Tesis - Universidad de Colima

CO
LIM
A
LU
TR
DI
TU
A
AB
ES
AJ
A
DE
A
CH
UNIVERSIDAD DE COLIMA
FACULTAD DE MEDICINA
DOCTORADO EN CIENCIAS FISIOLÓGICAS CON
ESPECIALIDAD EN FISIOLOGÍA
“CORRIENTES DE CALCIO A TRAVÉS DEL CANAL
MUTANTE LEANER EXPRESADO EN UN SISTEMA
HETERÓLOGO”
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
DOCTORA EN CIENCIAS FISIOLÓGICAS
CON ESPECIALIDAD EN FISIOLOGÍA
PRESENTA
Consuelo María Hernández Valdivia
ASESORA
Dra. Esperanza García Martínez
Colima, Col., noviembre del 2005
ÍNDICE
Tablas y figuras………………………………………………………………. i
Abreviaciones…………………………… …………………………………….ii
1
Resumen……............................................................................................. 1
2
Summary….…………………………………………………………………….. 2
3
Introducción…………………………………………………………………… 3
3.1
Canales de calcio…………………………………………….…………. 5
3.2
Clasificación y estructura de los canales de calcio activados
por voltaje………………………………………………………………... 7
3.3
Subunidad auxiliar β……………………………………………………. 11
3.4
Subunidad auxiliar 2………………………………………………….13
3.5
Subunidad auxiliar γ …………………………………………………….
15
3.6
Inactivación de canales iónicos dependientes de voltaje…………... 16
3.7
Mecanismos de inactivación de los canales de calcio ……………... 18
3.7.1 Inactivación dependiente de voltaje…………………………... 18
3.7.2 Inactivación dependiente de calcio…………………………….19
4
Antecedentes inmediatos…………………………………………………… 21
4.1
Modulación de los canales de calcio por proteínas G……………… 22
4.2
Bases estructurales de la modulación por proteínas G……………. 23
4.3
Efecto modulador de la calmodulina sobre la inactivación de
los canales de calcio tipo P/Q…………………………………………. 24
4.4
Ratones con mutaciones en canales de calcio: modelos para
estudiar desórdenes neurológicos en humanos…………………….. 26
5
Justificación…………………………………………………………………… 29
6
Hipótesis………………………………………………………………………. 31
7
Objetivo general……………………………………………………………… 31
7.1
8
Objetivos particulares…………………………………………………... 31
Materiales y métodos………………………………………………………... 32
8.1
Vectores usados………………………………………………………… 32
8.2
Técnicas bacteriológicas………………………………………………. 33
8.2.1 Cultivo y almacenamiento de bacterias E. coli………………. 33
8.2.2 Preparación de las bacterias competentes…………………... 33
8.2.3 Transformación de las bacterias E. coli………………………. 34
8.3
Determinación de la concentración de DNA…………………………. 34
8.4
Aislamiento de DNA por Maxi-prep (QIAGEN)……………………… 35
8.5
Sistema de expresión heteróloga …………………………………….. 36
8.6
Cultivo de células HEK 293……………………………………………. 36
8.7
Transfección de las células HEK 293 mediada por agregados
inorgánicos (fosfato de calcio)…………………………………….
36
8.7.1 Transfección celular……………………………………………. 37
9
8.8
Análisis electrofisiológico………………………………………. ……... 38
8.9
Medios y soluciones……………………………………………. ……... 41
Resultados y discusiones…………………………………………………… 42
9.1
Efecto de la mutación tgla corto sobre la densidad de corriente….. 42
9.2
Caracterización de la dependencia al voltaje de la activación
del tgla corto cuando la corriente acarreadora es Ca+2……….......... 43
9.3
Efectos sobre la cinética de inactivación producida por
el tgla corto………………………………………………………. …….. 45
9.4
Efecto de la mutación tgla corto sobre el grado de inactivación
en función del potencial………………………………………………... 46
9.5
Efecto de la entrada previa de calcio sobre la inactivación de
la corriente en la mutación tgla corto………………………….. ……... 47
9.6
Efecto de la mutación tgla corto sobre la inactivación en estado
estable del canal de calcio tipo P/Q…………………………………... 49
9.7
Efecto de la facilitación en la corriente de calcio mediada por
un prepulso fuertemente despolarizante de muy breve
duración………………………………………………………………... 51
10
Conclusiones…………………………………………………………………. 53
11
Perspectivas……………………………………………………………. …….. 58
11.1
12
Anexo (figuras datos preliminares)…………………………………… 60
Referencias bibliográficas…………………………………………………. 65
ABREVIACIONES
ADN
Ácido desoxirribonucleico
ATP
Trifosfato de adenosina
BID
Dominio de interacción beta
CAM
Calmodulina
CAM4
Calmodulina mutante 4
Ca
+2
Calcio
Cai
Concentración de calcio intracelular
CBD
Sitio de unión constitutiva a calmodulina
CDI
Inactivación dependiente de calcio
cDNA
DNA complementario
Cs+
Cesio
Cl-
Cloro
DMEM
Medio dubelcos modificado
EFH
EF hand
EGTA
Ácido tetraacético de etilen-glicol
E. coli
Escherichia coli
GFP
Proteína verde fluorescente
HEK293
Células embrionarias de riñón de humano
HEPES
2-4-(2-hidroximetil)-1-piperazinaetano ácido sulfónico
hrs
Horas
IFM
Motivo isoleicona-fenilalanina-metionina
IV
Corriente-voltaje
K+
Potasio
L
Litros
LB
Li
+
Medio de Luria Bertani
Litio
M
Molar
min
minutos
ii
mM
Na
+
Milimolar
Sodio
NMG
N-metil-glucamina
ng
Nanogramos
Rb+
Rubidio
RE
Retículo endoplásmico
rpm
Revoluciones por minuto
seg
segundos
SBF
Suero bovino fetal
la
tg corto
leaner corto
tgla largo
leaner largo
TEA
Tetraetilamonio
Tris
Tris-(hidroximetil)-aminometano
UV
Ultravioleta

Alfa

Beta

Delta
l
Microlitros
g
Microgramos
M
Micromolar
iii
TABLAS Y FIGURAS
Tabla 1.
Clasificación de los canales de calcio dependientes de
voltaje……………………………………………………….…………… 8
Figura 1.
Conformación estructural de los canales de calcio dependientes
de voltaje………………………………………………………………. 10
Figura 2.
Topografía transmembrana de mutaciones en la subunidad 1A. 11
Figura 3.
Densidad de corriente de los canales de calcio tipo P/Q en células
HEK293………………………………………………………………….. 43
Figura 4.
Protocolo de pulsos utilizado para obtener la curva IV…………….. 44
Figura 5.
Constantes de inactivación de los canales de calcio tipo P/Q (1A y
tgla corto)…………………………………………………………………. 46
Figura 6.
Grado de inactivación en función del potencial para los canales de
calcio tipo P/Q (tgla corto y 1A)……………………………………. 47
Figura 7.
Consecuencias de la entrada previa de calcio sobre la ICa evocada
por un pulso de prueba posterior a esta…………………………….. 49
Figura 8.
Inactivación en estado estable para el canal de calcio tipo P/Q (1A
y tgla corto)………………………………………………………………. 50
Figura 9.
Evaluación de la facilitación de la ICa por prepulso para el canal
mutante tgla corto y el canal silvestre (1A)…………………………. 52
PERSPECTIVAS ANEXO
Figura 1.
Efecto de la CAM4 sobre la dependencia al voltaje de la
activación……………………………………………………………….. 60
Figura 2.
Efecto de la CAM4 sobre el curso temporal de la inactivación
en función del potencial de membrana………………………………. 61
Figura 3.
En el canal silvestre la sobreexpresión de CAM4 no afecta
el grado de inactivación en función del potencial de membrana….. 62
Figura 4.
En el tgla corto, el porcentaje de inactivación en función del potencial
se modifica con la sobreexpresión de calmodulina mutante………..63
Figura 5.
Inactivación por prepulso: Efectos de la entrada previa de calcio
sobre la inactivación de la ICa en el canal mutante tgla corto……………… 64
i
1
RESUMEN
Los canales de calcio dependientes de voltaje, participan de manera relevante
en la regulación de diversos procesos que dependen de calcio en las células
excitables. La apertura del canal, genera señales eléctricas e incrementos
transitorios en la concentración intracelular de calcio, que contribuyen en el control
de diferentes procesos fisiológicos.
La familia de proteínas que conforman a los canales de calcio tiene una gran
variabilidad genética; para su ensamblaje y funcionamiento adecuados, se requiere
de la asociación de hasta 5 diferentes subunidades (Caterall, 1995). En los últimos
años se han descrito enfermedades, que tienen una estrecha asociación con
mutaciones en los genes que codifican para las subunidades que conforman a los
canales iónicos (Meisler y cols., 2001).
La importancia del presente trabajo de investigación, radicó en tratar de
encontrar las posibles alteraciones electrofisiológicas del canal de calcio tipo P/Q
como consecuencia de cambios en su estructura. Se utilizó la subunidad 1A del
canal de calcio tipo P/Q de humano, al cual se le introdujo la mutación denominada
como leaner corto, que produce una alteración importante en la región carboxilo del
canal, con la consecuente pérdida del sitio de unión constitutiva a calmodulina
(CBD), además de un sitio de unión al complejo β de proteínas G.
Para estudiar las propiedades electrofisiológicas del canal, el cDNA de la
proteína mutada se expresó en células HEK293 y se registraron las corrientes
totales. Los resultados sugieren que la activación dependiente de voltaje no se ve
alterada por la mutación. La cinética de inactivación es más lenta en el canal de
calcio mutado que en el canal silvestre. La inactivación en estado estable no se ve
alterada en el canal truncado. La inactivación dependiente de la entrada previa de
calcio difiere significativamente de la del canal silvestre. La isoforma corta incrementa
la magnitud de corriente cuando la proteína es precedida por prepulsos
despolarizantes. Lo anterior sugiere que las alteraciones fenotípicas observadas en
el animal mutante se ven claramente influenciadas por alteraciones en los
mecanismos que participan en la modulación del canal de calcio tipo P/Q.
1
2
SUMMARY
The voltage gated calcium channels have a relevant participation in the
regulation of diverse processes wich depends on calcium in the excitable cells. The
conformational changes that leads to the opening of these channels are produced by
the depolarization of the membrane. As consequence it generate an electrical signal
and a transitory increases in the intracelular calcium concentration, contributing to the
control of different physiological processes.
The family of proteins that form the calcium channels has a great genetic
variability, since its correct assembly and function needs of the association of 5
subunits that differ in their genetic origin (Caterall, 1995). The previous thing turns out
to be particularly important, since the last years there have been described some
diseases that have a narrow association with the present mutations in the genes that
codify for the subunits of the ionic channels (Meisler and cols., 2001).
To study electrophysiological properties of this channel, the cDNA of the
mutated protein was expressed in HEK293 cells and the total currents were register.
The results suggest that the activation dependent on voltage does not see to
be altered by the mutation. The kinetic of inactivation was slower in the mutated
calcium channel that in the wild channel. The inactivation in steady state does not
become altered in the truncated channel. The inactivation dependent on the previous
entry of calcium differs significantly with regard to the native P/Q calcium channel.
The short isoform increases in a significant way the magnitude of the current when
the protein was preceded for depolarizant prepulses. These results suggests that the
phenotypic alterations observed in the mutant animal meet clearly influenced by the
alterations in the mechanisms that participate in the modulation of the type P/Q
calcium channel.
2
3
INTRODUCCIÓN
En los sistemas biológicos, el Na+, K+, Cl- y Ca+2 son los principales iones
involucrados en la realización de procesos celulares fundamentales. Para atravesar
la membrana celular que es una bicapa hidrofóbica lipídica, estos iones deben ser
transportado a través de: a) poros hidrofílicos denominados canales iónicos, b)
proteínas transportadoras y c) bombas iónicas.
Gran parte de la energía producida por el metabolismo celular se gasta en el
bombeo de iones en contra de su gradiente electroquímico a través de la membrana
celular; este proceso requiere de la participación de bombas iónicas que a diferencia
de los canales iónicos actúan a través de un mecanismo de transporte activo es
decir, requieren de
la energía liberada por la hidrólisis de ATP para generar el
movimiento de los iones. Estos gradientes contribuyen a la generación de señales
eléctricas en las que los canales iónicos tienen una participación importante. Las
señales eléctricas viajan en forma de potenciales de acción por ejemplo, desde una
neurona hasta un sitio determinado donde desencadena otro tipo de señal no
eléctrica como puede ser la liberación de algún neurotransmisor o el inicio de
reacciones químicas en cascadas de señalización intracelular.
Los canales iónicos tienen una función aparentemente simple: permitir de
manera pasiva el flujo de iones a través de la membrana celular, proceso que ha
resultado de una complejidad que va más allá de esta simple descripción. Así, los
canales iónicos son proteínas integrales de membrana que forman poros acuosos
que permiten el paso de iones a favor de su gradiente electroquímico. Algunos
canales son altamente selectivos a una especie iónica en particular y al mismo
tiempo mantienen conductividades altas a esa especie iónica. Así mismo, los canales
iónicos poseen mecanismos que permiten su regulación a través de la apertura y el
cierre del poro conductor. Gran parte de lo que se conoce a la fecha sobre los
canales iónicos, se dedujo de mediciones eléctricas gracias al hecho de que estos
permiten el flujo de iones a través de las membranas biológicas, con un movimiento
iónico a favor del gradiente electroquímico que existe entre ambos lados de la
membrana. La importancia de estas proteínas (que dan lugar a la formación de
canales iónicos) en una gran cantidad de fenómenos celulares, ha sido reconocida
3
en los últimos años, y se sabe que tienen una participación determinante en la
transducción de señales externas en señales internas que permiten a la célula
modular su actividad en función de su medio extracelular, lo que es válido tanto para
células excitables como para las células no excitables. Así, los canales iónicos tienen
participación en fenómenos tan diversos como son: la excitabilidad eléctrica y
química, la secreción, la contracción muscular, la fecundación, las reacciones
inmunes, la diferenciación celular, etc. (Bers, 1991; Artalejo y cols., 1994; Murphy y
cols., 1991). El flujo de iones a través de los canales iónicos ocurre a una velocidad
de más de 106 iones / segundo; característica que permite poder observar la
actividad de una sola molécula a una resolución temporal muy alta, algo único en
biofísica. Esto, junto con el avance en las técnicas de biología molecular que hoy nos
permiten el acceso al uso de la clonación y al empleo de sistemas de expresión
heteróloga de los cDNAs para los canales iónicos de interés, ha hecho posible la
disección a nivel molecular de los dominios estructurales de la proteína que tienen
una relevancia funcional; como son aquellos implicados en la formación del poro
acuoso, en su comportamiento cinético, o en la unión de drogas que modifican su
actividad. Lo anterior ha permitido la exploración y el análisis microscópico de la
relación existente entre la estructura y la función de los canales iónicos.
4
3.1
CANALES DE CALCIO
La concentración libre de calcio (Ca+2) en el citosol de cualquier célula es
extremadamente baja (10-7M), mientras que la concentración en el medio
extracelular
y en el retículo endoplásmico (RE) es considerablemente mayor
(10-3M). Esta diferencia genera un fuerte gradiente de concentración que tiende a
permitir el paso de Ca+2 al citosol a través de ambas membranas. Cuando se activan
las vías que permiten la entrada de calcio al citoplasma, se produce un marcado
incremento de la concentración local de Ca+2 intracelular en un rango aproximado de
0.3-1M (Berridge, 2000).
El flujo de Ca+2 a través de la membrana plasmática está regulado por una
gran familia de canales, los cuales se abren o cierran en respuesta a un estímulo
determinado, el cual puede provenir de la interacción entre la proteína que conforma
el canal y nucleótidos cíclicos, de la unión de neurotransmisores con receptores del
canal o bien de cambios en el potencial eléctrico a través de la membrana.
A los canales de calcio que se activan por el potencial eléctrico, se les ha
denominado como canales de calcio activados por voltaje, los que forman una gran
familia de proteínas de membrana multiméricas que controlan de manera selectiva el
flujo de iones de Ca+2 en respuesta a cambios en el potencial de la membrana.
El Ca+2 es un ión que juega un papel muy importante en los procesos
intracelulares de las células excitables incluyendo a las neuronas. Durante el
desarrollo neuronal, la entrada de este ión a través de los canales de calcio
dependientes de voltaje tiene una participación importante en diversas funciones
como por ejemplo, en el control de la liberación de neurotransmisores, la muerte
neuronal, el crecimiento de las neuritas, en la formación y eliminación de sinápsis, en
la diferenciación fenotípica, además, actúa como segundo mensajero en la expresión
de genes (Desmadryl y cols., 1998; Zwingman y cols., 2001).
