Advanced Topics in STR DNA Analysis

AAFS 2006 Workshop (Butler and McCord)
Advanced Topics in STR DNA Analysis
February 20, 2006
Cuantificación de ADN con
'Real-time qPCR' y
Problemas de Bajo Número
de Copias
mccordb@fiu.edu
Cuantificación de ADN con 'Real-time qPCR' y Problemas con Bajo Número de
Copias
Resúmen para esta sección
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•
Porqué cuantificar el ADN?
'Slot blot' vs. 'real-time qPCR'
Teoría de qPCR
qPCR assays available
Retos de Bajo Número de de Copias
Umbral Estocástico
Técnicas de Cuantificación
http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/training.htm
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Propósito de Cuantificación Específica para
Humanos
• Todas las fuentes de ADN son extraídas cuando la evidencia
biológica de una escena de crimen es procesada para separar el
ADN presente.
• Por lo tanto, ADN no humano, como aquel proveniente de bacterias,
hongos, plantas o material animal también puede estar presente en
el ADN recuperado de la muestra junto al ADN humano relevante o
de interés.
• Por esta razon, el Estándar 9.3 del "DNA Advisory Board" (DAB)
requiere cuantificación específica para ADN humano de manera
que los niveles apropiados de ADN humano puedan ser incluídos
en la amplificación por PCR.
• Análisis de STR por 'Multiplex' trabaja mejor con un rango
estrecho de ADN humano – típicamente 0.5 a 2.0 ng de ADN
inicial trabaja mejor con estuches de STR comerciales.
Cálculo de la Cantidad de ADN en la Célula
1. Peso Molecular de un par de bases de ADN = 618g/mol
A =: 313 g/mol; T: 304 g/mol;
G = 329 g/mol; C: 289 g/mol;
A-T base pairs = 617 g/mol
G-C base pairs = 618 g/mol
2. Peso Molecular de ADN = 1.85 x1012 g/mol
Existen 3 billones de pares de bases en una célula haploide ~3 x 109 bp
(~3 x 109 bp) x (618 g/mol/bp) = 1.85 x 1012 g/mol
3. Cantidad de ADN en una célula haploide = 3 picogramos
1 mole = 6.02 x 1023 molecules
(1.85 x 1012 g/mol) x (1 mole/6.02 x 1023 molecules)
= 3.08 x 10-12 g = 3.08 picograms (pg)
Una célula diploide humana contiene ~6 pg ADN genómico
4. Un ng de ADN contiene el ADN de 167 células diploides
1 ng ADN genómico (1000 pg)/6pg/cell = ~333 copias de cada 'locus'
(2 por 167 genomas diploides)
¿A dónde queremos llegar?
• Usted necesita colectar suficientes células para prevenir efectos estocásticos
–
– 167 células = 1 ng ADN total
– 1 pg de ADN es 1/6 de una célula
– 100 pg es 17 células
• PCR puede amplificar fracciones de una célula– Sólo aumente el número de ciclos
– Pero, que usted quiere hacer?
– El umbral de bajo número de copias (LCN) es alrededor de 100-200pg
• Usted puede querer saturar el sistema– 'Stutter' aumenta
– Ruido aumenta
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Impacto de Cantidad de ADN en PCR
Razón por la cual la Cantidad de ADN es importante antes de una amplificación 'multiplex'
Generalmente 0.5 – 2.0 ng de ADN
es mejor para estuches de ADN
• Demasiado ADN
• Muy poco ADN
– Picos fuera de escala
– Picos divididos (+/-A)
– Desbalance entre 'locus'
– Desbalance de picos heterocigotos
– Decaimiento de alelos
– Desbalance entre 'locus'
Tamaño de ADN (bp)
Relative Fluorescence (RFUs)
Tamaño de ADN (bp)
-A
+A
100 pg
template
10 ng de ADN
(sobrecargado)
D3S1358
2 ng de ADN
(nivel sugerido)
5 pg
template
Efecto estocástico cuando se
amplifican bajos niveles de ADN
produce decaimiento de alelos
¿Porqué usted quiere estar en el 'punto
exacto' en la cuantificación de ADN?
