Recombinación Homóloga

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Recombinación genética
Intercambio de material genético entre cromosomas homólogos,
permite que no quede fijado el contenido de alelos de cada
cromosoma
Variabilidad: Base de la evolución
“shuffling genetico”: la recombinación permite separar
mutaciones favorables de no favorablesÆ selección natural
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Recombinación homóloga (o generalizada)
•2 secuencias de DNA iguales o similares
(homólogas)
•Ruptura de las dos moléculas de
DNA
•Intercambio de fragmentos de DNA
en cualquier punto de las moléculas
homólogas de DNA.
•No hay cambio en la organización
general del DNA
2
Recombinación sitio específica (o especializada)
•Entre secuencias específicas
•Requiere proteínas específicas que reconocen
secuencias específicas y promueven recombinación
•Induce cambios en la organización del DNA
3
Recombinación Homóloga
• Ruptura de la doble hélice en 2 moléculas de DNA homólogas y
unión cruzada
• Sitio de intercambio Æ secuencias homólogas
• Heteroduplex en sitio de intercambio
• No hay alteración de la secuencia en el sitio de intercambio
4
Modelo de Holliday
•Formación del heteroduplex
•Migración de ramas (Branch
migration)
•Resolución: clivaje a través del
punto de ramificación
5
Modelos de inicio
de la
recombinación:
•Modelo de Holliday
•Modelo de MesselsonRadding
6
Modelos de inicio de la recombinación:
•Modelo de DSB
7
Conversión Génica
• No todos los eventos de recombinación llevan a la formación
de estructuras de “crossover”
• Sin embargo, eventos de “non-crossover” (patch-like) pueden
tener consecuencias genéticas Æ Conversión génica
• En la conversión génica, un alelo se pierde y es remplazado
por el alelo alternativo.
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Funciones de la Recombinación homóloga en E.coli
– Reparación
• DSB
• Bloqueo de replicación
– Recombinación
• Conjugación
• Transducción
• Transformación
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Generación de DSB en el DNA
10
Reparación de rupturas
de doble cadena en E.coli
11
Recombinación homóloga en E.coli
ƒ Al menos 25 tipos distintos de proteínas involucradas en
recombinación homóloga en E.coli
ƒ RecA, RecBCD, RecF, RecG, RecJ, RecN, RecO, RecQ, RecR,
RuvAB, RuvC, PriA, SSB, DNA polimerasas, DNA topoisomerasas y
DNA ligasas.
ƒ Secuencia en cis χ (hotspot de recombinación)
ƒ GCTGGTGG
ƒ Genoma de E.coli 1009 sitios χ (1/6kb)
12
Sistema RecBCD (E.coli)
Esencial para el 99% de eventos de recombinación en DSB en E.coli
•
Iniciación
–
Procesamiento del DSB (RecBCD y RecQ)
–
Formación del filamento infectivo (RecA)
•
Apareamiento de homólogos e intercambio de cadenas
–
Invasión de la doble hélice
•
Extensión del heteroduplex
–
Complejo de proteínas motoras RuvAB
•
Resolución
–
Endonucleasa RuvC (parte del complejo RuvAB)
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Sistema RecBCD de recombinación
homóloga (E.coli)
14
•Extensión del heteroduplex
–Complejo de proteínas motoras RuvAB
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Distribución de sitios chi en el genoma de E.coli
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Recombinación Homóloga (HR) en Eucariotas
•
Como en procariotas HR es requerida para reparación y restablecimiento
de una horquilla de replicación frenada en eucariotas.
•
HR es crítica durante la meiosis para el apareamiento y alineamiento de los
cromosomas homólogos.
•
Sin HR y alineamiento correcto de los cromosomas Æ no disyunción
•
Control general de la recombinación: 1 o 2 cross-over / par de homólogos.
Probabilidad de ningún cross-over < 0,1%.