El Ca+2 es un
mensajero intracelular por excelencia, que requiere de un control fino en sus niveles
citoplasmáticos para mediar los distintos procesos en que se ve involucrado. Esto
significa que la concentración de Ca+2 debe mantenerse en un rango estrecho del
orden nanomolar (Saris, 2005), ya que este catión puede llegar a ser tóxico para la
5
célula si sus niveles no son controlados de manera precisa. Así, aunado a los
canales de calcio existen otros mecanismos involucrados en la regulación del calcio
intracelular tales como las bombas e intercambiadores que remueven el Ca+2 del
citoplasma una vez que ha cumplido su papel como señalizador, logrando mantener
de esta forma las concentraciones basales del mismo.
6
3.2 CLASIFICACIÓN Y ESTRUCTURA DE LOS CANALES DE
CALCIO ACTIVADOS POR VOLTAJE
De acuerdo a sus propiedades electrofisiológicas y farmacológicas, los
canales de calcio dependientes de voltaje han sido clasificados en cinco tipos
denominados como T, L, N, P/Q y R (ver nueva nomenclatura en Tabla 1). Las
corrientes iónicas acarreadas por los canales antes mencionados se caracterizan por
tener distintos umbrales de activación, por lo que se les distingue básicamente en
dos grupos: los canales de bajo umbral de activación (tipo T), aquellos que se activan
con pulsos de despolarización cercanos al potencial de reposo, y los canales de alto
umbral de activación (tipo L, N y P/Q), los cuales para su activación requieren de
estímulos despolarizantes muy por encima de su potencial de membrana. Estos
canales son complejos hetero-oligoméricos los cuales se activan tras la
despolarización de la membrana celular. La expresión y funcionamiento adecuados
de los canales de Ca+2 requieren del ensamblaje de la subunidad 1 (que es la
encargada de formar el poro de selectividad iónica), y de las subunidades accesorias
, 2 y  que están implicadas en la regulación del canal (Klugbauer y cols., 1999).
El primer canal de calcio activado por voltaje fue purificado y clonado de
túbulos transversos de músculo esquelético (Curtis y Catterall 1986; Tanabe y cols.,
1987). Desde entonces, se han identificado siete genes que codifican para la
subunidad alfa que conforma el poro de los canales de alto umbral de activación
(Hofmann y cols. 1999) y tres genes para los canales de bajo umbral (Lee y cols.,
1999). Si bien inicialmente las subunidades identificadas se nombraban según el
tejido de procedencia, recientemente se ha adoptado una nueva nomenclatura en
base a las características que comparten (ver la Tabla 1).
7
Tabla 1.- Clasificación de los canales de calcio dependientes de voltaje: conductancia
unitaria, agonistas, bloqueadores, características cinéticas de la corriente, nomenclatura,
distribución celular (Modificada de Catterall, 2000)
La subunidad 1 tiene un peso molecular de 190-250 kDa y es la estructura
fundamental de los canales de calcio activados por voltaje. Está conformada por
cuatro dominios transmembrana homólogos (I-IV) cada uno de ellos conformado por
6 alfa hélices transmembrana (S1-S6) circundantes a un poro central (Tanabe y cols.,
1987) (figura 1 A). Los extremos amino y carboxilo de la subunidad 1 se encuentran
localizados intracelularmente. Los segmentos S4 de cada uno de los dominios
poseen elementos estructurales específicos que incluyen residuos de aminoácidos
cargados positivamente (lisina y arginina), los que también han sido reportados en
los canales de Na+ y K+ dependientes de voltaje. Dichos aminoácidos forman el
sensor de voltaje, el cual sufre un cambio conformacional en respuesta a una señal
despolarizante (figura 1 A), del tal modo que este cambio puede acoplarse a la
apertura del poro del canal. Por analogía con algunos canales de K+, se ha sugerido
que la boca externa del poro esta dada por la invaginación que ocurre en el “asa” del
poro, entre los segmentos 5 y 6 transmembrana (figura 1 A). Además, el “asa” del
poro posee residuos de glutamato (o aspartato en algunos canales de bajo umbral de
activación), los cuales dan lugar al filtro de selectividad del canal. Se cree que los
residuos de glutamato se coordinan con el Ca+2 durante su paso a través del poro
8
(Ellinor y cols., 1995) y por otro, lado proveen el mecanismo que permite el bloqueo
del canal por metales pesados tales como el Cd+2 y el Co+2, los cuales se asocian
fuertemente con los sitios de unión para Ca+2 dentro del poro.
La subunidad 1 en su región intracelular tiene secuencias altamente
conservadas que le permiten la interacción con proteínas. Así, entre los dominios I y
II se encuentra un sitio de unión específica a la subunidad  denominado dominio de
interacción alfa (AID) (figura 1 B). Un segmento entre el “asa” I y II de los canales tipo
no L une el complejo  de proteínas G (De Waard y cols., 1997; Zamponi y Snutch,
1998). En tanto, la región carboxilo posee sitios que median la inactivación de
canales tanto L como no L a través del complejo Ca+2/Calmodulina (Lee y cols.,
1999; Zühlke y cols., 1999).
9
Figura 1. En el apartado A se muestra la conformación estructural de la subunidad
1 de los canales de calcio dependientes de voltaje. Mientras que en apartado B, se
representa la composición multimérica de los canales de calcio dependientes de
voltaje resultado de la asociación de las distintas subunidades que los conforman;
además se señalan algunos de sus determinantes moleculares (ver texto para
detalle).
10
3.3
SUBUNIDAD AUXILIAR β
Debido a que la subunidad ß no forma parte de la proteína que conforma el poro del
canal, se le ha denominado como subunidad accesoria o auxiliar. La primer
subunidad de este tipo con un peso molecular de 58 kDa se clonó del músculo
esquelético (Tanabe y cols., 1987). No posee segmentos transmembrana (figura 1
B). La estructura de su dominio se asemeja grandemente al dominio SH3 que une
regiones ricas en prolinas, lo que refuerza la idea de que la subunidad ß también
sirve como sitio de anclaje de la subunidad α1 a otras proteínas (Miller, 1992; Zong,
1994). A la fecha, se han identificado 4 genes no alélicos para esta subunidad
(Castellano y Pérez-Reyes, 1993), además de diversas variantes derivadas de
procesamiento alternativo. Estas proteínas y sus formas alternas se expresan de
manera específica en diferentes tejidos. La nomenclatura (con su distribución mas
prevalente entre paréntesis) es ß1A (músculo esquelético), ß1B (cerebro), ß2 (corazón,
pulmón, cerebro), ß3 (cerebro, músculo liso) y ß4 (cerebro, particularmente en cerebelo).
Como se mencionó anteriormente, las subunidades ß se unen a la subunidad α1
mediante una secuencia específica del "asa” intracelular entre los dominios I y II de
esta última, al que se le ha denominado como AID (Pragnell y cols., 1994) (figura 1
B). Mientras que el dominio correspondiente en la subunidad ß se ha determinado
como el dominio de interacción ß (BID) (figura 1 B). En el ratón letárgico, existe una
mutación en la subunidad ß4 antes del BID, lo que da como resultado una forma
truncada de RNA mensajero, con la consecuente pérdida funcional de la proteína.
Esta alteración estructural es la responsable de los daños neurológicos expresados
en este mutante, que incluyen la ausencia de epilepsia y presencia de ataxia
(Burgess y cols., 1997). Las subunidades ß juegan distintos roles, principalmente son
importantes para la expresión membranal de las subunidades α1 (Brice y cols.,
1997). En algunos casos, las subunidades ß pueden sufrir una especie de
"reorganización” con el fin de compensar la sobre expresión o la ausencia de una de
las otras subunidades. Esto se observa con la subunidad ß4, donde la forma
truncada de la proteína causa el daño neurológico observado en el ratón letárgico.
Sin embargo, la perdida del gen que codifica para la subunidad ß1 en ratones “knock
out” conduce a la muerte en el nacimiento (Gregg y cols., 1993). De manera
11
secundaria, las subunidades β ejercen diversos efectos sobre las propiedades
biofísicas de las subunidades α1, que son específicos para cada una de las
diferentes subunidades ß.
12
3.4
SUBUNIDAD AUXILIAR α2-δ
La familia de subunidades 2consiste de tres genes. La primer subunidad
identificada fue extraída del músculo esquelético de conejo y se le denominó 21
(Ellis y cols., 1988). Existen otras cinco subunidades 2-1 generadas por expresión
alternativa (Angelotti y Hofmann, 1996) pero su importancia funcional aún no ha sido
establecida. Dos nuevos miembros de esta familia de subunidades se identificaron
posteriormente en seres humanos y en ratones a las que se les llamó 2y
2respectivamente
(Klugbauer y cols., 1999); estas nuevas subunidades
mantienen una homología del 56 y 30% con la subunidad 2-1, respectivamente.
Una mutación
en la subunidad α2-δ2 es la responsable del daño neurológico
manifestado como ataxia en un ratón con mutación espontánea denominado “ducky”
(Barclay y cols., 2001).
Las 3 subunidades 2 tienen perfiles hidrofóbicos similares y contienen
varios sitios potenciales de N-glicosilación. La subunidad 2-1 está conformada por
2 proteínas, la 2 altamente glicosilada localizada extracelularmente y una pequeña
proteína que permite el anclaje de la 2 a la membrana celular (Brickley y cols.,
1995; Wiser y cols., 1996). Las dos proteínas auxiliares α2 y δ son producto del
mismo gen y se originan por un corte proteolítico post-traduccional (De Jongh y cols.,
1990) (figura 1 B). Las subunidades 2 y  se asocian mediante puentes disulfuro
que se forman entre los numerosos residuos de cisteínas que se localizan en ambas
proteínas (figura 1B). Si bien, la subunidad 2 posee 2 dominios hidrofóbicos, se
piensa que esta subunidad se encuentra localizada extracelularmente y se une a la
subunidad transmembrana δ mediante puentes disulfuro (Brickley y cols., 1995).
Los efectos de la subunidad 2-1 sobre las propiedades biofísicas de las
subunidades 1 dependen del sistema de expresión y de las subunidades utilizadas.
Aunque invariablemente estas incrementan la densidad de corriente a través de los
canales de calcio al aumentar la cantidad de canales funcionales en la superficie
celular. Además, se ha reportado que altera de manera alostérica la activación e
inactivación de diversas subunidades 1 (Singer y cols., 1991; Bangalore y cols.;
1996, Felix y cols., 1997; Klugbauer y cols., 1999). Se sabe también que la
13
subunidad 2-1 incrementa la unión de dihidropiridinas a los canales de calcio tipo L
y de -conotoxina a los tipo N (Félix y cols., 1997; Brust y cols., 1993). Por otro lado,
se ha visto que la coexpresión de las subunidad 2-1 con la 2a muestra que estas
dos subunidades auxiliares tienen un efecto cooperativo sobre la expresión de los
canales Cav1.2
a nivel membranal, lo que se traduce en un incremento de la
densidad de corriente (Yamaguchi y cols., 2000).
14
3.5
SUBUNIDAD AUXILIAR γ
La primera secuencia que se dedujo a partir del músculo esquelético indica
que la subunidad γ1 es una proteína de 25 kDa con cuatro dominios transmembrana
característicos (Jay y cols., 1990) (figura 1B). La función de esta subunidad en los
canales de calcio del músculo esquelético aún no se determina completamente;
aunque se sabe que en estos modula el pico de corriente además de las cinéticas de
activación e inactivación de la subunidad alfa 1 (Singer y cols., 1991; Eberst y cols.,
1997). Posteriormente se encontró que ratones que manifiestan ausencia de
epilepsia (fenotipo stargazer) poseen un gen homologo en los que se genera la
inserción de un transposón y da lugar a la subunidad denominada como γ2 (Letts y
cols., 1998). Este nuevo miembro de la familia de subunidades γ se clonó de tejido
cerebral y si bien, puede producirse cierta cantidad de RNA mensajero funcional, la
inserción del transposón causa considerables aberraciones fenotípicas. Además de
la subunidad γ2, recientemente han sido identificadas otras 3 subunidades (γ3- γ5) en
ratones (Klugbauer y cols., 2000). Las subunidades γ3 y γ4 solamente han sido
encontradas en cerebro, mientras que la γ5 es expresada en riñón, músculo
esquelético, hígado y pulmón (Klugbauer y cols., 2000). La homología de la
subunidad γ1 con el resto de las subunidades es muy baja, compartiendo solo el 25%
de identidad con la γ2.
Finalmente, es importante resaltar que en su conjunto las subunidades
accesorias , 2 y  modulan las cinéticas de activación e inactivación, la densidad
de expresión, la dependencia del voltaje y las propiedades farmacológicas de la
subunidad 1 del canal de calcio (Hofmann y cols., 1999).
15
3.6 INACTIVACIÓN DE CANALES IÓNICOS DEPENDIENTES DE
VOLTAJE
Desde el punto de vista funcional, la inactivación es un proceso común y
crítico en muchos tipos de canales iónicos dependientes de voltaje. Un ejemplo claro
es el canal de sodio dependiente de voltaje, donde la inactivación rápida determina la
duración del potencial de acción y el período refractario en tejidos excitables;
mientras que la remoción de la inactivación del canal rompe el gradiente iónico
conduciendo a la perdida de la excitabilidad.
A la fecha, se sabe poco sobre el proceso de inactivación de los canales de
Ca+2 dependientes de voltaje (Stotz y Zamponi, 2001). Sin embargo, el proceso de
inactivación de los canales de Na+ y K+ cuyas estructuras moleculares se asemejan a
la de los canales de calcio dependientes de voltaje, se encuentra mejor descrito. Así,
el proceso de inactivación de los canales de Na+ y K+ puede servir como punto de
partida para tratar de correlacionar de manera indirecta el o los mecanismos de
inactivación presentes en los canales de Ca+2
Tanto los canales de Na+ como los de K+, presentan dos procesos diferentes
de inactivación denominados como inactivación rápida e inactivación lenta, que son
mediados por diferentes componentes de la subunidad  del canal. Estos
mecanismos son procesos independientes, ya que la remoción de la inactivación
rápida, no elimina la inactivación lenta; por ejemplo, la inactivación rápida se elimina
mediante el tratamiento enzimático intracelular (Rojas y Amstrong, 1971) y por
mutaciones en el “asa” citoplasmático que une al tercer y cuarto dominios de la
proteína que conforma el canal (Stühmer y cols., 1989; Patton y cols., 1992; West y
cols., 1992); sin embargo, estos tratamientos no ejercen ningún efecto sobre la
inactivación lenta.
El mecanismo para el proceso de inactivación rápida en los canales de
potasio, se describió en el canal de potasio tipo shaker, de acuerdo a un modelo de
bola y cadena (Hoshi y cols, 1990). En este modelo, un segmento de
aproximadamente 20 aminoácidos situado en la región amino terminal de cada
dominio, es potencialmente capaz de ocluir físicamente el poro del canal en su región
citoplasmática.
16
La inactivación rápida de los canales de Na+ se asocia a un mecanismo
cualitativamente similar; sin embargo, en estos canales la estructura de inactivación
no está asociada a la región amino terminal, sino al “linker” III y IV donde se ha
demostrado que existe una región hidrofóbica de 3 aminoácidos (isoleucina [I],
fenilalanina [F] y metionina [M]) denominada como motivo IFM. Es decir; la oclusión
física del poro en los canales de Na+ durante la inactivación, está mediada por la
unión del motivo IFM a un sitio de acoplamiento localizado en la subunidad  del
canal. En este sentido, el linker III y IV funciona como una especie de tapadera que
cuando se acopla a la región del poro es capaz de impedir el flujo de corriente (West
y cols., 1992).
La inactivación lenta es un proceso que parece estar asociado a la obstrucción
de la boca externa del poro del canal. Esto es, que el poro es capaz de controlar la
selectividad del filtro por si mismo, contribuyendo de alguna manera en la cinética
característica de la inactivación lenta. Sin embargo, los mecanismos moleculares que
controlan este tipo de inactivación distan mucho de estar claramente descifrados.
Para los canales de potasio, se sugiere que durante esta inactivación, el poro
sufre un estrechamiento debido a un rearreglo estructural. El tetraetilamonio (TEA) es
capaz de reducir dramáticamente la inactivación lenta cuando se aplica
extracelularmente, como si ésta no pudiese ocurrir mientras el TEA se mantiene
unido a la boca externa del poro. Por otro lado, los iones extracelulares juegan un
papel importante. Así, la presencia de iones permeables como el K+ y el Rb+,
reducen de manera importante la inactivación lenta, como si su presencia en el filtro
de selectividad previniera de alguna forma el estrechamiento del poro. De manera
notable, en ausencia de estos iones en el medio extracelular, el canal de potasio en
el estado de inactivación lenta es permeable al sodio. Lo que ha llevado a sugerir
que el reacomodo de la parte más externa del filtro de selectividad, conduce a un
estrechamiento y no a un colapso del poro durante la inactivación (Jerng, 1999).