Data de mayor calidad que resulta en
interpretación más fácil
– Mejor balance entre 'loci'
– Picos en escala sin efectos del tinte fluorescente
– No hay picos 'partidos' causados por adenilación
parcial
• Estuches de STR, especialmente aquellos que
amplifican una mayor cantidad de 'loci' son
optimizados para un rango estrecho de ADN
Métodos de Cuantificación Actuales
• UV 280/254 – no es sensitivo o específico para
humanos ó ADN
• Gelatina – no es específica para humanos, dice
calidad de la muestra pero no es sensitivo
• Fluorescencia – no es específico para humanos,
sensitivo
• 'Slot blot' – Específico para humanos, sensitivo
• RtPCR- específico para humanos, muy
sensitivo, buen rango dinámico
http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/training.htm
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http://www.agen.ufl.edu/~chyn/age4660/lect/lect_07/FG06_055.GIF
Otro es Oxazole Yellow- YO-PRO
http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/training.htm
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SYBR Green es el favorito
actualmente
http://www2.umt.edu/medchem/medchem/mc11.jpg
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Marcador
ADN degradado
Muestra
Técnicas más complejas envuelven especificidad humana
haciendo pruebas con ADN denaturado
Monitor Abs at 260 nm
http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/training.htm
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Chaotropic salts
(3) Otros métodos para ajustar el nivel de rigor incluyen temperatura ó la
adición de ADN 'non-template' como un arenque de esperma, etc.
El estuche de Cuantificación, "QuantiBlot® Human DNA" está basado
en la hibridización de un oligonucleotido biotinilado a las muestras de
ADN extraído y su detección colorimétrica o quimioluminiscente.
Cuantificación precisa está basada en la comparación visual de las
muestras en cuestión y las muestras de estándares diluídos. Los
resultados de cuantificación pueden ser obtenidos en menos de dos
horas, incluyendo el tiempo de desarrollo de señal, desde tan poco
como 0.15 ng hasta 10 ng de ADN humano o de primates.
http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/training.htm
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Detección Quimioluminiscente
Quantiblot (PE)
ECL (Amersham)
La prueba ECL para ADN utilizando
Peroxidasa de rábano para detección
quimioluminiscente
http://www.bio.davidson.edu/courses/molbio/Protocols/chemi.html
Detección de Quimioluminiscencia Realzada en ADN ó ARN
adaptado del protocolo Amersham's
http://www.bio.davidson.edu/courses/molbio/Protocols/chemi.html
Introducción
Este procedimiento rotula las pruebas de ADN ó ARN directamente con peroxidasa de with
horseradish peroxidase (HRP). This is achieved by completely denaturing the probe into a singlestranded form. The peroxidase has been complexed with a positively charged polymer which
causes the HRP to form a loose attachment to the negatively charged nucleic acid. This ionic
interaction can be disrupted by counter ions so the probe must be in a very low-salt solution. After
the probe and HRP have associated, glutaraldehyde creates covalent bonds between the HRP and
the probe.
Once the probe is labeled, it can be used immediately to detect DNA or RNA bound to a
membrane. From this stage on, it is important to ensure that the enzyme activity is not lost, so do
not expose the labeled probe to high temperatures. Amersham has provided us with a optimized
hybridization buffer which ensures efficient hybridization while protecting the enzyme's activity. The
buffer includes 6M urea (equivalent to 50% formamide) which reduces the melting temperature
(Tm) of the hybridization. Therefore, when controlling stringency of the hybridization, the only
parameter which may be altered is salt concentration.
After hybridization, the membranes are washed to remove non-hybridized probe, again making sure
not to inactivate the HRP. Stringency of the washing conditions may be altered by adjusting the
urea or SSC concentration in the primary wash buffer. If an urea wash is not used, the temperature
of this wash can be raised to a maximum of 55 C, provided the wash is performed for no longer
than 2 X 10 minutes. The washed filters can be taken directly to the ECL detection or stored moist
in saran wrap at 4° C.
Detection reagent #1 decays to H2O2 , the substrate for HRP. Reduction of H2O2 by the enzyme is
coupled to the light producing reaction by detection reagent #2. This contains luminol which
produces a blue light when oxidized. The light production is increased and prolonged by the
presence of an enhancer reagent in the detection solutions
http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/training.htm
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Determinación de resultados utilizando
programa de 'scanning'
http://scanalytics.com/product/zeroD/slotblot.shtml
El Sistema de Cuantificación de ADN Humano AluQuant™ utiliza pruebas humanas específicas a
secuencias altamente repetitivas en ADN cromosomal para medir la cantidad ADN humano presente
en su muestra. AluQuant™ utiliza una reacción de luciferasa para producir luz. La cantidad de luz
producida por la reacción corresponde a la cantidad de ADN humano presente en la muestra. El
resultado es leído por un luminómetro. No hay que preparar gelatinas, o reacciones de PCR.
