Que indicaban los experimentos de fusión celular? RLFs Como se descubrió que había un sitio de inicio? Características de los orígenes eucariotes Como se supo quien reconocía el sitio de inicio? Genes de mating en levaduras Mutaciones MCM FASE S DNA ORIGEN DE REPLICACION ATTTAATATTTT TAAATTATAAAA PROTEINAS ORC (1-6) G1-M CDC6 CDT1 M-G1 PROTEINAS MCM (2-7) G1-S CDC6 CDT1 M-G1 CDC6: Acumulación desde anafase. Regulación por CDKs Degradacion por proteasoma dependiente de M-CDKs y S-CDKs Posicionamiento en G1 tardía, salida en distintos tiempos de S Transporta a MCM7 Estabilización causa re-duplicación Trabaja en conjunto con CDT1 PROTEINAS ORC (1-6) G1-M Seis proteínas ORC, todas esenciales Proteínas ORC: Marca permanente de los sitios de origen. Todas tienen sitios de unión a ATP, pero solo Orc1 es ATPasa Orc2 tiene unión mas estable en el origen. Orc6, unión a DNA? Orc1 entra y sale del sitio. Se UB y se P por Cdks Orc4 es peculiar en S. pombe y quizás Xenopus Contacto con Cdc6 y con MCMs Participarían en silencing y en control de transcripción CDC6 CDT1 M-G1 CDT1: Corresponde a lo que se llamó RLF-B Presente en fase M en forma inactiva: degradación-inhibición Sustrato del proteasoma Inhibido por la proteína geminina en G1-S, auxiliado por MCM9 Acumulación provoca re-duplicación Fundamental para el cargado de MCMs (MCM7?) y su actividad de desapareo Trabaja en conjunto con CDC6 PROTEINAS MCM (2-7) G1-S Seis proteínas diferentes, todas esenciales Todas contienen motivos de unión a ATP. ATPasa sólida solo estando las 6 MCM4, 6, 7 son una helicasa; MCM2, 3, 5 controlan la actividad Fosforilables por S-CDKs y por DDK en forma cooperativa Se acumulan desde G1 temprana, pero sobre DNA hasta G1 tardía Requieren forzosamente la presencia de CDC6 y CDT1 Corresponden a lo que se llamo RLF-M CICLO DE CICLINAS Fase M Fase G1 PROTEASOMA G1 G1-Cycs ORC Cycs-Cdks de G1 Cycs-Cdks de M P Cdc6 M-Cycs Cdt1 PROTEASOMA M-G1 Fase G1 Cycs-Cdks de G1 E2F MCMs P-RB Transcripción p27 CycE, Cdc7, Dbf4 Cks1 P Pre-replication CAKs Complex P CycE-Cdk2 Cdc7-Dbf4 Metabolismo centrosomal Cargado de MCM (sin CDK) CycE-Cdk2 Cdc7-Dbf4 Transición a S CycE-Cdk2 P P CycE-Cdk2 P Cdc7-Dbf4 P Cdc7-Dbf4 P (MCM 2 y 4) P P CDK2/CIC E, CDC 45 p CDC7/DBF 4, (asociación a MCM4, MCM7, MCM2, MCM6) y P ppp p SLD1, MCM1, MCM10 SLD2, SLD3 pp pp ACTIVACION DEL ORIGEN p ppp ACTIVACION DEL ORIGEN RPA, Cdc45, Sld1, DNA pol alfa-primasa RP-A PCNA DNA POL ALFA-PRIMASA CDC45-MCM10-MCM8 RF-C DNA POL DELTA-cadena discontinua DNA POL EPSILON- cadena continua GINS FEN-1 RNASA H DNA LIGASA Al menos 30 proteínas en la horquilla!! Ciclina A/Cdk2 Cadena continua Cadena discontinua Polimerasa Helicasa Primasa Cebador de RNA Proteína de unión a cadena sencilla PCNA (matchmaker) e interacciones Monómero Dímero Interactua con: DNA ligasas, DNA polimerasas, RPA, RFC, CAF, Fen1, CDks, ciclinas, p21, p27, Cdt1, etc. Modificación por ubiquitinacion, sumoilacion, fosforilación Otras funciones: Proteínas de remodelaje de la cromatina Factores de ensamblaje de la cromatina (CAF) Cohesinas (proteínas SCC y SMC—ORC2) DNA topisomerasas Tipos de orígenes: Orígenes tempranos Orígenes tardíos Como se regulan???? Montaje y activación de orígenes: Rad53