Por otro lado, en los canales de Na+, la inactivación lenta parece ocurrir de
manera similar. Además, la presencia de iones como el Na+, Li+, K+, Rb+ y Cs+, son
capaces de modificar la cinética de la inactivación lenta en los canales de Na+
(Townsend y Horn, 1999).
17
3.7 MECANISMOS DE INACTIVACIÓN EN LOS CANALES DE
CALCIO.
Contrariamente a los canales de Na+ y K+, se sabe poco de las estructuras
moleculares que intervienen en los procesos de inactivación de los canales de calcio.
A través de la evolución, los canales de calcio han desarrollado varios mecanismos
de inactivación para controlar el flujo de Ca+2 al interior celular. A la fecha, se han
descrito tres tipos de inactivación: inactivación rápida dependiente de voltaje (Zhang
y cols., 1994), inactivación dependiente de Ca+2 (Peterson y cols., 1999) e
inactivación lenta dependiente de voltaje (Sokolov y cols., 2000).
En sistemas de expresión heteróloga, las subunidades 1 de los canales de
Ca+2 no requieren de subunidades auxiliares para presentar una inactivación
dependiente de voltaje, lo que sugiere que la inactivación es un proceso intrínseco de
la subunidad 1 (Nargeot, 1992).
3.7.1
INACTIVACIÓN DEPENDIENTE DE VOLTAJE
El primer trabajo dirigido a la identificación de los elementos estructurales de
la subunidad 1 que participan en este proceso de inactivación dependiente de
voltaje fue reportado por el grupo de Tsien en 1994. Usando canales de calcio
quiméricos que combinaban características estructurales de distintas subunidades,
mostraron que las diferencias en las cinéticas de inactivación observadas, se debían
exclusivamente a la región S6 del dominio I tansmembranal. Sin embargo,
posteriormente se demostró que algunas mutaciones puntuales en distintas
secuencias de la subunidad 1, tales como la región carboxilo, el “linker” entre el
dominio I-II, el “linker” entre el dominio III y IV además de los segmentos S6
transmembrana, pueden afectar dramáticamente la cinética de inactivación. Lo
anterior, llevó al empleo de otras estructuras quiméricas utilizando canales
filogenéticamente
más
distantes
con
comportamientos
cinéticos
diferentes,
lográndose encontrar que los cuatro dominios transmembrana contribuyen a la
dependencia del voltaje de la inactivación.
18
3.7.2
INACTIVACIÓN DEPENDIENTE DE CALCIO
Las primeras evidencias de la existencia de un mecanismo de inactivación
dependiente de calcio (CDI), surgieron de un estudio realizado por Brehm y Eckert en
1978 al encontrar que la cinética de inactivación en canales de Ca+2 (de
Paramecium) era mucho más rápida en presencia de Ca+2 que la observada cuando
perfundían soluciones con Ba+2. Adicionalmente, también encontraron que diversos
amortiguadores de calcio tenían como efecto una reducción en la inactivación del
canal.
Los canales de calcio dependientes de voltaje representan una de las vías
más importantes de influjo de Ca+2 y
la CDI representa un mecanismo muy
importante de retroalimentación negativa que permite al Ca+2 autorestringir su
entrada al interior celular.
Se han propuesto distintos mecanismos para explicar la CDI como son: los
procesos de desfosforilación, así como la participación de proteínas de unión a Ca+2.
Si se toma en cuenta que la CDI es un proceso rápido, entonces resulta lógico
pensar que la defosforilación y la producción de segundos mensajeros no constituyen
el mecanismo primario que inicia la inactivación mediada por calcio. De tal modo que,
los esfuerzos para tratar de descifrar este mecanismo, se han centrado en el papel
que juegan las proteínas que unen calcio y que tienen la capacidad de unirse al
canal. Así, en 1995 se encontró que los canales tipo L poseen determinantes
estructurales importantes para la CDI en la región proximal del extremo carboxilo, a
la cual se le denominó como región de inactivación por Ca+2 (CI). La región CI
contiene un motivo de unión a Ca+2 denominado con EF hand (EFH), el cual fue
propuesto como el sensor de Ca+2 para la CDI (De León y cols, 1995). Sin embargo,
estudios posteriores donde se eliminaron de manera selectiva regiones del extremo
carboxilo del canal tipo L permitieron identificar dos grupos de aminoácidos
necesarios para la CDI. (Zühlke y cols.,1998). Una de estas regiones es el motivo de
unión a calmodulina denominado como IQ, lo que dejaba abierta la posibilidad de
que la calmodulina pudiese estar participando en el mecanismo de inactivación por
19
calcio. Así, en los últimos años y gracias al empleo de sistemas de expresión
heteróloga, diversos grupos han demostrado que la calmodulina actúa como el
sensor de Ca+2 en la CDI (Lee y cols., 1999; Peterson y cols., 1999; Zühlke y cols.,
1999).
20
4
ANTECEDENTES INMEDIATOS
Durante muchos años las enfermedades neurológicas hereditarias fueron
reconocidas como errores congénitos asociadas al metabolismo. Sin embargo, en los
últimos años gracias al avance técnico y científico se ha reconocido la presencia de
mutaciones en diversas proteínas como son: receptores membranales, proteínas
presentes en el citoesqueleto y recientemente en proteínas de transporte,
particularmente en los canales iónicos que dan origen a la manifestación de diversas
enfermedades (Lehmann-Horn y Jurkat-Rott, 1999).
Como se mencionó al principio del presente trabajo, los canales de Ca+2
activados por voltaje proveen un vínculo de suma importancia entre las señales
eléctricas en la membrana plasmática y una diversidad de procesos intracelulares
que requieren del ión Ca+2 como segundo mensajero (como la liberación de
neurotransmisores), o bien aquellos procesos cuya modulación requiere de vías de
señalización intracelular dependientes de Ca+2 (como la expresión génica).
Recientemente se han identificado mutaciones en el gen que codifica para la síntesis
de la subunidad 1a del canal de calcio tipo P/Q, que tienen una íntima relación con
algunas alteraciones neurológicas hereditarias en seres humanos, como son : la
ataxia cerebelar tipo 6, la migraña hemipléjica familiar y la ataxia episódica tipo 2
(Zhuchenko, 1997; Ophoff, 1998).
El flujo iónico a través de los canales de calcio activados por voltaje da la pauta
inicial para el desencadenamiento de múltiples y diversos mecanismos de
señalización intracelular, por lo que la regulación del curso temporal y la distribución
subcelular de dicho flujo iónico como respuesta a una despolarización tiene una
influencia directa sobre aspectos importantes de la fisiología neuronal.
La subunidad 1a constituye a los canales de calcio tipo P/Q de alto umbral de
activación, y se localiza principalmente en las prolongaciones dendríticas y en el
soma de las células de Purkinje, así como en las terminales sinápticas de las células
granulares (Westenbroek y cols., 1995). La distribución subcelular, así como las
consecuencias funcionales de su interacción con proteínas de la membrana
presináptica, indican que estos canales desempeñan una función importante en la
regulación de la eficiencia sináptica de estos tipos celulares (Sutton y cols., 1999).
21
4.1 MODULACIÓN
PROTEÍNAS G
DE
LOS
CANALES
DE
CALCIO
POR
Algunos estudios utilizando la técnica de “patch clamp” en la configuración de
célula completa (Hamill y cols., 1981), han demostrado que la activación de
receptores acoplados a la vía de transducción de señales mediada por proteínas G,
ejerce un efecto inhibitorio sobre los canales de calcio tipo N y P/Q (Colecraft, 2001).
Lo anterior se refleja en una reducción en la amplitud de la corriente al pico,
acompañada por una disminución en las constantes de activación e inactivación de
estos canales. Por otro lado, se ha observado que esta inhibición tiene un efecto
marcado a voltajes hiperpolarizantes, lo que implica que el grado de inhibición
depende en gran medida del potencial de membrana. Esta inhibición se manifiesta
como un desplazamiento hacia la derecha en la curva de inactivación del canal, lo
que indica que en presencia de proteínas G, los canales ven reducida su
probabilidad de apertura ante determinado potencial de la membrana. Así, esta
dependencia al voltaje da como consecuencia una desestabilización de la proteína G
cuando la conformación del canal se encuentra en estados despolarizados, de tal
forma que el efecto inhibidor producido por la proteína G desaparece mediante la
aplicación de pulsos despolarizantes de gran amplitud (prepulsos antes del pulso de
prueba) a lo que se le ha dado el término de facilitación. El efecto producido por la
facilitación ya sea como algunos autores lo han sugerido, por un cambio
conformacional que no implica la desunión total de la proteína G del canal (Kasai,
1989), o bien, por una disociación física completa que expone al canal a una
reasociación con la proteína G (Hille, 1994) genera la posibilidad de estudiar cual es
el efecto modulador por proteínas G en los canales de calcio (Zamponi y Snutch,
1998).
Estudios previos han mostrado que la activación de receptores acoplados a la
vía de transducción mediada por proteínas G inhibe los canales de calcio tipo N y
P/Q en neuronas centrales (Currie, 1997). La interacción del heterodímero G con la
región citoplásmica entre el dominio I y II del canal de calcio cambia el modo de
activación, generando una población de canales “refractarios”. En consecuencia, la
corriente macroscópica disminuye, la constante de tiempo de activación de las
22
corrientes aumenta, y ocurre un cambio positivo en la dependencia al voltaje de la
activación (Bean, 1989; Mintz y Bean, 1993). Los canales refractarios pueden
cambiar de nuevo al modo “disponible” de activación si se aplican pulsos
despolarizantes de gran amplitud, a lo cual se ha denominado facilitación. AsÍ, la
magnitud y la cinética de la facilitación producida por despolarizaciones sostenidas, o
por pulsos relativamente breves a potenciales muy positivos (+100 a +150 mV) se
considera un criterio para explorar la modulación de la corriente de calcio por
proteínas G (Zamponi y Snutch, 1998).
4.2 BASES ESTRUCTURALES
PROTEÍNAS G
DE
LA
MODULACIÓN
POR
Las primeras evidencias encaminadas a mostrar cuales son los determinantes
estructurales para la modulación por proteínas G surgieron del empleo de canales
quiméricos (Cav2.2 y Cav2.1) (Zhang y cols., 1996). A partir de este trabajo diversos
estudios han sugerido la participación de varios determinantes estructurales para la
interacción de proteínas G con el canal de calcio, que implican la participación de la
región carboxilo terminal; una región de 38 aminoácidos a la que se une el complejo
G (Qin y cols., 1997), y otra de 19 aminoácidos, cercana al segmento
transmembranal S6 del dominio IV, a la que se une la subunidad G (Furukawa y
cols., 1998). Resulta interesante resaltar
que uno de los dos sitios de unión a
proteínas G en el lazo citoplasmático entre los dominios I y II se superpone con el
sitio de interacción de la subunidad ß con el canal, lo que es consistente con la
evidencia de que las subunidades ß regulan la acción por proteínas G en canales de
calcio (Bouring y cols., 1996, Fitzgerald y cols., 1995; Dolphin y cols., 2003 y Doering
y cols., 2004).
23
4.3 EFECTO MODULADOR DE LA CALMODULINA SOBRE LA
INACTIVACIÓN DE LOS CANALES DE CALCIO TIPO P/Q
La calmodulina (CAM) es una proteína ubicua moduladora del calcio
intracelular que desempeña un papel fundamental en la regulación de una gran
variedad de procesos biológicos. También posee una función importante en la
diferenciación neuronal; participa en la regulación de numerosas proteínas, entre las
que se incluyen algunas protein- quinasas, tales como la quinasa CaM de tipo II,
algunas formas de adenilato ciclasa, la fosfodiesterasa de adenosina monofosfato
cíclico y fosfolipasas de membrana, tales como la fosfolipasa C (que hidroliza a
fosfatidilinositol 4,5-bifosfato [PIP2]) y fosfolipasa A2. La CAM es una pequeña
proteína (15 kD) de aproximadamente 148 aminoácidos que se encuentra en el
citosol de la mayoría de las células eucariotas. En concentraciones basales, el calcio
tiene una baja afinidad por la CAM pero a medida que la concentración de calcio
aumenta, se ocupan los cuatro sitios de unión que posee para este ión y se activa la
CAM. La variación en las afinidades de las proteínas por CAM permite que, al
aumentar la concentración de calcio, dichas proteínas se afecten de forma diferente.
Los mecanismos que subyacen a la inactivación dependiente de calcio en los
canales de calcio tipo L son los mejor documentados a la fecha (Neely y cols., 1994;
Imredy y cols., 1994; Catterall y cols., 2000), no así para los canales de calcio tipo
P/Q. Sin embargo, recientemente utilizando técnicas de doble híbrido en levadura y
de inmunoprecipitación, se ha identificado un nuevo sitio de unión a CAM que se
encuentra localizado en la región carboxilo terminal de la subunidad 1 del canal
Cav2.1 (Lee y cols., 1999). Este dominio de unión a calmodulina (CBD) está
localizado en la porción carboxilo terminal de la subunidad 1 2.1 que es homóloga a
la secuencia del dominio IQ de los canales Cav1.2 (Kraus y cols., 1998). Este
dominio está involucrado en la inactivación de la corriente de calcio, pero también
forma parte del mecanismo de facilitación a largo plazo (Lee y cols, 1999).
Aparentemente, la calmodulina se puede unir a esta región del canal cuando la
concentración de calcio intracelular es baja; y por otro lado, en respuesta a la
24
estimulación con trenes de pulsos, lo cual genera la acumulación de calcio en el
citoplasma; esta proteína regula el curso temporal de la recuperación de la
inactivación. Este mecanismo de regulación por calmodulina parece determinar la
disponibilidad de canales funcionales en función de la concentración de calcio y de la
frecuencia con la que se despolariza la membrana (Lee y cols, 1999).
25
4.4 RATONES CON MUTACIONES EN CANALES DE CALCIO:
MODELOS PARA ESTUDIAR DESÓRDENES NEUROLÓGICOS EN
HUMANOS
A principios de los años sesenta,
Sidman y Green (1965) sugirieron que
algunas enfermedades de tipo neurológico podrían explicarse por la existencia de
posibles mutaciones en los canales iónicos. Años después, en 1996, el grupo de
Fletcher identificó en los ratones tottering y leaner la primera mutación en canales de
calcio. Recientemente, varios estudios a nivel de genética molecular han evidenciado
que diferentes enfermedades en humanos están claramente asociadas a mutaciones
en diversos canales iónicos. A esta disfuncionalidad en los canales iónicos se le ha
denominado con el término de canalopatías, asociadas en su mayoría a cambios en
el flujo de iones de Na+, K+ y Ca+2 en diversos tipos de células. En seres humanos,
las canalopatías conducen a diversas enfermedades tales como la ataxia, la migraña,
algunas epilepsias y otros desórdenes neuromusculares.
Se han identificado algunos ratones que muestran mutaciones espontáneas
llamados: tottering y leaner (Fletcher y cols., 1996; Doyle y cols., 1997), rolling
nagoya (Mori y cols., 2000), stargarzer (Letts y cols., 1998), lethargic (McEnery y
cols., 1998), rocker (Zwingman y cols., 2001), y ducky (Barclay y cols., 2001). Los
primeros tres tipos de ratones mutantes poseen variantes alélicas, presentando
mutaciones en el cromosoma 8, en el locus asociado al gen Cacnal1a que codifica
para la subunidad 1 del canal de calcio tipo P/Q (ver figura 2)
26
Figura 2.- Topografía transmembrana de mutaciones en la subunidad 1A.
Donde: tg=tottering, tgla= leaner, rkr= rocker, rol= rolling nagoya; P=prolina,
L=leucina, R=arginina, G=glicina, T=Treonina, K=lisina (Adaptado de Fletcher y cols.,
1996).
Además de los ratones con mutaciones espontáneas, se han generado varios
ratones transgénicos mediante “knocking out” o mediante la sobre-expresión de
subunidades específicas de canales de calcio (Muth y cols., 2001). Los fenotipos
causados por las mutaciones en la subunidad 1A de los canales de calcio,
muestran diversos grados de severidad quizá como consecuencia del sitio en que se
presente la mutación.
Algunos estudios han asociado a la mutación en la subunidad 1A del canal
de calcio tipo P/Q con tres alteraciones neurológicas en humanos: la migraña
hemipléjica familiar, la ataxia episodica tipo 2 y la ataxia espinocerebelar tipo 6
(Ophoff y cols., 1998). Así, tanto la ataxia espinocerebelar tipo 6 como el ratón leaner
ven interrumpida la secuencia intracelular de la región caboxilo terminal (Fletcher y
cols., 1996; Zhuchenko y cols., 1997); lo que da como resultado una severa
degeneración cerebelar (Herrup, 1982; Heckroth 1994; Herrup 1997).