Reacción enzimática está
bloqueada a menos que
probe is
bound to DNA
http://www.dczogbi.com/genetic1.html
PCR Cuantitativo
• ¿Qué es 'rtPCR' ó 'qPCR'?
• ¿Cómo funciona?
• ¿Cómo se compara a métodos tradicionales
de cuantificación de ADN humano?
• ¿Qué técnicas están disponibles?
• ¿Qué sistemas hay disponibles?
http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/training.htm
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Historia
• La técnica de RtPCR fue desarrollada recientemente
– Desarrollada por Higuchi en 1993
– Utilizó un termociclizador modificado con un detector UV y una cámara
CCD
– Bromuro de etidio fue utilizado como un agente intercalante. A medida
que la concentración de ADN de doble cadena aumentaba, la
fluorescencia aumentaba.
• Higuchi, R.; Fockler, C.; Dollinger, G.; Watson, R. “Kinetic PCR analysis:
real-time monitoring of DNA amplification reactions” Biotechnology (N Y).
1993 Sep;11(9):1026-30
'Slot Blot'
• 2 dias de enjuages, encubaciones,
pipeteo, lavados, exposiciones y
desarrollos
• Semi-cuantificación por comparación
manual o por medio de 'scanner'
• Cantidad obtenida puede no reflejar el
resultado final debido a variaciones en la
eficiencia de PCR
'RtPCR'
• 2 horas de preparación y tiempo de
corrida
• Cuantificación automatizada
• Cantidad obtenida refleja resultado
amplificable
Problema mayor – sensitividad y rango
dinámico
Quantiblot-ECL
40 pg - 2.0 ng
ACES 2.0
40 pg - 4.0 ng
Ya no está disponible
(ACES tendía a trabajar mejor en ADN degradado)
Real Time PCR
1.0 pg - 16 ng
RTPCR tiene límite de detección más
pequeño y un rango dinámico más
grande
http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/training.htm
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'Slot Blot' vs 'Real-time qPCR'
Slot Blot (Quantiblot)
• 2-3 horas de enjuages, encubaciones, pipeteo,
lavados, exposiciones y desarrollos
• Envuelve comparación con estándares corridos
simultáneamente
• Semi-cuantitativo por comparación manual o
por medio de 'scanner'
• Cantidad obtenida no va a reflejar inhibidores
de PCR (cantidad de ADN "amplificable")
Real-time qPCR (Quantifiler u otro ensayo)
• 1 hora de preparación y dos horas de corridas
• Envuelve comparación a estándares corridos
simultáneamenten
• Cuantificación automatizada
• Cantidad obtenida refleja la cantidad de ADN
"amplificable"
Preparación de Muestra y Análisis de Data
con 'Slot Blot' versus Real-time qPCR
Sensitividad de Prueba y Rango Dinámico
Quantiblot-ECL
40 pg - 2.0 ng
ACES 2.0
40 pg - 4.0 ng
Ya no está disponible
(ACES tendía a trabajar mejor en muestras de ADN
degradadas)
Real Time qPCR
1.0 pg - 16 ng
qPCR tiene límite de detección
menor y un rango dinámico
más grande
http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/training.htm
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PCR Cuantitativo
• ¿Qué es 'rtPCR' ó 'qPCR'?
• ¿Cómo funciona?
• ¿Cómo se compara a métodos tradicionales
de cuantificación de ADN humano?
• ¿Qué técnicas están disponibles?
• ¿Qué sistemas hay disponibles?
Historia
• La técnica de RtPCR fue desarrollada recientemente
– Desarrollada por Higuchi en 1993
– Utilizó un termociclizador modificado con un detector UV y una cámara
CCD
– Bromuro de etidio fue utilizado como un agente intercalante. A medida
que la concentración de ADN de doble cadena aumentaba, la
fluorescencia aumentaba.
Primera publicación en qPCR
• Higuchi, R.; Fockler, C.; Dollinger, G.; Watson, R. “Kinetic PCR analysis:
real-time monitoring of DNA amplification reactions” Biotechnology (N Y).
1993 Sep;11(9):1026-30
PRECAUCIÓN: RT-PCR puede también significar PCR de
transcriptasa al reverso, que es utilizado cuando se trabaja con RNA
Amplificación por PCR
• En teoría la cantidad de plantilla de ADN en el PCR se
duplica con cada ciclo.