•
Frec. de recombinación no constante a lo largo del cromosoma
•
Frec. de recombinación depende del largo de las regiones homólogas >
75pb
•
Variabilidad
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Meiosis- Profase I
Leptotene
Condensamiento de la cromatina
Colocalización y coalineamiento de homólogos
DS Ærequeridos para el apareamiento
Zigotene
Formación del complejo sinaptonémico
Inicio de la recombinación Æ Filamento infectivo
Paquitene
Intercambio de cadenas Æ Unión de Holliday
Complejo sinaptonémico
Nódulos de recombinación
Diplotene
Recombinación completa
Disolución del complejo sinaptonémico
Separación cromosomas Æ Quiasmas
•Diaquinesis
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Complejo sinaptonémico
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Recombinación homóloga en Eucariotas durante
meiosis
•
“Factorias de recombinación”: incluyen varias proteínas y se forman
durante la meiosis.
•
DSB Æ al menos 10 genes requeridos: Spo11 endonucleasa
•
Complejo MRX: RAD50, XRS2, MRE11
•
Homólogos de RecA : RAD51 y DMC1
•
Rad52 interactúa con Rad51 y Dmc1 para antagonizar RPA (ss binding
protein) y promover más eficientemente el ensamblado del filamento de
Rad51-DNA en HR
•
La proteína Mus81 parecería ser el análogo eucariota de la Resolvasa
(RuvC)
20
21
Iniciación de recombinación homóloga durante meiosis
22
Procesamiento del DSB y formación del filamento infectivo
23
24
Overview of the main steps and factor requirements of the DNA DSB repair pathway of HR
Jackson, S. P. Carcinogenesis 2002 23:687-696; doi:10.1093/carcin/23.5.687
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RECOMBINACIÓN SITIO ESPECÍFICA
•Reacción entre dos sitios específicos
•Largo de sitios blanco 14-50pb
•Pueden ser secuencias homólogas o no
•Enzimas involucradas específicas (recombinasas)
ƒIntegración del Fago lambda (Recombinasa= Int)
ƒFago P1 (Recombinasa Cre / sitios loxP)
ƒResolución de cointegrados (plásmidos multiméricos)
ƒSistema de recombinación sitio específica Xer (Cromosoma
Bacteriano). En E.coli: sitio blanco (dif, 28pb) + 2 recombinasas XerC y
XerD.
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Integración del genoma del Fago Lambda en el genoma
de E.coli durante el ciclo lisogénico.
•Requiere secuencias específicas en el Fago Lambda y en el genoma
bacteriano
•Requiere proteínas específicas del Fago y de la Bacteria
•Ruptura e integración sin síntesis de DNA
•Ruptura sitio específica (endonucleasa específica) e intercambio de
cadenasÆ unión de Holliday
•Migración de rama (región homóloga) y resolución
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Int (fago)
IHF (bact)
Secuencias específicas
Proteínas específicas
attP (Fago λ )Æ POP’ 240pb
Int (fago)
attB (bacteria)Æ BOB’ 23pb
IHF (bacteria)
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attP Æ POP’ aprox 240pb
attB Æ BOB’ aprox 23pb
O = core Æ15pb
29
30
31
Sistema de recombinación basado en recombinación sitio específica del
fago lambda (sitios att)
2 Reacciones posibles:
1) attB x attP Æ attL + attR
(mediada por Int + IHF)
2) attL x attR Æ attB + attP
(mediada por Int + IHF +
Xis)
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attB1 y attB2 sitios attB mutantes
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Phage lambda recombination in E. coli
cos
Phage λ
The Gateway® System
attP
relies on five sets of
232 bp
specific and non cross-
x
reacting att sequences
attB
E. coli
21 bp
Integration
(Int, IHF)
Excision
(Int, IHF, Xis)
The specificity is given by
the 7 nucleotides of the
core region
attL
attR
96 bp
157 bp
Lysogen
34
Building a Gateway® Entry Clone
gene
attL1
ccdB
attB1
gene
attB2
attP1
+
attP2
Donor
Vector
KanR
attL2
Entry
Clone
attR1
ccdB
attR2
+
KanR
BP Clonase™ II
90-99% correct clones
on Kan plates
35
Obtaining a Gateway® Expression Clone
gene
attB1
attL1
attR1
attL2
Entry
Clone
KanR
ccdB
ccdB
gene
+
attR2
attP1
AmpR
attP2
Donor
Vector
Destination
Vector
LR Clonase™ II
attB2
Expression
Clone
+
AmpR
KanR
90-99% correct clones
on Amp plates
36
37
Sistema Cre/LoxP
38
39
Descargar