Por otro lado, las mutaciones asociadas a la migraña hemipléjica familiar, la
ataxia episódica tipo 2 y la mutación leaner alteran la región donde se localiza la
región del poro del canal (Fletcher y cols., 1996; Ophoff y cols., 1996) lo que se
27
refleja en daño neurológico sin sufrir grandes cambios en la morfología cerebelar
(Heckroth, 1994).
A continuación se enlistan algunas evidencias de paralelismo genotípico y
fenotípico de las patologías ligadas a canales de calcio tipo P/Q entre ratones y seres
humanos (Hess, 1996).
1) La secuencia de aminoácidos de la subunidad 1A del canal de calcio sensible a
voltaje de ratón presenta un 94% de identidad con la proteína correspondiente en
seres humanos.
2) El nivel de expresión del RNAm de la subunidad 1A en cerebelo es elevada, lo
cual coincide con el patrón de degeneración neuronal asociado con la
manifestación fenotípica de ataxia.
3) La localización cromosómica de la mutación tottering y leaner es una región
sinténica con el segmento del cromosoma humano 19p13, en el cual se han
localizado las mutaciones correspondientes a la migraña hemipléjica familiar y la
ataxia episódica tipo 2.
4) La ataxia y la atrofia cerebelar progresiva en los ratones mutantes son
comparables a los síntomas descritos en individuos con migraña hemipléjica
familiar, ataxia episódica tipo 2 y ataxia cerebelar tipo 6.
Las similitudes genotípicas y fenotípicas entre las enfermedades neurológicas
y los ratones mutantes,
sugieren que los canales de calcio originados por las
mutaciones leaner y tottering son un excelente modelo para tratar de elucidar la
relación existente entre los cambios estructurales y la función del canal.
28
5
JUSTIFICACIÓN
Durante la última década, diversas mutaciones en los genes que codifican
para distintos canales iónicos han sido asociadas a enfermedades neurológicas
hereditarias en seres humanos. De manera simultánea, también se han descrito
mutaciones en los genes que codifican para proteínas similares pero en roedores, lo
que los coloca como modelos ideales para tratar de establecer la relación entre la
mutación y el fenotipo observado. Así, diversas alteraciones genéticas que ocurren
de manera espontánea en ratones que presentan epilepsia de ausencia y ataxia
cerebelar, se asocian a mutaciones en canales de calcio. Los ratones; tottering,
rocker, rolling Nagoya y leaner presentan mutaciones en la subunidad 1 del canal
de calcio tipo P/Q, que en neuronas cerebelares tiene un alto nivel de expresión; de
tal modo que las posibles alteraciones en las propiedades biofísicas del canal
mutado, pueden ser un factor importante de correlación con el daño neuronal
observado en el animal mutante (Mori, 2000).
Lo anterior resulta de suma
importancia, ya que en seres humanos algunas alteraciones neurológicas de tipo
hereditario como son la migraña hemipléjica familiar, la ataxia episódica tipo 2 y la
ataxia espinocerebelar tipo 6 están también asociadas a mutaciones en el gen que
codifica para el canal tipo P/Q (Fletcher y cols, 1996; Ophoff y cols, 1998).
Para establecer de manera fidedigna cómo las mutaciones afectan la actividad
del canal y desencadenan la enfermedad, es necesario estudiar su efecto en un
contexto fisiológico. Sin embargo, el estudio biofísico de las mutaciones in vitro,
permiten detallar los mecanismos básicos que se ven alterados en la función del
canal en un intento por tratar de comprender cómo estas alteraciones podrían
conducir a la enfermedad.
Así, mediante este trabajo se pretende analizar los efectos funcionales
producidos por la mutación leaner en el canal de calcio tipo P/Q, utilizando un
sistema de expresión heteróloga.
Como consecuencia de la mutación leaner, se producen dos isoformas de
RNA mensajero diferentes con alteraciones en la secuencia del extremo carboxilo:
una forma larga (tgla largo) que incluye el segundo intrón (una secuencia
normalmente no transcrita) y una forma corta (tgla corto) que pierde la secuencia del
29
segundo exón (Fletcher y cols., 1996). Si bien, la mutación afecta la región carboxilo
del canal de calcio tipo P/Q donde se encuentran las secuencias que tienen que ver
con la modulación del mismo, el interés del presente trabajo de tesis se centró en la
isoforma corta ya que es la que pierde el dominio CBD dejando intacto el motivo IQ.
Así, la mutación leaner nos sirvió como modelo para tratar de establecer cuál es la
posible contribución a nivel molecular del dominio IQ en la actividad eléctrica del
canal. Para esto, usamos el cDNA de la subunidad 1A de humano a la que
mediante mutagénesis dirigida se le introdujo la mutación leaner y que fue
generosamente proporcionado por el Dr. Terry Snutch (University of British
Columbia).
Como se mencionó con anterioridad, la subunidad 1A del canal P/Q tiene en
su extremo carboxilo dominios de interacción con proteínas reguladoras del canal.
Una de las más importantes es la calmodulina, una proteína reguladora que participa
en una gran variedad de eventos fisiológicos dependientes de calcio. Es una proteína
de 148 aminoácidos, capaz de unir 4 moléculas de calcio de manera específica, es
estructuralmente estable y flexible aún bajo los cambios conformacionales inducidos
por el calcio y modula la actividad de una gran cantidad de proteínas incluyendo
proteínas cinasas, fosfodiesterasas, bombas de calcio, etc. Tanto la secuencia IQ
como el dominio CBD en el canal tipo P/Q son capaces de interaccionar con
calmodulina. Así, considerando que la isoforma corta pierde el dominio CBD, resultó
de suma importancia tratar de establecer el papel modulador del dominio IQ mediado
por calmodulina sobre la actividad del canal.
30
6
HIPÓTESIS
La reducción funcional observada en los canales de calcio tipo P/Q en el
modelo de epilepsia conocido como leaner podría deberse a cambios en los
mecanismos de regulación de la proteína que constituye el canal como resultado de
la alteración en el dominio de interacción con proteínas moduladoras.
7
OBJETIVO GENERAL
Analizar las propiedades electrofisiológicas de las mutaciones en el canal de
Ca+2 tipo P/Q utilizando como modelo la mutación conocida como leaner corto, en un
sistema de expresión heteróloga.
7.1
OBJETIVOS PARTICULARES
1.- Estudiar la dependencia al voltaje de la corriente acarreada por Ca+2 a
través del canal mutante tgla corto.
2.- Analizar el efecto de la corriente de Ca+2 evocada durante un prepulso
sobre la inactivación del canal de calcio mutante.
3.- Evaluar la dependencia de voltaje de la inactivación en estado estable
en el tgla corto.
4.- Comparar el grado de facilitación asociado a la estimulación con prepulsos
positivos usando Ca+2 como acarreador de corriente.
31
8
MATERIALES Y MÉTODOS
Las técnicas y métodos empleados son descritos en esta sección. Todos los
reactivos utilizados tenían la calidad requerida para biología molecular. Algunas
composiciones de soluciones específicas se describen en la metodología general,
mientras que las soluciones amortiguadoras generales (buffer) se muestran en la
sección de medios y soluciones.
8.1
VECTORES USADOS
Los constructos originales de cDNA usados a lo largo de este trabajo (1,
1tgla, 2 y
β2A, fueron generosamente proporcionados por el Dr. T. Snutch
(University of British Columbia). Las diferentes secuencias de cDNA utilizadas se
encontraban insertadas en los siguientes vectores para su amplificación y expresión
en el sistema de expresión heteróloga.
pcDNA: es un vector de expresión eucariótica que puede ser cultivado en bacterias
E.Coli. Tiene un promotor de citomegalovirus para generar un alto nivel de
transcripción de la secuencia insertada, una señal de poli-adenilación, un sitio de
clonación múltiple, un gen de resistencia a ampicilina y una secuencia de terminación
de la transcripción
pTracer: es un vector de expresión en células de mamíferos que contiene la
secuencia de la Proteína Verde Fluorescente (GFP), posee una secuencia de poliadenilación, un gen de resistencia a zeocina y una secuencia de terminación de la
transcripción.
32
8.2
TÉCNICAS BACTERIOLÓGICAS
8.2.1 Cultivo y almacenamiento de bacterias E. coli
Las bacterias utilizadas para la amplificación y la purificación de los DNA
plasmídicos utilizados durante este trabajo fueron E. coli de la cepa DH5-. El cultivo
de estas bacterias se realizó en medio de Luria-Bertani (medio LB). Las bacterias se
crecieron en matraces de vidrio a 37°C en agitación constante a 225 rpm. El
antibiótico de selección adicionado al medio LB dependió del cDNA a obtener, siendo
ampicilina (50g/ml) para las subunidades 1 (o 1tgla), 2 y β2A y zeocina (25
g/ml) para la proteína verde fluorescente (GFP). Las cajas con agar sólido se
prepararon usando medio LB adicionado con agar (15g/L). El medio se esterilizó
mediante calor húmedo a una temperatura de 121°C y una presión de 15 libras por
pulgada cuadrada durante 20 minutos, posteriormente se adicionó el antibiótico
requerido que fue previamente esterilizado mediante un filtro de 0.22m. Una vez
obtenidas las colonias, las cajas con agar sólido se mantuvieron a 4°C para su
almacenamiento por períodos cortos (no mayor a 2 semanas).
8.2.2 Preparación de las bacterias competentes
Para la preparación de las células competentes se utilizaron las siguientes
soluciones: CaCl2 (50 mM) y CaCl2/Glicerol al 20 % (50 mM).
El procedimiento seguido fue el siguiente:
1.- Se inocularon 50 ml de medio LB con una sola colonia de bacterias E. coli de la
cepa DH5- y se incubó toda la noche en agitación constate a 225 rpm y 37°C.
2.- Posteriormente se inocularon 200 ml de medio LB con 2 ml del cultivo anterior.
3.- Se tomaron 100 ml del medio anterior y se monitoreo el crecimiento bacteriano
hasta que alcanzó una densidad óptica de 0.4 a una absorbancia de 600 nm.
4.- Una vez alcanzada la absorbancia indicada se transfirió el medio a tubos estériles
y se mantuvieron en hielo durante 25 min.
5.- Posteriormente el medio se centrifugó a 3000 rpm por 5 min (4°C) y se removió el
sobrenadante.
33
6.- Se resuspendió el “pellet” mediante agitación suave con los 100 ml de medio
restantes del paso 2 y 50 ml de la solución de CaCl2 50 mM.
7.- Se incubó en hielo por 1 hora
8.- Posteriormente se centrifugó a 2500 rpm
por 5 min (4°C) y se removió el
sobrenadante.
9.- El “pellet” obtenido se resuspendió en 20 ml de la solución de CaCl2/Glicerol 20%.
10. Finalmente se hicieron alícuotas de 0.5 ml
en crioviales estériles, que se
congelaron inmediatamente en una mezcla de hielo seco/etanol y así las bacterias
competentes se almacenaron a -70°C.
8.2.3 Transformación de las bacterias E. coli.
Los diferentes plásmidos de DNA empleados en el presente trabajo se
introdujeron en las bacterias competentes E. coli mediante una reacción de shock
térmico a través del siguiente procedimiento.
1.- Se adicionaron 10 a 15 ng del DNA requerido a 200l de bacterias competentes.
2.- Se incubaron en hielo por espacio de 30 min.
3.- Posteriormente se realizó un shock térmico a 42°C por 40 seg.
4.- Se adicionaron 3 ml de medio LB y se incubó a 37°C por 60 min.
5.- Luego se centrifugó a 14000 rpm por 1 min a temperatura ambiente.
6.- Se desechó el sobrenadante y se resuspendió el “pellet” en el líquido remanente.
7.- Las bacterias se sembraron en las cajas con agar sólido conteniendo el antibiótico
de selección correspondiente y se incubaron a 37°C durante toda la noche. Se
eligieron colonias completamente aisladas para su cultivo y posteriormente el DNA
se aisló mediante el procedimiento de Maxi-prep de QIAGEN.
8.3
Determinación de la concentración de DNA
La concentración de los cDNA obtenidos se midieron mediante la técnica de
espectrofotometría. Se utilizó la relación de absorbancia 260/280 para determinar la
pureza de los cDNA, tomando un valor por arriba de 1.65, como indicador de que la
muestra se encontraba pura.
34
8.4
Aislamiento de DNA por Maxi-prep (QIAGEN)
Para obtener una producción a gran escala (20g) de los distintos DNA
plasmídicos, se usó un sistema de purificación de plásmidos Maxi-prep (Qiagen)
siguiendo las instrucciones del fabricante:
1.- Una colonia de bacterias conteniendo el inserto requerido se cultivó en 3 ml de
medio LB en presencia del antibiótico de selección requerido.
2.- 100ml de medio LB más el antibiótico de selección se inocularon con el medio
anterior y se incubaron a 37°C durante toda la noche.
3.- Posteriormente se centrifugó a 6000 rpm por 10 min, 4°C y el paquete de células
se resuspendió en 10 ml del buffer P1 frío.
4.- Luego se adicionaron 10 ml del buffer de lisis P2 y se incubó por 5 min a
temperatura ambiente.
5.- La solución se neutralizó con 10 ml del buffer P3 y se incubó en hielo durante 20
min.
6.- El componente lisado se centrifugó a 12000 rpm por 30 min y 4°C.
7.- El sobrenadante se decantó en una columna de intercambio iónico, que
previamente había sido equilibrada con el buffer QBT (NaCl 750mM, MOPS 50mM,
pH 7.0, isopropanol 15%, Triton X-1000.15%)
8.- La columna se lavó posteriormente 2 veces con 30 ml del buffer QC (NaCl 1M,
MOPS 50mM, pH 7.0, isopropanol 15%).
9.- El DNA se eluyó con 15 ml del buffer QF (NaCl 1.25M, Tris-Cl 50mM, pH 8.5,
isopropanol 15%).
10.- El DNA se precipitó con 10.5 ml de isopropanol y se centrifugó a 12000 rpm por
20 min y 4°C.
11.- El paquete de DNA se lavó con etanol al 70% , se dejó secar por espacio de 15
min y se resuspendió en agua desionizada estéril para determinar su concentración y
su posterior uso.
35
8.5
Sistema de expresión heteróloga
Debido a que la mutación leaner genera dos isoformas diferentes por edición
alternativa en los canales de calcio tipo P/Q, se requirió de un sistema de expresión
que permitió evaluar de manera diferencial las propiedades electrofisiológicas de la
isoforma corta (tgla) con respecto al canal de calcio tipo P/Q silvestre. Razón por la
que se decidió utilizar a la línea celular HEK-293 como sistema de expresión
heterólogo, ya que esta no expresa canales de calcio tipo P/Q endógenos.
8.6
Cultivo de células HEK-293
Se logró el mantenimiento en el laboratorio de la línea celular HEK-293
(obtenida de riñón de humano en estado embrionario), como sistema de expresión
heteróloga. Las células se mantuvieron en un medio de Eagle modificado por
Dulbecco (DMEM), enriquecido con suero bovino fetal (SBF) inactivado por calor al
10% y con antibiótico penicilina-estreptomicina (50 U/ml), bajo una atmósfera de CO2
al 5% y a una temperatura de 37°C. Para asegurar su continuidad se realizaron
resiembras periódicas al alcanzar un 70-80% de confluencia celular con una solución
de tripsina 0.05%/EDTA 0.2% . El pasaje celular para preparar alícuotas de la
suspensión celular, se llevó a cabo de manera similar excepto que las células se
transfirieron a una mezcla de SBF + DMSO al 10% y se mantuvo así un lote de
células congeladas a -70°C.
8.7 Transfección de las células HEK-293 mediada por agregados
inorgánicos (fosfato de calcio)
12 horas previas a la transfección, las células se resembraron en cajas de
Petri de 35 mm a una confluencia aproximada del 20%. Se utilizó el método de
fosfato de calcio (Okayama y Chen, 1990) para transfectar de manera transitoria las
células con el cDNA que codifica para cada una de las subunidades que conforman
el canal de calcio 1 (o 1 tgla), 2, β2A con 2 g de cada una para obtener una
relación molar de 1:1:1. Como marcador para la identificación visual, las células se
cotransfectaron con el vector pTracer que contiene la secuencia de la Proteína Verde
36
Fluorescente (1 g) que emite luz verde al ser excitada en el rango de luz UV (
Cheng y cols., 1996) y para la reacción general se empleó el plásmido Bluescript
como acarreador de DNA (c.b.p 20g).