• Después de 2 ciclos la cantidad de producto es 2 veces
la cantidad inicial de la plantilla
• Después de N ciclos la cantidad del producto es
P = (2) n T
– Por lo tanto, existe una relación exponencial entre la cantidad
original del producto y la cantidad de la plantilla
http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/training.htm
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Cantidad de Producto de PCR es Proporcional a
la Cantidad de Plantilla Inicial de ADN
Durante la expansión exponencial de PCR, la
cantidad de producto producido es
proporcional a la cantidad de plantilla. Aquí
se muestra la cantidad total de producto
después de 32 ciclos.
Exponential PCR
1.00E+10
9.00E+09
ng product
8.00E+09
7.00E+09
6.00E+09
2ng template
5.00E+09
4.00E+09
1ng template
3.00E+09
0.5ng template
2.00E+09
1.00E+09
0.00E+00
0
5
10
15
20
25
30
35
# Cycles
Qué es qPCR?
• Para utilizar PCR como técnica cuantitativa, la reacción
debe estar claramente definida
• De hecho, existen diferentes etapas en la reacción de PCR
– Etapa de Base de fondo
– Etapa Exponencial
– Etapa de Meseta
meseta
exponencial
Base de fondo
Mesetas de PCR
• Los productos de PCR no se pueden duplicar
por siempre
–
–
–
–
Limitados por
Cantidad de 'primer'
Actividad de polimerasa
Re-enlace de cadenas de productos
• Alcanzar umbral
– No hay más aumento en producto
• Detección de punto final
– Correr por un número de ciclos fijos y luego
cuantificar en gelatina de agarosa
http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/training.htm
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Problema #1: Mesetas de punto final no
dependen T
Aunque sea el mismo ADN, tubos diferentes van a alcanzar diferentes mesetas
25
Mismo ADN en todos los tubos
20
15
10
5
0
0
10
20
30
40
Cycle
Karen Carleton
Hubbard Center for Genome Studies and Department of
Zoology
Problema #2: Para la detección del punto
final, cuantos ciclos se necesitan?
Diferentes pozos alcanzan la meseta durante diferentes ciclos. Depende de
cuando reach plateau at different cycle numbers. Dependiendo del momento
en que uno mire se verán diferentes cosas.
16
14
12
10
8
6
4
2
0
0
10
Cycle
20
30
40
Karen Carleton
Hubbard Center for Genome Studies and Department of
Zoology
Cuantificación utilizando métodos alternos
a RT-PCR
• Aunque utilizada en la resolución de
mezclas, el PCR técnicamente no es una
técnica cuantitativa
• El tiempo y rapidez en el cual aparece la
meseta varía con la temperatura, la
posición del tubo, inhibidores, matrix
• Una vez se alcanza la meseta, el
aumento en concentración de producto
no es linear
• Estándares pueden ser añadidos pero
deben tener el mismo lugar de enlace de
'primers' y una secuencia similar a la del
ADN en cuestión
http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/training.htm
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Solución
• Utilize data cuando aún esté en la fase
exponencial
– Producto de PCR es proporcional a la plantilla
inicial
• Se necesita observar el producto de PCR en
cada ciclo
– Utilize detección fluorescente, donde la
fluorescencia es proporcional al producto de PCR
• Utilize un instrumento de 'Real-time' que
almacene la fluorescencia de cada pozo en
cada ciclo
Karen Carleton
Hubbard Center for Genome Studies and Department of
Zoology
Cuantificación utilizando la reacción de PCR
• PCR procedes exponencialmente doblando en cada ciclo:
Yn= Yn+1(1+Ec)
Donde Ec es la eficiencia (Ec = 1 para una amplificación perfecta)
y Yn es el total del producto para un ciclo en particular
• Durante la etapa exponencial de la reacción
Ec es relativamente constante y el producto de la reacciónY es función
de la cantidad inicial de ADN, X
Y = X (1+ Ec)n
Efecto de eficiencia en concentración de
ADN
•
Ec es una función de:
• Eficiencia de
hibridización
• Cantidad de
reactivos y ADN de
interés
• Temperatura
http://www.med.sc.edu:85/pcr/realtime-home.htm
http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/training.htm
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'Real Time' PCR
• Cuantificación de ADN está basada en el número de ciclos
requeridos para alcanzar una intensidad de umbral, Ct.
