MADURACIÓN DEL OVOCITO Cambios fisiológicos durante la fase pre-ovulatoria Capacitan al ovocito para ser fecundado e iniciar el programa que dirige el desarrollo embrionario hasta la implantación Provocada por el pico pre-ovulatorio de LH Abarca: • Maduración nuclear • Maduración citoplasmática • Maduración de las células foliculares Maduración nuclear Vesícula germinal (Profase 1ª división meiótica ) →Metafase 2ª división meiótica (Extrusión del 1er corpúsculo polar) Maduración citoplasmática Síntesis de proteínas: Tubulina, actina, histonas, proteínas ribosomales (de 30 a 50%), lactato deshidrogenasa (de 80 a 90%), glicoproteínas de la zona pelúcida, glucosa 6 fosfato deshidrogenasa, creatinina quinasa MPGF: Descondensación de la cabeza del espermatozoide Reorganización orgánulos intracitoplasmáticos: Mitocondrias, Golgi, REL: formas menos activas Gránulos corticales: distribución uniforme → periférica Maduración de las células foliculares Células del cumulus oophorus: intervienen en la síntesis de proteínas Tras el pico de LH, la FSH → secreción de ácido hialurónico → ruptura entre las células del cumulus y el ovocito → expansión del cumulus → ¾Aumento de la superficie de contacto y adhesividad del complejo ovocito-cumulus ¾Interrupción de la llegada al ovocito de factores que impidan el reinicio de la meiosis MADURACIÓN IN VITRO DEL OVOCITO Conseguir en el laboratorio que el ovocito siga los mismos pasos que durante el periodo de maduración folicular previo a la ovulación Criterios para seleccionar la fuente y el tipo de ovocito Condiciones necesarias para que se dé la maduración completa del ovocito ORIGEN DE LOS OVOCITOS Hembras vivas: Elevado valor genético Animales prepúberes (2-3 meses): disminuye intervalo generacional Animales gestantes (primeros 3 meses de gestación) Hembras infértiles: oviductos obstruidos Hembras que no responden a tratamientos de SO Uso de diferentes machos OPU: Ovum Pick Up: Aspiración transvaginal guiada por ecografía -Repetición de la hembra -Situación fisiológica/patológica de la hembra conocida: raza, edad, estado de lactación, nutrición, estado reproductivo, patologías,… Nº de ovocitos recogidos: 4.5-10 ovocitos/OPU y vaca Hembras ovariectomizadas: No repetición de la hembra Pocos ovocitos/precio elevado Tratamientos de pre-estimulación: FSH Situación fisiológica/patológica de la hembra conocida: raza, edad, estado de lactación, nutrición, estado reproductivo, patologías,… Hembras de matadero: Fuente de obtención de ovocitos más utilizada No repetición de la hembra Ovocitos a bajo precio Recogida de un elevado número de ovocitos: en función de las hembras sacrificadas Desconocimiento total o parcial de la situación fisiológica/patológica de la hembras TÉCNICAS DE RECOGIDA DE LOS OVOCITOS Disección Consiste en aislar cada folículo ovárico del resto de tejido con ayuda de pinzas y tijeras, liberando posteriormente los ovocitos tras la ruptura controlada del folículo intacto Diámetro y grado de atresia del folículo conocidos Elevado rendimiento: 90-100 ovocitos/ folículo diseccionado Mayor proporción de ovocitos de buena calidad (60%) Máxima integridad de las células del cumulus oophorus Limitación: tiempo experimentos con pocos ovocitos importancia del origen folicular de los ovocitos Aspiración Consiste en la punción y extracción del contenido de los folículos mediante una aguja conectada a una jeringa u otro método de succión Bovino: el método más utilizado Menor rendimiento: 30-60 ovocitos / 100 folículos aspirados Menor proporción de ovocitos de buena calidad (45%): Menor integridad del cumulus (disgregación de las células a la aspiración) Ovocitos de mayor calidad firmemente anclados en el folículo Mayor rapidez de recogida de ovocitos: s/ovarios disponibles selección más estricta Slicing Consiste en realizar cortes longitudinales y transversales con una hoja de bisturí en la superficie de los ovarios para liberar los ovocitos Mayor % de ovocitos recuperados/ ovario Menor proporción de ovocitos de buena calidad (30-45%): Menor integridad del cumulus Ovocitos de mayor calidad firmemente anclados en el folículo Mayor rapidez de recogida de ovocitos: s/ovarios disponibles selección más estricta Bovino: Solución salina + heparina Slicing tras aspiración Bovino: no ha presentado ventajas: recuperación de ovocitos calidad de los ovocitos recuperados Otros métodos de recogida en masa Digestión del tejido ovárico con tripsina durante 1 h + filtración: 221 ovocitos/ovario Digestión de tejido ovárico con colagenasa (ovocitos preantrales) Temperatura ovocitos: > 25ºC SELECCIÓN DE LOS OVOCITOS Parámetros visuales: ¾ 3 o más capas de células del cumulus (Mayor % blastocistos: >5 capas) Intercambio de metabolitos y señales entre ovocito y células del cumulus → maduración