El procedimiento general para realizar el proceso de transfección fue el
siguiente:
Preparación de la mezcla cDNA-fosfato de calcio:
1.- Se utilizaron en total 20 g de cDNA para transfectar 3x106 células, los cuales se
disolvieron en 220 l del buffer TE.
2.- Se adicionaron 250 l del buffer 2x HBS y se agitó suavemente.
3.- Posteriormente se agregaron 30 l de CaCl2 2 M gota a gota y lentamente.
4.- La solución con el cDNA se incubó a temperatura ambiente por 30 min.
8.7.1 Transfección celular:
1.-La monocapa de células se lavó una vez con el buffer PBS, para posteriormente
agregar medio DMEM sin suero e incubar por espacio de 30 min antes de la
transfección.
2.- Después de los 30 min de incubación se agregó la mezcla de cDNA-fosfato de
calcio gota a gota distribuyéndola de manera uniforme en toda el área de la caja de
Petri que contenía la monocapa celular.
3.- Se incubó a 37°C/CO2 5% durante toda la noche.
4.- Tras la incubación el medio se intercambió por medio completo (DMEM/SBF/PenEstrepto)
5.-Después de 24 horas de haber sido realizada la transfección, las células se
resembraron en cubreobjetos de vidrio tratados previamente con polilisina (50g/ml),
donde se realizaron los registros electrofisiológicos.
37
8.8
Análisis electrofisiológico
Los cDNA de las subunidades que codifican para el canal de calcio tipo P/Q
subclonados en los vectores pcDNA se transfectaron de manera transitoria en las
células HEK-293, en una relación 1:1:1 usando el método de fosfato de calcio. Los
cubreobjetos con las células transfectadas se montaron en una cámara de registro
sobre un microscopio invertido equipado con una lámpara de fluorescencia. Las
células se mantuvieron bajo un flujo de perfusión constante (1.5 ml/min) lo que
permitió el recambio de la solución externa (Tris 140 mM, CaCl2 10 mM, MgCl2 1 mM,
Glucosa 10 mM a pH 7.4). Los registros se realizaron 24-72 horas después de
haberse realizado la transfección, identificando como células positivas a la
incorporación del cDNA exógeno aquellas que emitieron fluorescencia bajo luz UV.
El registro de las corrientes en la configuración de célula completa se realizó
mediante el empleo del método de fijación de voltaje (Hamill y cols., 1981). Las
señales generadas por las corrientes se amplificaron mediante un amplificador
Axopatch 200B (Axon instruments, USA) y se adquirieron a través de un convertidor
analógico digital de 16 bits (Axon instruments, USA) para su posterior análisis. Los
electrodos de registro se fabricaron con capilares de borosilicato (Sutter BF150-86-10
0.86, 1.5 diámetros interno y externo respectivamente). La resistencia final de los
electrodos fue de 2.4M con la solución interna (NMG 120mM, MgCl2 1mM, HEPES
60mM, EGTA 0.5mM, ATP-Mg 2mM a pH 7.2).
Las propiedades electrofisiológicas de las corrientes producidas por los
canales de calcio tipo P/Q (1A y tgla corto), se estudiaron a través de los siguientes
protocolos experimentales: 1) La
relación corriente voltaje (curva IV), se evaluó
mediante la aplicación de pulsos de voltaje de 800 ms a partir de un potencial de
mantenimiento de -100 mV, incrementando su amplitud cada 5 mV y evaluando un
rango de voltaje entre -50 y +45 mV. 2) La inactivación dependiente de la magnitud
de la corriente durante un prepulso (inactivación por prepulso), se estudió a través de
la aplicación de prepulsos de prueba breves (30 ms) a partir de un potencial de
mantenimiento de -100 mV; después de un intervalo de 20 ms, se aplicó un pulso de
prueba con duración de 200 ms a un potencial de 0 mV. De esta forma se midió la
fracción de corriente que puede evocarse por un segundo pulso, tomando en cuenta
38
que durante el prepulso la inactivación es mínima. 3) Para analizar la inactivación en
estado estable, se aplicaron prepulsos de voltaje de larga duración (15 s) a partir de
un potencial de mantenimiento de -120 mV, incrementando su amplitud cada 10 mV
y explorando un rango de voltaje entre -120 y +70 mV; de esta manera se evaluó la
magnitud de la corriente que evocó un pulso de prueba con duración de 200 ms a
+10 mV, el cual fue aplicado inmediatamente después del prepulso condicionante.
Maniobra experimental que permitió medir la disponibilidad de canales funcionales en
función del voltaje que produjo inactivación. Finalmente, 4) la evaluación de la
facilitación por prepulsos positivos se realizó mediante un protocolo que consistió en
la aplicación alternada de pulsos de prueba con duración de 100 ms a +5mV,
precedidos o no por un prepulso con duración de 50 ms a +150 mV. Esto permitió
medir la magnitud de la corriente evocada por el pulso de prueba generado en
ausencia de prepulso lo que se comparó con el valor de la corriente evocada por el
pulso de prueba precedido por prepulsos positivos.
El análisis estadístico de los resultados se llevó a cabo con el programa de
computadora origin 6.0 (Microcal, USA).
La significancia estadística de los
promedios de corriente se evaluó mediante la prueba de t-Student, considerando
como significativo una p5%.
La relación corriente-voltaje se analizó haciendo un ajuste con la ecuación de
Boltzmann (I = {Gmax (Vm-Er) } {1/1 + exp[(Vm-Vh)/k]}), obteniendo de esta manera
los parámetros de dependencia de voltaje de la activación del canal de calcio tipo
P/Q.
Donde:
I es la corriente normalizada
Vm es el potencial del pulso de prueba
Er es el valor extrapolado del potencial de inversión de la corriente.
Gmax es el valor máximo de la conductancia
Vh es el potencial al cual se alcanza el 50% de activación.
k es el factor de Boltzmann (RT/zF) en mV.
Mientras que el porcentaje de inactivación durante un pulso de prueba se
expresó como la relación entre la corriente al final del pulso de prueba denominada
39
como “Ipedestal” y la corriente máxima de denominada como “Ipeak”, los dos valores
se midieron en las corrientes que fueron evocadas por pulsos de voltaje en un rango
entre -50 y +45 mV y se expresaron como el cociente r= I pedestal/Ipeak.
Por otro lado, para la inactivación en estado estable, una vez normalizada la
corriente esta se graficó en función del potencial del prepulso condicionante y se
ajustó a una relación de Boltzmann (I = { 1/[1 + exp(V – Vh)/k]}).
Donde:
I es la corriente durante el pulso de prueba
V es el valor del potencial aplicado durante el prepulso
Vh es el potencial de membrana al cual el 50% de los canales están
disponibles
k es el factor de Boltzmann.
Además, para el análisis de la inactivación dependiente de la corriente durante
el prepulso, la corriente evocada durante cada pulso de prueba se normalizó y se
graficó en función del potencial aplicado durante el prepulso correspondiente; se
comparó el rango de voltaje donde se observó la máxima inactivación con el valor
correspondiente para la corriente máxima en la relación corriente voltaje (curva IV).
Finalmente, la facilitación por prepulso se calculó como el cociente de la
corriente evocada después de un prepulso fuertemente despolarizante a +150mV
(I+PP) con respecto a la corriente evocada en ausencia del prepulso (I-PP). Se
graficaron los valores obtenidos en forma de histograma (I+PP/I-PP).
40
8.9
MEDIOS Y SOLUCIONES
Las soluciones utilizadas fueron esterilizadas mediante calor húmedo a
121°C/15 PSI/20 min, a menos que se especifique otro método de esterilización.
Medio LB: Tryptona 10%, Extracto de levadura 5%, NaCl 5%, Glucosa 1%. El medio
se adicionó con antibiótico cuando el protocolo lo requirió.
PBS 1X: NaCl 0.17M, KCl 2.7 mM, Na2HPO4 8mM, KH2PO4 1.7 mM a pH 7.4.
TE 1X: (EDTA 0.1 Mm, Tris-HCl 1 mM pH8.0).
HBS 2X: NaCl 280 mM, KCl 10 mM, Na2HPO4 1.5 mM, Dextrosa 12 mM, HEPES 50
mM pH 7.5.
CaCl2 2 M: Se disolvieron 14.7 g de CaCl2 en 100 ml de H20 desionizada.
P2: NaOH 200mM, Dodesil sulfato de sodio SDS 1% (peso/volumen)
P3: Acetato de potasio 3.1 M (pH 5.5)
41
9
RESULTADOS Y DISCUSIONES
El presente trabajo se centró en la caracterización funcional del canal de calcio
tipo P/Q de humano (1A) al que se le introdujo una mutación en el extremo
carboxilo denominada como
leaner corto (tgla corto), mutación que produce la
perdida del dominio de unión constitutiva a calmodulina (CBD), para evaluar sus
propiedades electrofisiológicas y compararlas con las del canal silvestre.
9.1
Efecto de la mutación tgla corto sobre la densidad de corriente
La figura 3 muestra que la expresión de la mutación tgla corto en células
HEK293 no afecta de manera significativa (p>0.05) la densidad de corriente (pA/pF)
con respecto a la densidad de corriente generada por la transfección del canal
silvestre en el mismo tipo celular. Sin embargo, mientras que para el canal silvestre
se requirieron en promedio 30 horas después de la transfección para alcanzar la
densidad de corriente observada, para el canal mutante en promedio fue necesario
mantener las células en incubación por espacio de 55 horas después de realizada la
transfección.
Lo anterior sugiere que al menos en el sistema de expresión
heteróloga y bajo las condiciones de transfección empleadas, aún cuando el canal
mutante tgla corto afecta el curso temporal de la expresión de la corriente, una vez
que el canal se encuentra en un estado activo la densidad de corriente tiene una
magnitud similar a la observada para el canal silvestre.
42
28
24
n = (4 )
3 0 h rs p o s t-tra n s fe c c ió n
pA/pF
20
n = (6 )
5 5 h rs p o s t-tra n s fe c c ió n
16
12
8
4
0
la
tg -c o r to +  2 A +  2 
1A +2A +2
Figura 3.- Densidad de corriente (DC) expresada en pA/pF cuando se expresaron los canales de
calcio tipo P/Q en células HEK293. Canal silvestre (1A humano) coexpresado con las subunidades
auxiliares β2A y 2, con una DC promedio de 16 pA/pF (n=4) (
). Canal mutante tgla corto
coexpresado con las subunidades accesorias β2A y 2, con una DC promedio de 12 pA/pF
(n=6) ( ).
9.2
Caracterización de la curva corriente-voltaje del tgla corto cuando la
corriente es acarreada por Ca+2
En la figura 4B se pueden apreciar los trazos representativos de las corrientes
obtenidas a través del canal silvestre y la mutación tgla corto, cuando el ión
acarreador es calcio (ICa); donde a simple vista se observa que hay diferencias
importantes en cuanto a la cinética de inactivación en ambos canales, los trazos en
las corrientes obtenidas sugieren que la cinética de inactivación de las corrientes
obtenidas para el tgla corto (coexpresado con las subunidades accesorias β2A y 2)
es mas lenta que la observada en los trazos de corrientes obtenidos para el canal
silvestre coexpresado con las mismas subunidades accesorias. La curva IV (figura
4A) se obtuvo siguiendo el protocolo de pulsos mostrado en el inserto de la misma
figura. Así, los resultados arrojaron que la dependencia al voltaje de la activación no
se ve afectada de manera significativa (p>0.05) en el tgla corto respecto al canal
43
silvestre. El ajuste a la curva hecho con la ecuación de Boltzmann, mostró que
mientras el potencial al cual se alcanzó el 50% de la activación (Vh) para el tgla corto
resultó ser de -13.710.68 mV para el canal silvestre fue de -14.490.67 mV. Así, los
resultados permiten sugerir que los cambios generados en la región carboxilo del
canal de calcio tipo P/Q, como consecuencia de la mutación tgla corto no muestra
incidencia sobre los mecanismos de activación dependientes de voltaje que
participan en este tipo te canal. De tal forma que los resultados en cuanto a la
dependencia de activación obtenidos durante el presente trabajo, concuerdan con los
datos reportados por Lorenzon y cols. (1998) para neuronas de Purkinje del ratón
mutante leaner.
B
A
1A humano n=5
Vm
la
tg corto n=6
0.0
-60
-40
-20
0
20
40
1A humano
1A humano
60
Corriente Normalizada
-0.2
50 pA
-0.4
100 ms
-0.6
tgla Corto
-0.8
-1.0
+45
-50
-100mV
50 pA
800 ms
100 ms
Figura 4.- Inserto muestra el protocolo de pulsos utilizado para obtener la curva IV. En el panel A se
aprecian las curvas IV ajustadas con la ecuación de Boltzmann (ver materiales y métodos) para el
canal silvestre coexpresado con las subunidades accesorias β2A y 2 ( ) y para el canal
mutante tgla corto coexpresado con las subunidades accesorias β2A y 2 (
) . En el panel B se
observan trazos representativos de las corrientes obtenidas a través de los canales silvestre (trazo
superior) y tgla corto (trazo inferior).
44
9.3
Efectos sobre la cinética de inactivación producidas por el tgla corto
Las cinéticas de inactivación de las corrientes acarreadas por calcio a través
del canal de calcio tipo P/Q (1A y tgla corto) también fueron estudiadas y los
resultados obtenidos se muestran en la figura 5.
El curso temporal de la inactivación de la ICa a través del canal de calcio 1A
(figura 5A) requirió de un ajuste biexponencial (fast, slow), mientras que la ICa a través
del canal de calcio tgla corto ( figura 5B) se ajustó a una sola exponencial (slow).
Estos resultados sugieren que las alteraciones generadas por la mutación tgla corto
en el canal de calcio tipo P/Q producen: 1.- La perdida de la fast observada en el
canal silvestre que se encuentra en el orden de los 30 ms y 2.- una reducción
significativa (p<0.05) en la constante de inactivación lenta (slow en el orden de
500ms) comparada con la que se obtuvo para el canal silvestre (slow en el orden de
los 300 ms). Estos resultados, son por demás interesante debido a que la mutación
afecta una región estructural (dominio CBD) que ha sido asociado por algunos
autores como parte importante del proceso de regulación de la inactivación
dependiente de ICa del canal de calcio tipo P/Q (DeMaría y cols., 2001).
45
A
B
1A humano + 2A + 2
n=5
190
1A humano + 2A + 2
n=5
tgla corto + 2A + 2
n=4
800
170
700
130
600
le n ta (m s )
rá p id a(m s )
150
110
90
70
500
400
50
30
300
10
-10
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
-10
Potencial de membrama (mV)
0
10
20
30
Potencial de membrama (mV)
Figura 5.- Constantes de inactivación de los canales de calcio tipo P/Q (1A y tgla corto) analizadas a
partir de un potencial de mantenimiento de -100Mv en un rango de voltaje de -10 a +40 mV con
incrementos de 5 mV y con una duración del pulso de prueba igual a 800 ms. El canal mutante tgla
corto coexpresado con las subunidades accesorias β2A y 2 tuvo un ajuste monoexponencial (panel
B
), dando lugar a una solo constante de inactivación lenta (lenta) (n=4). El canal silvestre (1A)
coexpresado con las subunidades accesorias β2A y 2 a diferencia del canal mutante tuvo un ajuste
biexponencial generando dos constantes de inactivación: una rápida (rápida) (Panel A
) y otra
) (n=5).
constante lenta (lenta) (Panel B
9.4
Efecto de la mutación tgla corto sobre el grado de inactivación en función
del potencial
En la figura 6 se muestra el grado de inactivación en función del potencial,
medido como el cociente de la corriente al pico respecto a la corriente al final del
pulso (ver inserto de la figura 6) cuando el rango de voltaje analizado fue entre 0 y
+40 mV. La mutación tgla corto mostró un grado de inactivación menor que el
observado para el canal silvestre. Para el tgla corto se observó el grado máximo de
inactivación a un potencial de +20 mV, siendo este cercano al 30% (figura 6B),
mientras que para el canal silvestre se observó también el máximo grado de
inactivación al mismo voltaje pero con un porcentaje de inactivación cercano al 80%
(figura 6A). Estos resultados sugieren que la mutación tgla corto tiene un efecto
importante sobre el mecanismo de inactivación bajo estas condiciones, ya que el
46
grado de inactivación fue significativamente diferente (p<0.05) con respecto a los
resultados obtenidos para el canal silvestre. Aspecto que también soporta la idea de
que la alteración producida en el extremo carboxilo del canal de calcio tipo P/Q,
como resultado del ensamblaje alternativo de la mutación leaner que da lugar a la
isoforma corta, afecta los mecanismos que permiten al canal pasar a un estado
inactivo.