• Mientras mayor la cantidad de ADN inicial, más pronto se
alcanza el valor de umbral.
Ct
http://www.med.sc.edu:85/pcr/realtime-home.htm
Cuantificación utilizando Ct
• El log de la concentración de la plantilla de ADN
vs Ct es graficado utilizando una serie de
estándares que proveen una curva de calibración
• El desconocido es entonces corrido y el número de
ciclos requerido para alcanzar el umbral, Ct es
comparado a la curva de calibración
Desarrollo de una curva estándar
5.0 ng
1.3 ng
0.31 ng
0.078 ng
0.0 ng
(blanco de reactivo)
Ct
http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/training.htm
16
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La data obtenida es graficada en una escala log y el número
fraccional de ciclos requeridos para alcanzar el Ct es
determinado
Curva Estándar
Cycle #
Graficar el número de ciclos en el umbral CT vs
concentración
nanogramos
Concentración = 10^(-0.297*CT+ 4.528)
Métodos de Detección
• Tinte fluorescente intercalante - SYBR Green
– Fluorescencia aumenta con concentración de ADN de
cadena doble
• Marcador Taqman
– Fluorescencia aumenta a medida que el marcador es
digerido
• Marcador Molecular Visible
– Fluorescencia aumenta a medida que marcador se
hibridiza con la plantilla
http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/training.htm
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SYBR green product detection
• Easy
– Fluorescence only with dsDNA
– Use with existing PCR primers
• Generic,
– Detects all double stranded
products, including primer dimers
– However, can be very specific with
proper primer design
• Singleplexed
– Multiple probes cannot be used
dsDNA Intercalation
http://www.probes.com/handbook/figures/1557.htm
Molecular beacons
– Consist of ssDNA with an internal complementary
sequence that keeps reporter and quencher dyes
close → No fluorescence
Molecular beacon
Reporter
Quencher
– Following denaturation, beacon anneals to template,
separating both dyes and yielding fluorescence
proportional to PCR product concentration
Molecular Beacons
• Improved specificity and multiplexing
– Non-specific amplification will not produce a signal
– Can multiplex several probes (quantify nuclear, Y, int std.)
• Can be tricky to design
–
–
–
Loop portion – binds to DNA template
Stem portion – must be complementary to other stem
Probe must denature from template below 72º so Taq
polymerase does not chew it up during extension step
Tanneal< Tm < Text
Above Tm loop structure reforms and probe leaves template
http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/training.htm
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Taqman
Probe also binds to PCR product during extension
but is always quenched
– 5’-3’ exonuclease activity of Taq polymerase digests
probe and frees reporter dye from quencher
– Free dye accumulates with PCR product
R
Taq
Q
Taq
Probes vs SYBR Green
• SYBR Green
– Singleplex probes (Alu)
– If no sample, amplification of contaminants occurs at high
cycle #
– If inhibition, no result or poor efficiency curve
• Probes (Taqman, Mol. beacons)
– Multiplex targeted probes – Quant Y, nuclear DNA, int. std
– Inhibition and no sample can yield no result (if single locus
probe)
– to check for inhibition, an internal std. is used
• Choice: Simplicity (SYBR green) vs Multiplexing
(probes)
Single vs Multilocus Targets
• SYBR Green – Multilocus Probe
– Alu inserts occur at multiple locations throughout the genome sensitive
– If no sample, amplification of contaminants occurs at high cycle #
– Syber green requires no special kit –Inexpensive
• Probes (Taqman, Mol. beacons)
– Single location in genome
– an internal std. is used to check for amplification and correct for
changes in efficiency
– Lower sensitivity due to noise at low copy number
• Choice: Sensitivity (SYBR green) vs Internal Standard
Precision (probes)
http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/training.htm
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Effects of Inhibitors on Alu Assay
• Use Alu sequence, present at
1,000’s of copies/cell
– Assay is sensitive to ambient human
DNA in air and water
– Normal Reagent blanks have a Ct at
about 27-29 cycles
• If inhibitors are present – no
amplification occurs or efficiency is
altered
Reagent Blank
– Thus low level ambient DNA serves as
an internal control for inhibitors
• For non Alu based RtPCR, an
internal standard is required to
detect inhibition
Comparison Studies Slot Blot vs RT qPCR
1
2
3
4
5
6
7
8
Reference
5
1.25
0.3125
0.078125
5
1.25
0.3125
0.078125
RTi-PCR
5.38
1.14
0.29
0.08
4.92
1.32
0.30
0.09
Quantiblot
6.25
0.56
0.56
0.12
8.75
0.63
0.81
0.23
Calibration studies in McCord lab with experimental primers
sample
rtPCR
slot blot
Tho1 Allele
blood on stick
0.32
0.50
1880
blood on metal
0.40
0.50
1890
blood on concrete
0.40
0.50
1860
blood on leaves
0.08
0.20
1540
blood on cardboard
0.27
0.24
1450
blood on cloth
0.04
0.05
577
blood on denim
0.25
1.00
1240
From validation work of Jan Nicklas and Eric Buel
Nicklas, J.; Buel, E. (2003) J. Forensic Sci. 48(5): 936-944
Future Applications of qPCR
•
•
•
•
Determination of Mt vs Nuclear DNA
Determination of Y vs Nuclear DNA
Determination of sample degradation
Sample screening by melt curves
http://pathmicro.med.sc.edu/pcr/realtime-home.htm
http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/training.htm
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Sequential detection of mtDNA and
nuclear DNA (Alu)
Nuclear
mt
Reagent
Blank
Quality of data depends on technique!
