado – Microplacas de pared ultrafina Propiedades ▪ Paredes ultrafinas ▪ Alta transferencia de energía delbido a la tecnologia SAC (*) ▪ Optimizados para un bajo consume de muestra Ventajas de emplear polipropileno en PCR ▪ Inerte químicamente ▪ No hay uniones inespecíficas a las paredes del recipiente rapidPCR Low Profile Rapid (LPR) blocks Tecnología SAC - Self Adapting Container La tapa térmica ejerce una alta presión en la muestra Pocillo con muestra (5-20 µl) Bloque LPR 11 rapidPCR Low Profile Rapid (LPR) blocks Tecnología SAC - Self Adapting Container (Contenedor adaptable) 1. Durante el ciclo térmico la presión en el tubo aumenta 2. Las paredes elásticas ultrafinas se deforman durante el proceso 3. El tubo encaja con precisión en el pocillo del bloque >90% de transferencia de energía Mayor flexibilidad: Bloques SPR – Standard Profile Rapid Blocks Han de ser usados con plástico fino rapidPCR Standard Profile Rapid (SPR) blocks Bloque de perfil estándar Rápido de 96 pocillos 200 µl tubos finos, tiras o microplacas ▪ Diseñado para adaptarse a los plásticos estándares ▪ Importante: emplear tubos de pared fina ▪ Adicional: precalentar los consumibles antes de correr la PCR ▪ Altura reducida del bloque para reducir la masa térmica ▪ Bloque robusto: recubrimiento de oro y plata (incremento conductividad) ▪ De alta potencia, elementos peltier de alta durabilidad ▪ Technología SAC ▪ SP/SPR: plásticos AJ y competencia (finos) ▪ COMPETENCIA: BioRad rapidPCR Standard Profile (SP) blocks Plásticos finos para incrementar la transferencia de calor Placa de aluminio: más barata Propiedades de los plásticos estándares finos ▪ Transferencia de energía alta ▪ Optimizado para un consumo de muestras estándar Ventajas de emplear polipropileno en PCR ▪ Inerte químicamente ▪ No hay uniones inespecíficas a las paredes del recipiente rapidPCR Standard Profile/ Rapid (SP/R) blocks Tecnología SAC - Software Adaption Controlling ▪ ▪ Compensa el espesor del plástico con una mayor aplicación de energía PERO a mayor grosor, mayor duración Application of energy Transferencia de energía Cooling Heating 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 Simulated tube control (factor 1-10) 5 6 7 8 9 10 rapidPCR Aplicaciones Consumo de muestras ▪ Bloques LPR / LP (Low Profile Rapid or Low Profile): Bloques de 96 pocillos Volumen de muestra desde 2 µl Max. volume de muestra hasta 20 µl ▪ Bloques SPR / SP (Standard Profile Rapid or Standard Profile) Bloques de 96 pocillos Posibilidad de emplear de 10 – 60 µl Aplicacicones para rapidPCR rapidPCR Aplicaciones Características ▪ Empleo normal de polimerasas ▪ Modificaciones en la concentración de Magnesio ▪ No require función de gradient ▪ Protocolos adaptables Ventajas Notas importantes: ▪ No require químicas especiales ▪ ▪ Ahorra tiempo Generalmente puede emplearse la mayoría de polimerasas ▪ Reduce el consumo de muestra ▪ Fácil adaptación de protocolos estándares ▪ Mayor rango de amplificación ▪ ▪ Mayor especificidad Como en cualquier PCR, los resultados dependen de la calidad y pureza de la muestra rapidPCR Características Propiedades de la Taq Polimerasa Elongación: 1000 bp/min = 16.7 bp/seg Taq polimerasa sintetiza en: 100 bp/sec 85% del tiempo desperdiciado http://www.bio.miami.edu/~cmallery/150/gene/taq.polymerase.jpg Influencia del Magnesio ▪ ▪ ▪ ▪ Cofactor para la Taq DNA Polimerasa