A
B
r = Iped / Ipeak
1A+2A+2 (n=4)
la
tg corto+2A+2 (n=6)
1.0
r=Iped/Ipeak
r=Iped/Ipeak
1.0
0.8
0.6
0.4
0.8
0.6
0.2
-10
0
10
20
30
40
50
60
Pulso (mV)
-10
0
10
20
30
40
50
60
Pulso (mV)
Figura 6.- El grado de inactivación en función del potencial para los canales de calcio tipo
P/Q (tgla corto y 1A) se obtuvo del cociente r=Iped/Ipeak (ver inserto) de la corriente evocada por
pulsos de prueba en un rango de voltaje entre 0 y +40 Mv con incrementos de 5 mV a partir de un
potencial de mantenimiento de -100Mv. En el panel A (
) se aprecia que el grado de inactivación
máximo para el canal silvestre (1A) coexpresado con las subunidades accesorias β2A y 2 es
mucho mayor (cercano al 80%), mientras que en el panel B (
) se aprecia que el canal mutante tgla
corto coexpresado con las mismas subunidades β2A y 2 mostró una reducción considerable en el
grado de inactivación máxima en función del potencial (cercano al 30%).
9.5
Efectos en la entrada previa de calcio sobre la inactivación de la
corriente en la mutación tgla corto
En la figura 7 se muestran los resultados al evaluar el efecto de la entrada
previa de calcio sobre la inactivación de la corriente acarreada por este ión a través
del canal mutante tgla corto y su comparación con el canal silvestre (el protocolo de
pulsos seguido se muestra en el inserto de la figura). En la figura 7A se pueden
47
observar trazos representativos del efecto producido por la entrada previa de calcio
tanto para el tgla corto como para el canal silvestre. En los trazos de corriente del
pulso de prueba se marcan los voltajes que corresponden al prepulso condicionante.
De tal modo que puede apreciarse que al valor del prepulso (0 mV) donde se
produce la mayor entrada previa de calcio, existe una reducción en la corriente
evocada por el pulso de prueba, respecto a la corriente obtenida por el pulso de
prueba cuando el prepulso condicionante (-40 mV) no genera una entrada previa de
calcio significativa; lo anterior, se visualizó tanto para el tgla corto (figura 7A inferior)
como para el canal silvestre (figura 7A superior). Por otro lado, en la figura 7B se
muestran los resultados obtenidos tras graficar la corriente normalizada que se
generó durante el pulso de prueba en función del potencial durante el prepulso
condicionante. Así, para el canal silvestre (figura 7B superior) se pudo observar que
existe una correlación directa en la reducción de corriente en función de la entrada
previa de calcio, lo que generó una forma de U invertida de la curva corriente voltaje
(figura 4A).
De tal modo que a un
condicionante igual a 0 mV,
valor del potencial durante el prepulso
se obtuvo el grado máximo en la reducción de la
corriente evocada durante el pulso de prueba, lo que se correlaciona con el rango de
voltaje (aproximadamente 0 mV) en el que para la curva IV se observa el pico
máximo de corriente (ver figura 4). Sin embargo, para la mutación tgla corto se obtuvo
una variación significativa con respecto a lo observado en el canal silvestre. Los
resultados obtenidos para el tgla corto sugieren que para un rango de voltaje entre 50 y +25 mV existe una población de canales inactivados a los que la entrada previa
de calcio parece no afectarles y no es sino hasta que se genera una acumulación de
calcio intracelular, que el canal mutante muestra inactivación (potenciales mas
positivos que 25 mV) (7B inferior).
48
-0.60
1A + 2A+2
Corriente normalizada
1A +  2A
-0.65
-0.70
-0.75
-0.80
-0.85
0mV
-0.90
-40mV
-0.95
-1.00
100pA
-40
50ms
la
Corriente normalizada
-40mV
0mV
20
40
60
-0.6
0mV
+100
-40
-100mV
0
V prepulso
tg Corto
30 ms 200ms
-20
tgla corto+2A+2
-0.7
-0.8
-0.9
-1.0
-50
50pA
0
50
100
V prepulso
50ms
20ms
Figura 7.- Consecuencias de la entrada previa de calcio sobre la ICa evocada por un pulso de
prueba posterior a esta (ver protocolo de pulsos en el inserto de la figura). En el panel A se puede
observar que tanto para el canal silvestre (superior) como para el canal mutante tgla corto (inferior)
existe una reducción en la corriente acarreada por calcio (trazos rojos) cuando hay una entrada previa
de calcio en comparación con la corriente evocada por el pulso de prueba sin entrada previa de calcio
(trazos negros). En el panel B se muestra la corriente normalizada generada por el pulso de prueba en
función del voltaje correspondiente durante el prepulso condicionante. Para el canal silvestre ( ) se
observó que la fracción máxima de inactivación corresponde al rango de voltaje en que se obtuvo el
pico máximo de corriente durante la curva IV (ver figura 4). Sin embargo, el canal mutante tgla corto
( ) presenta un valor sostenido en el grado de inactivación en un rango de voltaje de -50 a +25 mV,
disminuyendo el grado de inactivación en la ICa a voltajes del prepulso mas positivos.
9.6
Efecto de la mutación tgla corto sobre la inactivación en estado estable
del canal de calcio tipo P/Q
La inactivación en estado estable del canal de calcio tipo P/Q se evaluó a
través de un protocolo de doble pulso (ver inserto figura 8). A partir de las curvas de
inactivación en estado estable tanto para el canal mutante como el silvestre (1A), se
hizo el análisis de los resultados obtenidos ajustando a una ecuación de Boltzmann
(ver materiales y métodos), y este indicó que no existe una diferencia significativa
(p0.05) en el potencial al cual se alcanza el 50% de inactivación del canal, siendo
Vh=-33.610.71 para el canal silvestre y Vh=-33.130.5 para la mutación tgla corto;
49
150
además, el factor de Boltzmann (k) resultó ser similar para ambos canales (tgla corto
=5.050.5 y 1A =6.50.6). Los resultados permiten sugerir que los cambios
generados por la mutación tgla corto en el extremo carboxilo no parecen alterar la
dependencia al voltaje durante el proceso de inactivación del canal cuando se utiliza
calcio como ión acarreador.
Corriente normalizada
1.0
0.8
1A (n=8)
Vh = -33.61 0.71
K = 6.5  0.6
0.6
tgla corto (n=7)
Vh = -33.13  0.54
K = 5.05  0.5
0.4
0.2
0.0
-100
+70mV
-50
0
50
Potencial prepulso (mV)
10 mv
200ms
Figura 8.- Para determinar la inactivación en estado estable para el canal de calcio tipo P/Q
(1A y tgla corto), se llevó a cabo el protocolo de pulsos mostrado en el inserto de la figura. Las curvas
)
de inactivación en estado estable para el canal silvestre (1A) (
) y el canal mutante tgla corto (
se obtuvieron graficando la corriente (normalizada) que se evocó durante el pulso de prueba en
función del valor de potencial aplicado durante el prepulso condicionante, ajustando a una relación de
Boltzmann (ver materiales y métodos). La gráfica muestra que no existe una diferencia significativa
(p0.05) en la inactivación en estado estable del canal mutante (Vh=-33.130.5) comparada con el
canal silvestre siendo (Vh=-33.610.71).
50
9.7
Efecto de la facilitación en la corriente de calcio mediada por un prepulso
fuertemente despolarizante de muy breve duración.
En la figura 9A se puede observar un trazo representativo del efecto de la
facilitación en la corriente a través del canal mutante tgla corto cuando se utilizó calcio
como ión acarreador
de la corriente (el protocolo de pulsos que se empleó se
muestra en el inserto de la figura 9). Así, en la figura 9A se puede apreciar que la
magnitud de la corriente evocada por un pulso de prueba fue diferente dependiendo
de la presencia o ausencia de un prepulso fuertemente despolarizante de muy breve
duración (150mV/50ms). De tal forma que la magnitud de la corriente evocada por el
pulso de prueba fue significativamente mayor (p0.05) cuando fue precedido por un
prepulso despolarizante (+PP), en comparación con la magnitud de corriente
evocada por el pulso de prueba que no fue precedido por un prepulso despolarizante.
La facilitación por prepulso ha sido reportada como un mecanismo que ocurre
mediante la disociación del complejo β de la proteína G del sitio de unión
correspondiente
en los canales de calcio dependientes de voltaje y que
la
recuperación de la facilitación está mediada por la religación del complejo a su sitio
de unión en el canal (Zamponi, 1998). Sin embargo, de suma importancia resulta
hacer notar que los cambios producidos por la mutación tgla corto además de
conducir a la perdida del sitio de unión constitutiva a calmodulina, también elimina el
sitio de unión al complejo β de proteínas G. Así, estos resultados están en
concordancia con los datos reportados por el grupo de Amy Lee (2000) en el sentido
de que la inactivación de canales de calcio tipo P/Q puede recuperarse mediante la
aplicación de trenes de pulsos previos que permiten la acumulación de calcio
intracelular, proceso que se encuentra asociado al complejo Ca+2/Calmodulina es
decir, que es un evento independiente del papel que juega el sitio de unión a
proteínas G situado en el extremo carboxilo del canal.
51
(n=9)
1.4
(n=8)
100 pA
- PP
20 ms
I+PP / I-PP
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
+ PP
0.2
0.0
1A
la
tg corto
150mV
5mV
-100mV
50ms
100ms
Figura 9.- La evaluación de la facilitación de la ICa por prepulso para el canal mutante tgla
corto y el canal silvestre (1A) se llevó a cabo siguiendo el protocolo de pulsos mostrado en el inserto
de la figura. El grado de facilitación medido como el cociente de la corriente obtenida después de un
prepulso a -150 mV con respecto a la evocada en ausencia de prepulso (I+pp/I-pp), resultó ser
significativamente mayor (p<0.05) para el canal mutante tgla corto (rayado color rojo) en comparación
al resultado obtenido para el canal silvestre (rayado color negro).
52
10
CONCLUSIONES
La subunidad 1A da lugar a la formación del canal de calcio tipo P/Q, que
tiene un alto nivel de expresión en células granulares y
en células de Purkinje
(Westenbroek y cols., 1995). Por lo que dada su distribución celular así como las
interacciones fisiológicas con proteínas de la membrana presináptica, señalan que
los canales de calcio tipo P/Q tienen un papel relevante en los mecanismos
reguladores de los procesos sinápticos; es decir, influyen de manera directa en la
liberación de neurotransmisores (Sutton y cols., 1999).
La mutación leaner en el canal de calcio tipo P/Q genera una isoforma
denominada como tgla corto, provocando cambios estructurales en la región carboxilo
del canal que conducen a la perdida de sitios que permiten la interacción con
proteínas reguladores como: el dominio de unión a calmodulina (Lee y cols, 1998) y
el dominio de interacción con proteínas G (Furuwaka y cols, 1999). Dicha mutación
se encuentra estrechamente asociada a algunas alteraciones neurológicas en
humanos, como la migraña hemipléjica familiar y la ataxia espino cerebelar tipo 2
(Zhüchenko y cols., 1997).
Así, para llevar a cabo este trabajo consideramos que dada la gran
importancia que tienen los canales de calcio en la regulación de procesos fisiológicos
implicados en la regulación neuronal, resulta indispensable tratar de establecer la
interrelación causa-efecto entre la mutación tgla corto y las alteraciones neurológicas
observadas. Si bien, lo ideal es estudiar la alteración en un contexto lo más cercano
a lo fisiológico posible, también es cierto que la relación que existe entre la mutación
y el fenotipo clínico observado involucra procesos de señalización por calcio
sumamente complejos. De tal forma que es necesario estudiar las propiedades
electrofisiológicas y la modulación del canal mutante bajo condiciones estrictamente
controladas, por lo que el uso de un sistema de expresión heterológa como modelo in
vitro es el punto de partida inicial que contribuirá de manera determinante en la
comprensión
de la posible participación de la mutación en la alteración de la
excitabilidad neuronal, así como en la secreción de neurotransmisores relacionadas
a procesos neurodegenerativos.
53
La elevación intracelular de Ca+2 mediada por la apertura del canal de calcio
tipo P/Q, es capaz de inhibir la entrada de Ca+2. Este proceso denominado como
inactivación mediada por calcio, representa un mecanismo importante de
retroalimentación que contribuye a la aceleración en la inactivación del canal.
En la región carboxilo de la subunidad 1A se localiza una secuencia de
aminoácidos llamada dominio IQ, que tiene la peculiaridad de ser capaz de
interaccionar con calmodulina, una proteína sensible a calcio. Así, el complejo
Ca+2/calmodulina interactúa con el dominio IQ a través de un mecanismo sensible a
los niveles de calcio promoviendo la inactivación del canal (Lee y cols., 1999). Sin
embargo, dicho mecanismo dista mucho de ser completamente conocido.
En el presente trabajo, se utilizó el canal de calcio tipo P/Q de humano (1A
humano) al que mediante técnicas de mutagénesis dirigida se le introdujo la
mutación leaner (tgla corto) y el cual fue comparado con la proteína silvestre. Las
proteínas que conforman el poro se coexpresaron con las subunidades accesorias
β2A y 2 en las células HEK 293. Dichas coexpresiones permitieron realizar el
análisis electrofisiológico de los canales mencionados, en un intento por tratar de
comprender las posibles alteraciones en los mecanismos de inactivación por calcio
generadas por los cambios promovidos en la región carboxilo del canal por la
mutación tgla corto; para ello, se utilizó la técnica de patch clamp en su configuración
de célula completa.
La coexpresión de las subunidades 1 de tgla corto+β2A+2 no mostró
cambios significativos en la dependencia al voltaje de la activación cuando el ión
acarreador es calcio respecto al canal silvestre coexpresado bajo las mismas
condiciones experimentales. Estos resultados coinciden con los datos reportados
por los grupos de Lorenzon (1998) y Dove (1998) en experimento realizados en
células de Purkinje del ratón mutante leaner.
La
densidad
de
corriente
expresada
en
pA/pF
no
mostró
valores
significativamente diferentes, a diferencia de los datos reportados por Lorenzon y
cols. (1998) que manifiestan existe una reducción significativa en la densidad de
corrientes en neuronas de Purkinje del ratón leaner. Sin embargo, se debe destacar
en principio, que los modelos experimentales son completamente diferentes,
54
mientras en este trabajo se empleó un sistema de expresión heterológa que permitió
controlar el estudio de una sola isoforma mutada (tgla corto), ellos utilizaron células
nativas del animal mutante donde se desconoce cual es la contribución y el efecto
funcional de las dos isoformas generadas por la mutación leaner. Estos resultados
sugieren que los cambios generados en el extremo carboxilo en el tgla corto no
interfieren en la densidad de corriente expresada a través del canal de calcio tipo P/Q
mutado.
El análisis estadístico de los registros obtenidos para la inactivación en estado
estable tanto para el canal mutante (tgla corto) como para el canal silvestre no mostró
una diferencia significativa. Resultados que también se encuentran en concordancia
con lo reportado en células nativas del ratón mutante leaner
(Lorenzon y cols.,
1998).
Por otro lado, los registros obtenidos bajo la configuración de célula completa
sugieren que la mutación
tgla corto promueve la pérdida de un componente de
inactivación rápido, observado en el canal silvestre. El canal mutante tgla corto
mostró solo una cinética de inactivación lenta, que incluso fue significativamente
diferente de la constante de inactivación homóloga obtenida para el canal silvestre.
Resultados que sugieren la posible participación de un mecanismo de inactivación
mediado por el complejo Ca+2/Calmodulina a través del sitio de unión constitutiva a
calmodulina (CBD), que ha sido asociada a la inactivación por calcio en canales de
calcio dependientes de voltaje (Zülkhe y cols., 1999 y Lee y cols., 1999).
Además de la pérdida de un componente de inactivación lenta, los resultados
generados de este trabajo indican que la mutación tgla corto disminuye de manera
significativa el grado de inactivación del canal en función del potencial de membrana
respecto al canal silvestre, lo que de alguna manera soporta la idea de que los
cambios generados por la perdida del dominio CBD como consecuencia de la
mutación tienen una participación importante en los cambios observados en los
mecanismo de inactivación del canal.
Otro de los resultados obtenidos con el presente trabajo de investigación,
resultado de graficar los datos generados durante el protocolo de inactivación por
prepulsos evocaron una forma de U invertida, que se asocia a la existencia de un
55
mecanismo de inactivación dependiente del nivel de entrada previo de calcio. Sin
embargo, la mutación tgla corto perdió esta forma característica, sugiriendo que en un
rango de -50 a +25 mV existe una población de canales en estado inactivo (meseta
en la figura 7 panel B inferior) y por otro lado, se observa que no es hasta que se
produce una acumulación de calcio en el lado citoplasmático que el canal muestra
regulación por la entrada previa de calcio.