citoplasmática Desechar ovocitos denudados o con cumulus incompleto Geshi et al. (1999): terneros a partir de ovocitos madurados sin cumulus en un medio de maduración suplementado con piruvato sódico y sin suero ¾ Cúmulus compacto vs cumulus expandido Blondin and Sirard (1992): cumulus ligeramente expandido vs cumulus compacto o expandido Wurth and Kriup (1992): cumulus ligeramente expandido y células más oscuras vs cumulus compacto y células brillantes ¾Apariencia homogénea del citoplasma vs heterogénea Nagano et al. (1999): citoplasma heterogéneo > potencial de desarrollo embrionario: presentan una mejor distribución de los gránulos corticales (ME) disminución de la poliespermia ¾Test Blue Cresyl Brilliant Glucosa 6 fosfato deshidrogenasa: sólo está presente durante el periodo de crecimiento del ovocito La G6PD reduce el BCB (azul) a un componente incoloro Ovocito en crecimiento (sí BCB) + BCB = ovocito incoloro→ no MIV Ovocito que ha terminado su crecimiento ( no G6PD) + BCB= ovocito azul → MIV SISTEMAS DE MADURACIÓN IN VITRO Medios de maduración De soluciones salinas a medios + complejos TCM 199: sales, piruvato sódico, lactato sódico, aminoácidos, vitaminas, purinas,..+/- tampones: Hepes, bicarbonato sódico pH: 7.2-7.4 Osmolaridad: 285-320mOsm/kg + Suplementos ¾Sueros: fuente de proteínas, ácidos grasos, VV, hormonas, factores de crecimiento, .. Suero fetal bovino, suero de vaca en celo, suero de buey ¾Hormonas: FSH, LH, estrógenos: ¾Epidermal Growth Factor ¾Cisteina, cisteamina, β-mercaptoetanol: precursores del glutation Glutatión: su concentración intracitoplasmática aumenta durante la maduración Protege al ovocito de reacciones oxidativas Favorece la descondensación de la cromatina→ formación del PN masculino Condiciones de cultivo Temperatura: 38.5ºC ¾Si < 25ºC: ↑ anormalidades del huso cromosómico ¾Si > 40ºC: ↑ poliespermia ¾Atmósfera: 5% CO , sobretodo si el medio de MIV contiene bicarbonato 2 ¾Tiempo: 24 h (vaca), 26 h (oveja), 27 h (cabra), 40-44h (cerda) ¾ Sistemas de maduración Microgotas 50 o 100 μl recubiertas por aceite mineral ¾Placas de 4 pocillos: 500 μl ¾Placas de petri : 2 ml ¾Co-cultivo: células de la granulosa células Vero: células de riñón de Green monkey. ¾Estático sin células / no estático + células granulosa ¾ VALORACIÓN DE LA MADURACIÓN IN VITRO ¾Expansión de las células del cumulus ¾Extrusión del 1er corpusculo polar 50% de pérdida ¾Maduración nuclear Fijación ovocito: etanol/ácido acético, paraformaldehido Lacmoide, orceina (óptico), Hoechst, DAPI, yoduro de propidio (fluorescencia) ¾Maduración citoplasmática Cambios ultraestructurales: poco práctico Síntesis de proteínas ??? ¾Capacidad de desarrollo del ovocito una vez fecundado Descodensación de la cabeza del espermatozoide Mórula,blastocisto: viabilidad inferior ¾Nacimiento de un animal vivo Grupos de embriones seleccionados Pocos nacidos FACTORES QUE AFECTAN A LA CALIDAD DEL OVOCITO ¾Diámetro del folículo Ovocitos procedentes de folículos pequeños (1-2 mm) : maduración nuclear pero immaduros citoplasmáticamente Ovocitos procedentes de folículos medianos (2-5 mm) o grandes (5-8mm): > % maduración nuclear y blastocistos ¾Diámetro del ovocito Relación entre el tamaño del folículo y el desarrollo del ovocito ⇒ relación entre crecimiento del ovocito y su capacidad de desarrollo in vitro Competencia meiótica aparece cuando el ovocito alcanza el 80-90% de su tamaño pero hasta que no alcanzan su tamaño máximo, no puede completar la maduración citoplasmática (Thibault et al) ≤ 90 μm: Incapaces de reiniciar la meiosis <100 μm: 21 % ovocitos alcanzan la MII 100-109 μm: 42% ovocitos alcanzan la MII 110-119 μm: 76% ovocitos alcanzan la MII ≥ 120 μm: 81% ovocitos alcanzan la MII Folículo<1: ovocito 98.9 μm Folículo 1-1.9: ovocito 106.8 μm Folículo 2-2.9: ovocito 112.9 μm Folículo 3-3.9: ovocito 116.0 μm Folículo >4: ovocito 117.2 μm 115 μm: reinicían la meiosis/ 120 μm: maduración nuclear y citoplasmática ¾Morfología del ovario Gandolfi et al. (1997) A) Presencia de un folículo > 10 mm diámetro B) Presencia de más de 10 folículos de 2 a 5 mm de diámetro y ninguno de > 10 mm C) Presencia de menos de 10 folículos de 2 a 5 mm de diámetro y ninguno de > 10 mm ¾Edad Animales prepúberes/adultos ¾Estado hormonal Ciclo estral Gestación ¾Tratamientos hormonales (FSH o PMSG) Incrementa el nº ovocitos /ovario Mejoran/no mejoran la calidad del ovocito Respuesta variable entre hembras Evitar activación ¾Otros Estación: vaca< oveja y cabra Individuo ¾Edad Animales prepúberes/adultos ¾Estado hormonal Ciclo estral Gestación ¾Tratamientos hormonales (FSH o PMSG) Incrementa el nº ovocitos /ovario Mejoran/no mejoran la calidad del ovocito Respuesta variable entre hembras Evitar activación ¾Otros Estación: vaca< oveja y cabra Individuo