Forma complejos solubles con los dNTPs (nucleosi trifosfatos) Estabilizan el complejo cebador-molde Promueve la cinética de la primera unión del cebador rapidPCR: Debido a la rapidez de los cambios de temperatura, se promueve la unión específica del cebador La alta concetración de Mg2+ estabiliza el complejo rapidPCR No require función de gradiente Temperature Curve Standard Cycler Termociclador estándar 100 100 Block 55 95 95 Sample 55 Retraso de la muestra en alcanzar la temperatura fijada en el bloque (superior a 20seg (con tubos finos) ▪ Diferencia de temperatura entre los parámetros fijados para el bloque y la temperatura real de la muestra ▪ El gradiente ayuda a encontrar la mejor temperatura de anillamiento Block 53 90 90 Sample 53 Block 57 85 85 Sample 57 80 80 ∆T = 6.2 °C 5 sec 75 75 T (°C) T (°C) ▪ ∆T = 3.0 °C 10 sec 70 70 ∆T = 1.5 °C 15 sec 65 65 60 60 55 55 50 50 45 45 20 20 40 40 60 60 80 80 t (sec) t(s) 100 100 120 120 ∆T = Diferencia de temperatura entre los parámetros fijados para el bloque y la temperatura real de la muestra rapidPCR No require función de gradiente Termociclador para PCR rápida: no require gradiente ▪ La temperatura de la muestra es igual que la del bloque prácticamente en todo momento Por ello hay una mejor temperatura de anillamiento Ventajas ▪ Mayor uniformidad en la temperatura del bloque y fácil adaptación/diseño de los protocolos AJ Block AJ in sample 85 ∆T = 0.5 °C 5 sec T (°C) ▪ 95 75 ∆T = 0.3 °C 10 sec ∆T = 0.15 °C 15 sec 65 55 45 10 20 30 40 50 60 70 t (seg) ∆T = Diferencia de temperatura entre los parámetros fijados para el bloque y la temperatura real de la muestra rapidPCR Ventajas No requiere química especial PCR estandar rapidPCR Primer 1 Primer 2 dNTPs MgCl2 Taq polimerasa Tampón de reacción 0.1 – 1 µM 0.1 – 1 µM 200 µM 1.5 – 2.5 mM 0.2 – 1 U 1x 0.1 – 1 µM 0.1 – 1 µM 200 µM 2.5 – 7 mM 0.2 – 1 U 1x Muestra DNA (molde) 0.1 – 150 ng H2Od añadir para alcanzar añadir para alcanzar el volumen final el volumen final 0.1 – 150 ng Nota: En caso de moldes complejos, puede incrementarse el volumen de muestra (concentración del DNA) mediante la reducción del volumen de agua rapidPCR Ejemplos de aplicaciones Tiempo empleado ▪ Emplea menos tiempo que los sistemas estándares ▪ Reducción del tiempo de los experimentos de 2-3h a 15 - 30 min ▪ La rapidez de calentamiento y enfriamiento de las muestras, asi como el incremento de transferencia de energía debido a la tecnología SAC, reduce el tiempo empleado en 4-10 veces rapidPCR Ejemplos de aplicaciones 24 kb PCR Muestra: gDNA humano 30 ciclos 4:59 h Lambda/HindIII AJ SpeedC. 30 ciclos 8:22 h Compet( E) El Speed Cycler de AJ ahorra 3:23 h, es decir tarda un 40% menos en amplificar que el equipo de la competencia AJ SpeedC. Compet Time Saving 600 500 203 Ahorro 400 300 502 200 299 100 0 min Clientes potenciales: aquellos que realizan PCR muy largas Ej. secuenciación(+/-8h), clonaje de vectores, etc. rapidPCR Ejemplos de aplicaciones Productos de PCR de mayor calidad ▪ Incremento de la especificidad del cebador Al variar rápidamente la Tª, reduce el riesgo de ligarse a secuencias inespecíficas ▪ Reducción significativa de productos inespecíficos ▪ Temperatura seleccionada = temperature real de la muestra rapidPCR Ejemplos de aplicaciones rapidPCR del gen B-actina de gDNA humano (295 bp) 1x 25x 1x 30 seg 0 seg 0 seg 30 seg 96°C 95°C 