La facilitación por prepulsos es un fenómeno en el cual un prepulso
fuertemente despolarizante seguido de un pulso de prueba a un potencial dado
induce un cambio conformacional en los canales de calcio dependientes de voltaje, lo
que permite un incremento en su probabilidad de apertura. Este fenómeno ha sido
asociado a la disociación de proteínas G de su sitio de unión en la región carboxilo
del canal (Aparna, 2005). Sin embargo, la mutación tgla corto genera la perdida del
sitio de interacción con proteínas G además del dominio CBD. De manera
sorprendente los resultados obtenidos durante este trabajo señalan que la mutación
tgla corto muestra un incremento significativo en la fracción de corriente mediada por
calcio en comparación a la facilitación observada en el canal silvestre. Lo anterior
sugiere que probablemente el mecanismo que promueve este incremento en la
magnitud de corriente evocada por un pulso de prueba precedido por un prepulso
despolarizante, recae en la secuencia de aminoácidos que codifica para el dominio
IQ y que es regulado por el complejo Ca+2/Calmodulina.
Así, los resultados obtenidos con el presente trabajo de investigación
muestran que la mutación tgla corto:
a) modifica la cinética de inactivación dependiente de calcio.
b) altera la fracción de canales que inactiva en función del potencial de membrana.
c) la acumulación de calcio intracelular promueve cambios conformacionales en la
región carboxilo de la proteína, lo que da como resultado alteraciones en los
mecanismos de retroalimentación que intervienen en la inactivación del canal.
d) el dominio isoleucina glutamina parece estar involucrado en un fenómeno de
facilitación de la corriente de calcio que normalmente es asociado a la interacción
con proteínas G.
56
De tal modo que estas observaciones, soportan la hipótesis de que la
reducción funcional observada en el canal de calcio tipo P/Q del modelo leaner se
debe a cambios en los mecanismos de regulación de la proteína que constituye el
canal, como resultado de la alteración en el dominio de interacción con proteínas
moduladoras.
57
11
PERSPECTIVAS
Los resultados obtenidos de este trabajo, muestran que la alteración en el
extremo carboxilo de la proteína 1 perfila un largo camino para tratar de entender
cuales son los mecanismos que participan en la modulación del canal tipo P/Q, que
comparativamente al resto de los canales de calcio dependientes de voltaje se
encuentran en menor grado dilucidados; siendo la mutación leaner un modelo idóneo
para este fin.
La mutación leaner da lugar a la formación de dos isoformas distintas: una
corta que pierde el dominio CBD y otra larga que incluye una secuencia normalmente
no transcrita (Fletcher, 1996). El proyecto se centró básicamente en la evaluación de
las consecuencias primarias de la mutación tgla corto en base a que experimentos
previos de nuestro laboratorio mostraron que la mutación tgla largo tiene un
comportamiento similar al del canal silvestre (datos no mostrados). Sin embargo,
resulta imprescindible llevar a cabo una reevaluación a nivel electrofisiológico de las
consecuencias primarias de la mutación tgla largo y posteriormente diseñar
experimentos que permitan manipular la presencia de proteínas reguladoras como
son la calmodulina y proteínas G, con el fin de tratar de explicar de manera certera
cual es la participación que tienen en la regulación del canal.
En particular los resultados obtenidos, muestran que el dominio IQ parece
tener influencia en el proceso de facilitación por prepulsos; aspecto que resulta por
demás interesante, debido a que la recuperación de la inactivación puede ser un
proceso determinante para la entrada de calcio al citoplasma celular y la liberación
de neurotransmisores en las sinapsis (Forsythe y cols., 1998). Por lo que a futuro
resultaría de gran importancia, evaluar el papel que juega la calmodulina y
variaciones de esta que inhiben su unión a calcio (calmodulinas mutantes), lo que
contribuiría muy probablemente al esclarecimiento de los mecanismos que permiten
al complejo Ca+2/Calmodulina participar de manera diferencial en dos proceso tan
importantes como son la inactivación y la facilitación del canal de calcio tipo P/Q
(DeMaría y cols., 2001).
En forma anexa se presentan algunas figuras de resultados preliminares
utilizando calmodulina mutante 1,2,3,4 (CAM4), una
58
proteína
que pierde la
capacidad de unión a Ca+2 en sus 4 dominios. Estos datos no son concluyentes, la
idea a futuro es llevar a cabo los mismo protocolos que en el trabajo de tesis,
aumentar el número de muestras y complementar los resultados bajo condiciones de
sobreexpresión con calmodulina silvestre.
59
11.1 ANEXO
(FIGURAS DE DATOS PRELIMINARES)
Efecto de la CAM4 sobre la dependencia
al voltaje de la activacion
A
B
n=10
1A + CAM4
la
tg corto + CAM4 n=2
Vm
0.0
-40
-20
0
20
40
60
-0.2
Corriente Normalizada
-60
1A humano + CAM4
50 pA
100 ms
-0.4
-0.6
la
tg Corto + CAM4
-0.8
-1.0
+45
-50
-100mV
100 pA
100 ms
800 ms
Figura 1.- EI inserto muestra el protocolo de pulsos utilizado para obtener la curva IV. En el panel A
se aprecian las curvas IV ajustadas con la ecuación de Boltzmann (ver materiales y métodos) para el
canal silvestre coexpresado con la proteína mutante CAM4 además de las subunidades accesorias
β2A y 2 ( ) y para el canal mutante tgla corto coexpresado con las subunidades accesorias β2A y
2 y la proteína mutante CAM4 ( ) . En el panel B se observan trazos representativos de las
corrientes obtenidas a través de los canales silvestre (trazo superior) y tgla corto (trazo inferior) bajo
las mismas condiciones experimentales.
60
Efecto de la CAM 4 sobre el curso temporal de la inactivación
en función del potencial de membrana
1A + CAM4 n=8
tgla corto + CAM4 n=2
1000
900
800
 (ms)
700
600
500
400
300
200
100
-10
0
10
20
30
Potencial de membrana (mV)
Figura 2.- Constantes de inactivación de los canales de calcio tipo P/Q (1A y tgla corto) analizadas a
partir de un potencial de mantenimiento de -100Mv en un rango de voltaje de -10 a +40 mV con
incrementos de 5 mV y con una duración del pulso de prueba igual a 800 ms. Tanto el canal mutante
tgla corto (n=2) ( ) como el canal silvestre (n=8) (
) coexpresado con las subunidades accesorias
β2A y 2 y la CAM4 tuvieron un ajuste monoexponencial, dando lugar a una sola constante de
inactivación () .
61
En el canal silvestre la sobreexpresión de CAM4 no afecta
el grado de inactivación en función del potencial de membrana
1A
n=4
1A + CAM4 n=4
1.0
0.9
r=Iped/Ipeak
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
10
20
30
40
Potencial de membrana (mV)
Figura 3.- El grado de inactivación en función del potencial para el canal de calcio tipo P/Q
silvestre (1A) con ( ) y sin ( ) la sobreexpresión de CAM4 se obtuvo del cociente r=Iped/Ipeak de
la corriente evocada por pulsos de prueba en un rango de voltaje entre 0 y +40 Mv con incrementos
de 5 mV partiendo de un potencial de mantenimiento igual a -100mV. En la figura se aprecia que la
sobreexpresión de calmodulina mutante no afecta de manera significativa (p<0.05) el grado de
inactivación del canal silvestre.
62
En el tgla corto, el porcentaje de inactivación en función del potencial
se modifica con la sobreexpresión de calmodulina mutante
la
tg Corto
n=3
la
tg Corto + Cam4 n=4
1.0
r= Iped/Ipeak
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0
10
20
30
40
Potencial de membrana (mV)
Figura 6.- El grado de inactivación en función del potencial para el canal de calcio tipo P/Q
mutante denominado como tgla corto se obtuvo del cociente r=Iped/Ipeak de la corriente evocada por
pulsos de prueba en un rango de voltaje entre 0 y +40 mV con incrementos de 5 mV a partir de un
potencial de mantenimiento de -100mV. La figura muestra que la coexpresión del mutante tgla corto
con CAM4 (
) disminuye de manera significativa (p<0.05) el grado de inactivación en función del
potencial con respecto al canal silvestre (
) expresado bajo las mismas condiciones.
63
INACTIVACIÓN POR PREPULSO: Efectos de la entrada previa de
calcio sobre la inactivación de la ICa en el canal mutante tgla corto
-0.6
-0.60
tgla corto+2A+2
tglacorto + CAM4
Corriente normalizada
-0.65
-0.7
Corriente normalizada
-0.70
-0.75
-0.80
-0.85
-0.90
-0.95
-1.00
-1.05
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
100
-0.8
-0.9
-1.0
120
-50
V prepulso
0
50
100
150
V prepulso
30 ms 200ms
+100
0mV
-40
-100mV
20ms
Figura 7.- Consecuencias de la entrada previa de calcio sobre la ICa evocada por un pulso de
prueba posterior a esta (ver protocolo de pulsos en el inserto de la figura. La figura muestra la
corriente normalizada generada por el pulso de prueba en función del voltaje correspondiente al
prepulso condicionante. Los resultados sugieren que la coexpresión del canal mutante tgla corto con
la CAM4 (
) no presenta un cambio significativamente diferente (p>0.05) en la inactivación por
prepulso comparada con la expresión del tgla corto sin CAM4 ( ). Ambos canales presentan un valor
sostenido en el grado de inactivación en un rango de voltaje de -50 a +25 mV, disminuyendo el grado
de inactivación en la ICa a voltajes del prepulso más positivos.
64
12
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Angelotti T & Hofmann F (1996) Tissue-specific expression of splice variants of the
mouse voltage-gated calcium channel 2 subunit. FEBS Letters 397:331-337
Aparna Nirdosh & Geral Zamponi (2005) Determinants of G protein inhibition of
presynaptic calcium channels. Kluwer Academic (1):154-167
Artalejo, C. R., Adams, E. M. & Fox, A. P. (1994) Three types of Ca+2 channels
trigger secretion with different efficacies in chromafin cells., Nature (367):72-76
Bahler M. & A. Rhoads (2002) Calmodulin signaling via the IQ motif, FEBS Letters
513:107.
Bangalore R, Mehrke G, Gingrich K, Hofmann F & Kass RS (1996). Influence of Ltype Ca+2 channel 2/-subunit on ionic and gating current in transiently transfected
HEK 293 cells. Am J Physiol 270:H1521-H1528
Barclay, J., Balaguero, N., Mione, M., Ackerman, S. L., Letts, V. A., Brodbeck, J.,
Canti, C., Meir, A., Page, K. M., Kusumi, K., PerezReyes, E., Lander, E. S., Frankel,
W. N., Gardiner, R. M., Dolphin, A. C. & Rees, M. (2001) Ducky mouse phenotype of
epilepsy and ataxia is associated with mutations in the Cacna2d2 gene and
decreased calcium channel current in cerebellar Purkinje cells. Journal of
Neuroscience 21:6095-6104.
Bean B.P. (1989) Neurotransmitter inhibition of neuronal calcium currents by changes
in channel voltage dependence. Nature 340:153-156.
Berridge, M. J., Lipp P & Bootman, M. D. (2000) The versality and universality of
calcium signalling. Nature Reviews 1:11-21
Bers, D. M. (1991) Excitation-contraction and cardiac contractile force. Kluwer
Academic, Dordrecht 234-243
Bourinet
E.,
Soong
T.W.,
Stea
A
&
Terry
P.
Snutch
(1996)
Determinants of the G protein-dependent opioid modulation of neuronal calcium
channels. PNAS 93: 1486-1491.
Brice, N. L., Berrow, N. S., Campbell, V., Page, K. M., brickley, K.,Tedder, I. &
Dolphin, A. C. 1997 Importance of the different β subunits in the membrane
expression of the α1A and α2 calcium channel subunits: studies using a
depolarisation-sensitive α1A antibody. European Journal of Neuroscience 9:749-759.
Brickley K, Campbell V, Berrow N, Leach R, Norman RI, Wray D, Dolphin AC and
Baldwin SA (1995) Use of site-directed antibodies to probe the topography of the 2
subunit of voltage-gated Ca+2 channels. FEBS Letters 364:129-133
65
Brust PF, Simerson, McCue AF, Deal CR, Schoonmaker S, Williams ME, Velicelebi
G, Johnson EC, Harpold MM and Ellis SB (1993) Human neuronal voltage-dependent
calcium channels: studies on subunit structure and role in channel assembly.
Neuropharmacology 32:1089-1102
Burguess D.L. & Noebels J.L. (1999) Single gene defects in mice: the role of voltagedependent calcium channels in absence models. Epilepsy Res. 36:111-122.
Castellano A & Perez-Reyes (1993) Molecular diversity of Ca2+ channel beta
subunits. Biochem Soc Trans 22:483-488
Catterall W.A. (1998) Structure and function of neuronal Ca2+ channels and their
roles in neurotransmitter release. Cell Calcium 24(5/6):307-323.
Catterall W.A. (2000) Structure and regulation of voltage-gated Ca2+channels. Annual
Review of Cell and Developmental Biology 16:521–555
Cheng, L., Fu, J., Tsukamoto, A. & Hawley, R. G. (1996) Use of green fluorescent
protein variants to monitor gene transfer and expression in mammalian cells. Nature
Biotechnol. 14:606-609.
Chin D. & A.R. Means (2000) Calmodulin: a prototypical calcium sensor. Trends in
Cell Biology 10:322.
Colecraft H. M., Brody D. L. & Yue D. T. (2001) G-Protein Inhibition of N- and P/QType Calcium Channels: Distinctive Elementary Mechanisms and Their Functional
Impact. Journal of Neuroscience 21(4):1137-1147
Currie K.P. & Fox A. P.(1997) Comparison of N-and P/Q-type voltage-gated calcium
channel current inhibition. Journal of Neuroscience 17:4570-4579
Curtis BM, Catterall WA. (1986) Reconstitution of the voltage-sensitive calcium
channel purified from skeletal muscle transverse tubules. Biochemistry 11:3077–3083
DeMaria C. D., Soong T.W., Alselkhan B.A., Alvania R.S., & D.Y. Yue, 2001,
Calmodulin bifurcates the local Ca2+ signal that modulates P/Q type Ca2+ channels.
Nature 411:484.
De Jongh KS, Warner C & Catterall WA (1990) Subunits of purified calcium channels.
Journal of Biological Chemistry 265:14738-14741
De Leon, M., Y. Wang, L. Jones, E. Perez-Reyes, X. Wei, T. Wah Soong, T.P.
Snutch, & D.T. Yue. (1995). Essential Ca+2-binding motif for Ca+2-sensitive
inactivation of L-type Ca21 channels. Science 270:1502–1506.
66
Desmadryl, G., Hilaire, C., Vigues, S., Diochot, S. & Valmier, J. (1998) Developmental
regulation of T-, N- and Q-type calcium currents in mouse embryonic sensory
neurons. European Journal of Neuroscience 10:545-552.
De Waard, M., Liu, H., Walker, D., Scott, V.E.S., Gurnett, C.A., Campbell, K.P. (1997)
Direct binding of G-protein complex to voltage-dependent calcium channels. Nature
385:446-450
Doering C. J., Kisilevsky A. E., Feng Z. P., Arnot M. I., Peloquin J., Hamid J., Barr W.,
Nirdosh A., Simms B., Winkfein R. J., & Gerald W. Zamponi (2004)
A Single G Subunit Locus Controls Cross-talk between Protein Kinase C and G
Protein Regulation of N-type Calcium Channels. Journal of Biological Chemistry
279:29709-29717
Dolphin A.C. (2003) G protein modulation of voltage-gated calcium channels.
Pharmacological Reviews 55: 607-627.
Dove L.S., Abbott L.C. & Griffith W.H. (1998) Whole-cell and single-channel analysis
of P-type calcium currents in cerebellar Purkinje cells of leaner mutant mice. Journal
of Neuroscience 18(19):7687-7699.
Doyle J., Ren X., Lennon G. & Stubbs L. (1997) Mutations in the Cacnl1a4 calcium
channel gene are associated with seizures, cerebellar degeneration, and ataxia in
tottering and leaner mutant mice. Mammalian Genome 8: 113-120.
Eberst R, Dai S, Klugbauer S & Hofmann F (1997) Identification and functional
characterisation of a calcium channel gamma subunit. Pflugers Arch 433:633-637
Eckert R., & Brehm P. (1978) Ionic Mechanisms of Excitation in Paramecium. Annual
Review
of
Biophysics
and
Bioengineering
8:353-383
Ehlers M.D. & Augustine G.J. (1999) Calmodulin at the channel gate. Nature
399:105-108.
Ellinor, P. T., Yang, J., Sather, W. A., ZhanG, J. F. & Tsien, R. W. (1995) Ca2+
channel selectivity at a single locus for high-affinity Ca2+ interactions. Neuron
15:1121-1132.