R-Value:
Perfect 1.000 !!
Rayna and Sarah
Work in FIU Laboratory- with assistance
of Vermont Crime Lab
•
Development of miniplex STRs
for degraded DNA typical sizes
60-120 bp.
•
Slot blot works poorly on these
samples
•
So develop a series of different
primers to selectively amplify
degraded dna
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Determination of DNA Quality by qPCR
AluYa5 Primers – Nicklas and Buel
Primer design
Results using primers from Nicklas & Buel
Vermont Crime Lab
Lane A –ΦX HaeIII
Lane B – No digestion
Lane C – 30 sec digestion
Lane D – 1 min digestion
Lane E – 2 min digestion
Lane F – 3 min digestion
Lane G – 4 min digestion
Lane H – 8 min digestion
Lane I – 12 min digestion
Lane J – 16 min digestion
Lane K – 24 min digestion
Lane L – 32 min digestion
Lane M – 48 min digestion
Quantitation of DNase I degraded DNA
using 3 primer sets
0.8
An example of the
quantitation results
obtained with a
degraded DNA
sample. Error bars
represent 95%
confidence
interval.
0.7
0.6
ng/uL
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
82
124
201
Size of amplicon in base pairs
http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/training.htm
22
AAFS 2006 Workshop (Butler and McCord)
Advanced Topics in STR DNA Analysis
February 20, 2006
Quantification of Bone Sam ple s: Short vs Long Alu Prim ers
0.12
Concentration (ng/uL)
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
99
47
A
20
03
.4
.1
20
03
.5
.6
20
03
.5
.7
20
03
.5
.1
20
03
.5
.2
20
03
.5
.3
20
03
.5
.8
20
03
.5
.1
6
20
03
.5
.2
2
20
03
.5
.2
5
20
03
.5
.2
6
20
03
.5
.2
9
0
Sam ple
Short Alu Primers
Long Alu Primers
Quantification of Telogen Hair Sam ples w ith Short (124bp) and Long (280bp)
Alu Prim ers
160
140
120
pg/uL
100
80
60
40
20
0
9948
1
2
3
4
5
6
7
8
9948A
A
C
D
E
F
G
H
S a mp l e
Short Alu Primers
Long Alu Primers
RT-qPCR Instruments Cited
• Corbett Research Rotorgene
– Phenix Research, Hayward, CA
• ABI 7000 or 7500 Sequence Detection System
• ABI 7700 (discontinued)
• ABI 7900HT Sequence Detection System
– Applied Biosystems Foster City, CA
ABI 7000
Corbett Rotorgene
http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/training.htm
23
AAFS 2006 Workshop (Butler and McCord)
Advanced Topics in STR DNA Analysis
February 20, 2006
Real-Time qPCR Efforts
• Marie Allen – nuclear and mtDNA assay (BioTechniques 2002,
33(2): 402-411)
• Eric Buel – Alu system (JFS 2003, 48(5):936-944)
• Centre for Forensic Sciences – nuclear; TH01 flanking
region (JFS 2003, 48(5):1041-1046)
• John Hartmann – Alu system (SWGDAM Jan 2003)
• CA-DOJ – TH01 assay (NIJ DNA Grantees June 2003)
• SYBR Green assay – human-specific with right PCR
• Quantifiler kit (ABI) – separate nuclear and Y assays
REAGENT COSTs
• Assay reagent costs:
– Quantifiler: $2.46/sample (only permits 2 µL/sample)
– SYBR Green: $0.80/sample (up to 10 µL/sample)
– QuantiBlot: $0.54/sample (5 µL/sample)
http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/DNAquant.htm
– Due to convenience and the presence of the internal
control DNA, most labs are moving to Quantifiler, with
the exception of labs which need high sensitivity for
LCN. They tend to use SYBR green
Proceeding with Testing when “No DNA” Detected
If the qPCR results indicate that there is no detectable
DNA, will you stop testing or will you proceed with
attempting STR typing?