60°C 72°C rapidPCR del gen B-globina de gDNA humano(536 bp) 1x 28x 1x 30 seg 0 seg 0 seg 30 seg 96°C 95°C 56°C 72°C ▪ Excelente uniformidad del bloque incluso con protocolos muy cortos (8 – 9 min) ▪ Alta calidad, rendimiento y especificidad de los productos amplificados * Empleo de la DNA polimerasa innuTaq HOT A de Analytik Jena rapidPCR Resumen ▪ ▪ Ultra-rápido Mayor calidad, rendimiento y especificidad ▪ Hasta 10 veces más rápidotimes faster ▪ Velocidad de calentamiento: hasta 15 °C/s y de enfriamiento hasta 10 °C/s ▪ Mejor transferencia de energía (>90%) Menos uniones inespecíficas del cebador SPS – Sistema de protección de muestras ▪ Flexibilidad ▪ Placas LP (Low Profile) o consumibles estándares de pared fina ▪ Fácil ▪ Cambios en los iones de Mg2+ ▪ Amplio rango de aplicaciones ▪ Todas las aplicaciones estándares son posibles: PCR Multiplex, Colony PCR (de colonias bacterianas), secuenciación… ▪ rapidPCR ▪ Variedad de dispositivos y manejo flexible SpeedCycler² Termociclador para rapidPCR Life science unlimited SpeedCycler² Características Interfaz externo HID-Pro 320 Pantalla táctil de 5.7” Software Windows CE-based Idiomas: Inglés y Alemán LAN y puerto USB Es el termociclador más rápido del mercado Tapa térmica automática con presión por contacto SpeedCycler² Bloques térmicos 96 LPR (96 x 20 µl) Aumento Tª: 15°C/sec Disminución Tª: 10 °C/sec 96 LP (96 x 20 µl) Aumento Tª: 15°C/sec Disminución Tª: 10 °C/sec 96 SPR (96 x 0.2 ml) Aumento Tª: 8°C/sec Disminución Tª: 6 °C/sec 96 SP (96 x 0.2 ml) Aumento Tª: 5.5°C/sec Disminución Tª: 4 °C/sec LPR LP SPR SP – – – – Low Profile Rapid (alta conductividad) Low Profile (aluminio) Standard Profile Rapid (alta conductividad) Standard Profile (aluminio) SpeedCycler² Pantalla HID-Pro 320 HID-Pro 320 – Human Interface Device Interfaz externo HID-Pro 320 Pantalla táctil de 5.7” (no require teclado ni ratón) Windows CE-based Barra de herramientas: función rápida para realizar el SetUp de muestras LAN y puerto USB para mejor conectividad HID-Pro 320: aplicable a otros instrumentos de Analytik Jena (ej. ScanDrop® or InnuPure® C16) SpeedCycler² Pantalla HID-Pro 320 Programa de fácil uso (intuitivo) Indicación del tiempo, asi como del aumento y disminución de la temperatura Visualización gráfica del programa de PCR SpeedCycler² Software rPCRsoft Programación de los protocolos de de la PCR Ajuste de las tapas individualmente Gestión de proyectos / usuarios Simulaciones de PCR Visualización gráfica del programa de PCR Funciones de incremento y decremento de temperatura SpeedCycler² Resumen SpeedCycler² Resumen Características SpeedCycler² SpeedCycler² Bloque Low Profile Rapid (LPR) rapidPCR Material Plata con recubrimiento Au Control Autónomo o HID-Pro 320 Aumento Tª 15 °C/sec Software Windows CE (HID-PRO 320) o rPCRsoft con ordenador Disminución Tª 10 °C/sec Visualización Visualización gráfica del programa de PCR Bloque Low Profile (LP) Material Aluminio Pantalla táctil Aumento Tª 15 °C/sec Fallo de la red eléctrica Disminución Tª 10 °C/sec Gestión de usuarios Inicio rápido Tapa Bloque Standard Profile Rapid (SPR) Presión por contacto automático Hasta 120 °C Material Plata con recubrimiento Au Aumento Tª 8 °C/sec Disminución Tª 6 °C/sec Bloque Standard Profile (SP) Bloques LPR Material Bloques SPR Aumento Tª Bloques SP Disminución Tª Bloques LP Aluminio 5.5 °C/sec 4 °C/sec