Ellis SB, Williams ME, Ways NR, Brenner R, Sharp AH, Leung AT, Campbell KP,
McKenna E, Koch WJ, Hui A, Schwartz A & Harpold MM (1988) Sequence and
expression of mRNAs encoding the a1 and a2 subunits of a DHP sensitive calcium
channel. Science 241:1661-1664
Erickson M.G., Alseikhan B.A., Peterson B.Z. & D.T. Yue (2001) Preassociation of
calmodulin with voltage-gated Ca2+ channels revealed by FRET in single living cells.
Neuron 31:973.
67
Felix R., CA Gurnett., M De Waard., KP Campbell. (1997) Dissection of functional
domains of the voltage-dependent Ca2+ channel 2 subunit. Journal of
Neuroscience 17:6884-6891
Fletcher C.F., Lutz C.M., O’Sullivan T.N., Shaughnessy J.D., Hawkes R., Frankel
W.N., Copeland N.G. & Jenkins N.A. (1996) Absence epilepsy in tottering mutant
mice is associated with calcium channel defects. Cell 87:607-617.
Furukawa T., Miura R., Mori Y., Strobeck M., Suzuki K., Ogihara Y., Asano T.,
Morishita R., Hashii M., Higashida H., Yoshii M. & Nukada T. (1998) Differential
interactions of the C terminus and the cytoplasmic I-II loop of neuronal Ca2+ channels
with G-protein  and  subunits II. Evidence for direct binding. Journal of Biological
Chemistry 273(28):17595-17603.
Gregg, R. G., Powers, P. A., & Hogan, K. (1993) Assignment of the Human Gene for
the β Subunit of the Voltage-Dependent Calcium Channel (CACNLB1) to
Chromosome 17 Using Somatic Cell Hybrids and Linkage Mapping. Genomics 15,
185–187.
Hamill OP, Marty A, Neher E, Sakmann B, Sigworth FJ (1981). Improved patch-clamp
techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane
patches. Pflugers Arch 391:85-100.
Heckroth JA & Abbott LC (1994) Purkinje cell loss from alternating sagittal zones in
the cerebellum of leaner mutant mice. Brain Res 658:93-104
Herrup K & Wilczynski SL (1982) Cerebellar cell degeneration in the leaner mutant
mouse. Neuroscience 7:2185-2196
Herrup K & Kuemerle (1997) The compartmentalization of the cerebellum . Ann. Rev.
Neuro. 20:61-90
Hess E.J. (1996) Migraines in mice?. Cell 87:1149-1151.
Hille B. (1992) Ionic channels of excitable membranes. Sunderland, MA: Sinauer 2nd
edition.
Hille N. (1994) Modulation of ion-channel function by G-protein-coupled receptors.
Trends Neuroscience 17:531-536
Höfer, G. F. (1997) Intracellular Ca+2 inavtivates L-typr Ca+2 channels with a Hill
coefficient of 1 and an inhibition constant of 4 M by reducing channel´s open
probability. Biophys. J. 73:1857-1865
Hofmann F, Lacinová L & Klugbauer N (1999) Voltage-dependent calcium channels:
from structure to function. Rev Physiol Biochem Pharmacol 139:33-87
68
Hoshi T, WN Zagotta & RW Aldrich (1990) Biophysical and molecular mechanisms of
Shaker potassium channel inactivation. Science 250:533-538.
Imredy, J. P. & Yue, D. T. (1994) Mechanism of Ca+2-sensitive inactivation of L-type
Ca+2 channels. Neuron 12:1301-1318
Jay SD, Sharp AH, Kahl SD, Vedvick TS, Harpold MM & Campbell KP (1991)
Structural characterisation of the dihydropyridine-sensitive calcium channel 2subunit and the associate  dpeptides. Journal of Biological Chemistry 266:32873293
Jerng H. H., Shahidullah, M., & Covarrubias, M (1999) Inactivation gating of Kv4
potassium channels. Molecular interctions involving the inner vestibule of the pore. J.
Gen. Physiol 113:641-660
Jurado L., Chockalingam P.S. & H.W. Jarrett (1999) Apocalmodulin. Physiol. Rev.
79(3):661.
Kasai H. & Aosaki T. (1989) Modulation of Ca-channel current by an adenosine
analog mediatede by a GTP-binding protein in shick sensory neurons. Pflugers Arch
414:145-149
Klugbauer N, Lacinová L, Marais E, Hobom M & Hofmann F (1999) Molecular
Diversity of the Calcium Channel 2 Subunit. Journal of Neuroscience 19: 684-691
Klugbauer N, Dai S, Specht V, Lacinová L, Marais E, Bohn G & Hofmann F (2000). A
family of calcium channel g subunits. FEBS Letters 470:189-197
Kraus, R. L., Hering, S., Grabner, M., Ostler, D., & Striessnig, J. (1998) Molecular
Mechanism of Diltiazem Interaction with L-type Ca2+ Channels
Journal of Biological Chemistry 273: 27205–27212
Lau F.C., Abbott L.C., Rhyu I.J., Kim D.S. & Chin H. (1998) Expression of calcium
channel 1A mRNA and protein in the leaner mouse (tgla/tgla) cerebellum. Mol. Brain
Res. 59:93-99.
Lee, A., Wong, S. T., Gallagher, D., Li, B., Storm, D. R., Scheuer, T., & Catterall, W.
A. (1999). Nature 399:155–159.
Lee A., Scheuer T. & W. Catterall 2000, Ca2+/Calmodulin-dependent facilitation and
inactivation of P/Q-type Ca2+ channels. Journal of Neuroscience 20(18): 6830.
Lee A., Westenbroek R.E., F. Haeseleer, K. Palczewski, T. Scheuer & W. A. Catterall
(2002) Differential modulation of Cav2.1 channels by calmodulin and Ca2+-binding
protein 1. Nature Neuroscience 5(3):210.
69
Lee A., Wong S.T., Gallagher D., Li B., Storm D.R., Scheuer T. & Catterall W.A.
(1999) Ca2+/calmodulin binds to and modulates P/Q-type calcium channels. Nature
399:155-159.
Lehmann-Horn, F. & Jurkat-Rott, K., (1999) Voltage-gated ion channels and
hereditary disease. Physiol. Rev.79: 1317-1372.
Letts, V. A., Felix, R., Biddlecome, G. H., Arikkath, J., Mahaffey, C. L., Valenzuela, A.,
Bartlett, F. S., Mori, Y., Campbell, K. P. & Frankel, W.N. 1998: The mouse stargazer
gene encodes a neuronal Ca2+ channel gamma subunit. Nature Genetics 19:340-347
Llinás R.R., Sugimori M. & Cherksey (1989) Voltage-dependent calcium
conductances in mammalian neurons. The P channel. Ann. New York Acad. Sci.
560:103-111.
Lorenzon N.M., Lutz C.M., Frankel W.N. & Beam K.G. (1998) Altered calcium channel
currents in Purkinje cells of the neurological mutant mouse leaner. Journal of
Neuroscience 18(12):4482-4489.
McEnery M. W., Copeland, T. D. & Vance, C. L. (1998) Altered expression and
assembly of N-type calcium channel 1B and subunits in epileptic lethargic (lh/lh)
mouse. Journal of Biological Chemistry 273:21435-21438
Miller RJ, (1992) Voltage-sensitive Ca2+ Channels. Journal of Biological
Chemistry 267:1403-1406.
Mintz I. & Bean B.P. (1993) GABA receptor inhibition of p-type Ca2+ channels in
central neurons. Neuron 10:889-898.
Mori Y, Wakamori M, Oda S, Fletcher CF, Sekiguchi N, Mori E, Copeland NG,
Jenkins NA, Matsushita K, Matsuyama Z, Imoto K (2000) Reduced voltage sensitivity
of activation of P/Q-type calcium channels is associated with the ataxic mouse
mutation rolling Nagoya. Neuroscience 20: 5654- 5662.
Murphy, T. H., Worley, P. F. & Baraban, J.M. (1991) L-type voltage-sensitive calcium
channels mediate synaptiv activation of immediate early genes. Neuron 7:6235-635.
Muth J.N., Varadi G & Schwart Z.A. (2001( use of transgenic mice to study voltagedependent Ca+2channels. Trends in Pharmacological Sciences 22:526–532
Nargeot J., Dascal N. & Lester HA (1992) Heterologous expression of calcium
channels. J Membr. Biol. 126(2):97-108.
70
Neely, A., Olcese, R., Wei, V., Birnbaumer, L. & Stefani, E. (1994) C+2-dependent
inactivation of a cloned cardiac Ca+2 channel 1 subunit (1C) expressed in
Xenopus oocyte. Biophys. J 66:1895-1903.
Okayama, H., & Chen, C (1990). Calcium phosphate mediated gene transfer into
established cell lines. Methods Mol. Biol. 15:21.
Ophoff R.A., G.M. Terwindt, R.R. Frants & M.D. Ferrari (1998) P/Q type channel
defects in migraine, ataxia, and epilepsy. Tips 19:121-127.
Pate P., Mochca-Morales J., Wu Y., Zhang J.-Z., Rodney G.G., Serysheva I.I.,
Williams B.Y., Anderson M.E. & S.L. Hamilton (2000) Determinants for calmodulin
binding on voltage-dependent Ca2+ channels. Journal of Biological Chemistry
275(59): 39786.
Patton, D.E., J.W. West, W.A. Catterall, & A.L. Goldin (1992) Amino acid residues
required for fast Na+-channel inactivation: charge neutralizations and deletions in the
III-IV linker. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10905–10909
Peterson, B. Z., Lee, J. S., Mulle, J. G., Wang, Y., De Leon, M. & Yue, D. T. (2000).
Critical determinants of Ca2+-dependent inactivation within an EF-hand motif of L-type
Ca2+ channels. Biophysical Journal 78:1906-1920
Pragnell, M., DE Waard, M., Mori, Y., Tanabe, T., Snutch, T. P. & Campbell, K. P.
(1994) Calcium channel β-subunit binds to a conserved motif in the I-II cytoplasmic
linker of the α 1-subunit. Nature 368:67-70.
Qin N, Platano D, Olcese R, Stefani E, Birnbaumer L (1997) Direct interaction of Gβ
with a C terminal Gbg binding domain of the calcium channel a1 subunit is
responsible for channel inhibition by G protein coupled receptors. Proc Natl Acad Sci
USA 94:8866 – 8871.
Rojas, E., & Armstrong C.M. (1971) Sodium conductance activation without
inactivation in pronase-perfused axons. Nature New Biology. 229: 177-178
Saris N. E. L. & Carafoli E. (2005) A historical review of cellular calcium handling, with
emphasis on mitocondria. Biochemistry 70:187-194
Sidman RL. & Green MC. (1965) Retinal degeneration in the mouse. Location of the
rd locus in linkage group XVII. J Hered 56:23-29.
Singer D, Biel M, Lotan I, Flockerzi V, Hofmann F & Dascal N (1991) The roles of the
subunits in the function of the calcium channel. Science 253:1553-1557
71
Sokolov, S., Weiß, R. G., Timin, E. N. & Hering, S. (2000). Modulation of slow
inactivation in class A Ca2+ channels by β-subunits. Journal of Physiology 527: 445454
Solá C., S. Barrón, J.M. Tusell & Joan Serratosa (1999) The Ca2+/Calmodulin
signaling system in the neural response to excitability. Involvement of neuronal and
glial cells. Prog. Neurobiol 58:207.
Solá C., Barrón S., J. M. Tusell & J. Serratosa (2001) The Ca2+/calmodulin system in
neuronal hyperexcitability. IJBCB 33:439.
Starr T.V.B., Prystay W. & T.P. Snutch (1991) Primary structure of a calcium channel
that is highly expressed in the rat cerebellum. Proc. Natl. Acad. Sci. 88:5621-5625.
Stotz S. C. & Zamponi G.W. (2001) Identification of inactivation determinants in the
domain IIS6 region of high voltage-activated calcium channels. Journal of Biological
Chemistry 276:33001-33010
Stühmer, W., Ruppersberg, J. P., Schroter, K. H., Sakmann, B., Stocker, M., Giese,
K. P., Perschke, A., Baumann, A., & Pongs, 0. (1989) Molecular basis of functional
diversity of voltage-gated potassium channels in mammalian brain. EMBO J 8: 32353244,
Sutton K.S., McRory J.E., Guthrie H., Murphy T.H. & T.P. Snutch (1999) P/Q type
calcium channels mediate the activity-dependent feedback of syntaxin-1A. Nature
401:800-804.
Tanabe, T., Takeshima, H., Mikami, A., Flockerzi, V., Takahashi, H.,Kangawa, K.,
Kojima, M., Matsuo, H., Hirose, T. & Numa, S. (1987) Primary structure of the
receptor for calcium channel blockers from skeletal muscle. Nature 328:313-318.
Townsend C., Horn R. (1999) Interaction between the Pore and a Fast Gate of
theCardiac Sodium Channel. J. Gen. Physiol. 113(2) 321-332
Tsuji W. & Meier H. (1971) Evidence for allelism of leaner and tottering in the mouse.
Genet Res. 17:83-88.
Van Eldik L.J. & Watterson D.M. (1998) Calmodulin and signal transduction.
Academic Press, New York. 471
Wakamori M., Yamazaki K., Matsunodaira H., Teramoto T., Tanaka I., Niidome T.,
Sawada K., Nishizawa Y., Sekiguchi N., Mori E., Mori Y. & Imoto K. (1998) Single
tottering mutations responsible for the neuropathic phenotype of the P-type calcium
channel. Journal of Biological Chemistry 273(52):34857-34867.
Walker D., Bichet D., Campbell K.P. & de Waard M. (1998) A 4 isoform-specific
interaction site in the carboxyl-terminal region of the voltage-dependent Ca2+ channel
1A subunit. Journal of Biological Chemistry 273(4):2361-2367.
72
West, J.W., D.E. Patton, T. Scheuer, Y. Wang, A.L. Goldin, & W.A. Catterall. (1992) A
cluster of hydrophobic amino acid residues required for fast Na+-channel inactivation.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89: 10910-10914
Westenbroek R.E., Sakurai T., Elliot E.M., Hell J.W., Starr T.V.B., Snutch T.P. & W.A.
Catterall (1995) Immunochemical identification and subcellular distribution of the 1A
subunits of brain calcium channels. Journal of Neuroscience 15(10):6403-6418.
Wheeler D.B., Randall A., Sather W.A. & Tsien R.W. (1995) Neuronal calcium
channels encoded by the 1A subunit and their contribution to excitatory synaptic
transmission in the CNS. Prog. Brain Res. 105:65-78
Wiser O, Trus M, Tobi D, Halevi S, Giladi E & Atlas D (1996) The 2/ subunit of
voltage sensitive Ca2+ channels is a single transmembrane extracellular protein
which is involved in regulated secretion. FEBS Letters 379:15-20
Yamaguchi H, Okuda M, Mikala G, Fukasawa K & Varadi G (2000) Cloning of the 2a
subunit of the voltage dependent calcium channel from human heart: cooperative
effect of 2/ and 2a on the membrane expression of the 1C subunit. Biochem
Bioph Res 267:156-163
Yoshiro Saimi & Ching Kung (2002) Calmodulin as an ion channel subunit. Annu.
Rev. Physiol. 64:289–311.
Zamponi G.W. & T.P. Snutch (1998) Modulation of voltage-dependent calcium
channels by G proteins. Curr Opinion Neurobiol. 8:351-356.
Zhang, J. F., Ellinor, P. T., Aldrich, R. W. & Tsien, R. W. (1994). Molecular
determinants of voltage-dependent inactivation in calcium channels. Nature 372:97100
Zhuchenko O. Bailey J., Bonnen P., Ashizawa T., Stockton D.W., Amos C., Dobyns
W.B., Subramony S.H., Zoghbi H.Y. & Lee C.C. (1997) Autosomal dominant
cerebellar ataxia (SCA6) associated with small polyglutamine expansion in the alpha
1A-voltage-dependent calcium channel. Nat. Genet. 15: 62-69.
Zong S, Zhou J, Tanabe T, (1994) Molecular determinants of calcium-dependent
inactivation in cardiac L-type calcium channels. Biochem. Biophys. Res. Com.
201: 1117-1123.
Zühlke R. D.,Pitt G. S., Deisseroth K., Tsien R. W. & Reuter H. (1999) Calmodulin
supports both inactivation and facilitation of L-type calcium channels. Nature 399:159162
73
Zwingman T., Neumann P.E. & Noebels J.L. (2001) Rocker is a new variant of the
voltage-dependent calcium channel gene Cacna1a. Journal of Neuroscience 21:
1169-1178.
74