INGENIERÍA GENÉTICA

INGENIERÍA GENÉTICA
Clonación de DNA
•
Introducir el DNA recombinante a una célula hospedera ( la maquinaria
enzimática para la replicación del DNA)
•
Seleccionar e identificar a las células hospederas que contienen el DNA
recombinante
Sistemas de restricción-modificación( M-R)
• análogo a un “sistema inmune”
• usado in vivo por bacterias para protegerse de ataques de
DNA exógenos
• Cómo defenderse del DNA exógeno ??
• Cómo proteger el DNA propio??
•
Restricción reconocimiento de DNA exógeno “extraño” y destrucción del mismo
•
Modificación El DNA propio es “marcado” químicamente (adición de grupos
metilo)
Par
endonucleasa + metilasa
de la misma especificidad
(reconocen la misma
secuencia)
Sistemas de restricción
Tipo I
Tipo II
Tipo III
Complejos multisubunidad
Actividad de endonucleasa y
metilasa en el mismo complejo
Enzimas endonucleasa y
metilasa independientes
Complejos multisubunidad
Actividad de endonucleasa y
metilasa en el mismo complejo
Cortan al DNA aleatoriamente
en sitios lejanos (1,000 pb) del
sitio de reconocimiento
Cortan en la secuencia de
reconocimiento
Cortan cerca (25pb) del sitio
de reconocimiento
Requieren ATP
Requieren ATP
Sistema de modificaciónmodificación-restricción Eco
EcoRI
RI (en E.
coli))
coli
Secuencias de reconocimiento de endonucleasas de restricción TipoII
Secuencias palindromicas de 4 a 8 pb
Tipos de corte
VECTORES DE CLONACIÓN
Vectores de clonación y/o expresión
• En procariontes:
–
–
–
–
Plásmidos bacterianos
Bacteriófagos
Cósmidos
BACs
• En eucariontes
– levaduras
• derivados del plasmido 2µ
µ,
• YACs
Approximate Maximum Length of DNA That Can Be
Cloned in Vectors
Vector Type
•
Cloned DNA (kb)
Plasmid
20
λ phage
25
Cosmid
45
BAC (bacterial artificial
chromosome)
300
YAC (yeast artificial
chromosome)
1000
VECTORES DE CLONACIÓN
• Vector de clonación- molécula de DNA transportadora
1.
2.
3.
4.
Replicación independiente (ori*)
Sitios de corte únicos
Marcador de selección
Recuperación sencilla
Plásmidos
pBR322
Bacteriófagos
Bacteriófagos
Cósmidos
BAC (cromosoma bacteriano artificial)
YAC (cromosoma artificial de levadura)
Secuenciación
Método Sanger
Secuenciación
Método de Sanger
1
2
3
4
Secuenciación
Método de
Sanger
MUESTRAS
Con ddT
Con ddC
Con ddG
Con ddA
SECUENCIAS DE DNA
NUCLEOTIDO
ATCCACGTGACCGTATATGCCTGAGATCCCTTCGT
*TAG
35
TAGG*
---------TGCAC*
-------------------TGGCA*
-----------------------------TA*
---------------------------------TACGGAC*
-----------------------------------------------TC*
-------------------------------------------------TAGGGAAGCA
TAGGTG*
------------CA*
----------------CTGG*
------------------------CATATA*
------------------------------------CGGA*
--------------------------------------------CT*
------------------------------------------------CTAGGGAAG*
-------------------------------------------------------------------CA
TAG*
------GT*
----------GCACT*
--------------------G*
----------------------GCATATAC*
--------------------------------------G*
----------------------------------------GACTCTA*
------------------------------------------------------G*
--------------------------------------------------------G*
----------------------------------------------------------GAA*
-----------------------------------------------------------------GCA
TAGGTGC*
--------------ACTGGC*
--------------------------AT*
------------------------------AT*
----------------------------------ACGG*
------------------------------------------ACTCT*
----------------------------------------------------AGGG*
-------------------------------------------------------------A*
-------------------------------------------------------------- AGC*
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35
Reacción en cadena de la polimerasa
PCR
Reacción en cadena de la polimerasa
PCR
Aislamiento mRNA
Construcción y escrutinio de bibliotecas
Bibliotecas de DNA
Bibliotecas de cDNA
Escrutinio
NORTHERN O SOUTHERN
BLOT
Microarreglos
Aplicaciones
También se puede introducir un nucleo a un ovulo anucleado, fecundar mediante
tratamiento hormonal y reintroducir el ovulo a una oveja (o cualquier animal).
Terapia génica