• The practice of proceeding even with a “no result”
Quantiblot was because the STR typing assay was more
sensitive than the quantification method.
• What types of experiments might be done to satisfy you
that “no result” from a qPCR assay is truly “no DNA”?
http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/training.htm
24
AAFS 2006 Workshop (Butler and McCord)
Advanced Topics in STR DNA Analysis
February 20, 2006
Difference in DNA Quantitation Capability
vs. STR Typing Sensitivity
Nuclear DNA quantities
1 ng
This gap has kept labs
proceeding with “no result”
slot blot samples
Quantiblot Limit of Detection (LOD)
STR typing (28 cycles) LOD
100 pg
Low Copy
Number Realm
LCN STR typing (34 cycles) LOD
Real-time qPCR LOD
1 pg (less than a single cell)
mtDNA possible due
to higher copy #
Conclusions
•
•
•
RTPCR is a homogeneous PCR based method for
human specific quantification
– Is easily automated, provides electronic storage of
data
– SYBR green or targeted probes can be used
Results give quantity of amplifiable DNA – not
necessarily overall quantity
– Inhibition can be detected
– Multiplexing can be used
Big advantages are speed and dynamic range
Acknowledgements
•
•
•
•
•
Jan Nicklas and Eric Buel - Vermont Crime Laboratory
Jiri Drabek
Denise Chung, Kerry Opel
Nancy Tatarek
John Butler, Yin Shen
• Major support provided by
• The National Institute of Justice
•
•
The OU Provost’s Undergraduate Research Fund
Ohio University Research Incentive Fund
http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/training.htm
25
AAFS 2006 Workshop (Butler and McCord)
Advanced Topics in STR DNA Analysis
February 20, 2006
References
On-line
http://www.med.sc.edu:85/pcr/realtime-home.htm
http://www.realtimeprimers.org/
http://dna-9.int-med.uiowa.edu/realtime.htm
http://dorakmt.tripod.com/genetics/realtime.htm
In Print
Nicklas, J.; Buel, E., J. Forens. Sci. 2003, 48(5) pp. 936-944
Andreasson, H; Gyllensten, U.; Allen, M. Biotechniques 2002, 33, pp. 402-411.
Klein, D. “Quantification using rtPCR technology: applications and limitations”
Trends in Molecular Medicine, 2002, 8(6) pp. 257- 260.
Tyragi, S.; Kramer, F. “Molecular Beacons: Probes that fluoresce upon hybridization”
Nat. Biotechnol. 1996, 14, pp. 303.
Ginzinger, D. “Gene Quantification using real-time quantitiative PCR”
Experimental Hematology, 2002, 30, pp. 503-512.
Jordan, J. Real time detection of PCR products and microbiology,
Trends in microbiology 2000, 12, pp. 61-66
Low-Copy Number (LCN) Work
•
•
Early work on touched objects and single cells:
–
van Oorschot, R. A. and Jones, M. K. (1997) DNA fingerprints from fingerprints. Nature.
387(6635): 767
–
Findlay, I., Taylor, A., Quirke, P., Frazier, R., and Urquhart, A. (1997) DNA fingerprinting from
single cells. Nature. 389(6651): 555-556
Application to routine forensic casework was pioneered by the
Forensic Science Service:
–
Gill, P., Whitaker, J., Flaxman, C., Brown, N., and Buckleton, J. (2000) An investigation of the
rigor of interpretation rules for STRs derived from less than 100 pg of DNA. Forensic Sci. Int.
112(1): 17-40
–
Whitaker, J. P., Cotton, E. A., and Gill, P. (2001) A comparison of the characteristics of
profiles produced with the AMPFlSTR SGM Plus multiplex system for both standard and low
copy number (LCN) STR DNA analysis. Forensic Sci. Int. 123(2-3): 215-223
–
Gill, P. (2001) Application of low copy number DNA profiling. Croatian Medical Journal 42(3):
229-32
Stochastic Fluctuation Effects
• Unequal sampling of the two alleles present in a
heterozygous individual can occur when low levels of
input DNA are used (results in allele drop-out)
• PCR reactions with <100 pg (~17 diploid copies)
• Walsh et al. (1992) – propose avoiding stochastic effect
by adjusting the number of PCR cycles in an assay so
that the sensitivity limit is around 20 or more copies of
target DNA (i.e., a full profile is obtained with ~125 pg)
Walsh PS, Erlich HA, Higuchi R. Preferential PCR amplification of alleles: Mechanisms and
solutions. PCR Meth Appl 1992; 1:241-250.
http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/training.htm
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AAFS 2006 Workshop (Butler and McCord)
Advanced Topics in STR DNA Analysis
February 20, 2006
Stochastic Statistical Sampling
Copies of
allele 1
Copies of
allele 2
True amount
What might be sampled
by the PCR reaction…
OR
Resulting
electropherogram
Allele imbalance
>20 copies per allele
Allele dropout
6 copies copies per allele (LCN)
Comparison of STR Kit Amplification SOP with LCN
Using the Same DNA Donor
Input DNA
Data from Debbie Hobson (FBI) – LCN Workshop AAFS 2003
SOP
1ng
PHR = 87%
50 µL PCR
PHR = 50%
5 µL PCR
Allele Drop Out
LCN
8pg
Allele Drop In
Heterozygote
Allele Imbalance
Balance of Assay Sensitivity
and Potential for Stochastic Effects
• One of the ways that assays can be made more sensitive is by
increasing the number of PCR amplification cycles
• Optimal cycle number will depend on desired assay sensitivity
• The number of PCR cycles was set to 28 for ABI STR kits to limit
their sensitivity for generating full profiles to ~125 pg or 20 cells
• Sensitivity is a combination of fluorescent dye characteristics
(relative to the instrument and laser excitation used) and PCR
amplification conditions such as primer concentration and amount of
polymerase used
Note that Promega STR kits use higher numbers of cycles to generate roughly
equivalent sensitivity to ABI kits because they have less efficient dye labels
and lower primer and polymerase concentrations
http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/training.htm
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AAFS 2006 Workshop (Butler and McCord)
Advanced Topics in STR DNA Analysis
February 20, 2006
Higher Sensitivity
• Raising the number of PCR cycles creates a higher potential of
allele drop-in being detected (increased noise)
• Ideally an improved fluorescent dye could be used to improve
detection sensitivity and thereby permit a lower number of PCR
amplification cycles to be used (peak intensity does not always
correlate with stochastic effect)
High Sensitivity
Energy Transfer
Dye Labeling
Ju et al., Nature Medicine 2, 246 (1996)
Hung et al., Anal. Biochem, 243, 15 (1996)
Berti et al., Anal. Biochem. 292, 188 (2001)
Medintz et al., BioTechniques 32, 270 (2002)
ET dyes (example: LIZ) permit a 10-30X
improvement in signal over non-ET dyes
6FAM
Challenge with Being Able to Go Lower In
DNA Quantitation Measurements
• qPCR enables measurement of lower amounts of DNA
but…
• Going into the low copy number realm introduces new
challenges
– Interpretation of mixtures
– Defining thresholds for different dyes and amplification systems
– Defining the difference between investigative data and reliable
“court-worthy” data
New Interpretation Rules Required for LCN
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AAFS 2006 Workshop (Butler and McCord)
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February 20, 2006
Suggestions to Optimal Results with LCN
• At least two* PCR amplifications from the same DNA
extract
• An allele cannot be scored (considered real) unless it is
present at least twice in replicate samples
• Extremely sterile environment is required for PCR setup
to avoid contamination from laboratory personnel or
other sources
*five is better; results are investigative
LCN Summary
• LCN often defined as <100-200 pg input DNA
• Typically involves increasing the number of PCR cycles
when performing multiplex PCR to amplify DNA with
conventional STR kits (e.g., 34 cycles instead of 28 cycles)
• Enables lower amounts of DNA to be detected with STR
markers but is prone to contamination
• Cautious data interpretation rules must be adopted as
allele drop-out and drop-in may occur due to stochastic
amplification effects
http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/training.htm
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