Tema 3: medios de cultivo, esterilización y métodos de siembra.

Tema 3: medios de cultivo, esterilización y métodos de siembra.
Medio de cultivo: Es una mezcla equilibrada de nutrientes que, en concentraciones
adecuadas y condiciones físico-químicas óptimas (de temperatura, pH…) permiten un buen
crecimiento de los microorganismos.
· Medio definido: es un medio de cultivo general, en el que crecen casi todos los organismos.
Se conoce exactamente su composición (se crea a partir de compuestos puros) y permite
repetir los resultados obtenidos.
· Medio complejo o indefinido: Aquel en el que se desconoce la composición química exacta,
porque se prepara a partir de extractos naturales (por ejemplo, a partir de carne). Estos
medios suelen ser llamados caldos, y pueden formar agar si los solidificamos.
· Medio selectivo: Aquel que favorece el crecimiento de ciertos microorganismos, mientras
que inhibe el crecimiento de otros. Se añaden colorantes al medio.
· Medio diferencial: Es aquel que identifica colonias de un determinado microorganismo.
· Medio de enriquecimiento: Se puede aislar un tipo de microorganismo de una gran colonia
mixta.
Métodos físicos para el control microbiano
Una vez preparado un medio de cultivo, tenemos que esterilizarlo.
Esterilización: Muerte y eliminación de todos los microorganismos que contiene un objeto o
sustancia y que se encuentran acondicionados de tal forma que no pueden contaminarse de
nuevo.
· Calor: Puede ser húmedo o seco.
El húmedo produce la desnaturalización y coagulación de las proteínas. Las condiciones son
de 121ºC/1atm de sobrepresión/20 min en un autoclave. Se genera vapor de agua, y
esteriliza los medios de cultivo. Las ventajas de utilizarlo es la destrucción de bacterias y
esporas a corto plazo de forma económica. Además, utilizamos agua que no deja residuos ni
produce deterioro en los materiales que utilizamos. Las desventajas es que existen
compuestos lábiles al calor, y los instrumentos metálicos son dañados.
El calor seco ataca también a las proteínas y lípidos. Las condiciones son diferentes y menos
efectivas, y se utiliza un horno Pasteur. Por ejemplo, a 140ºC necesitamos 5 horas. A 160ºC
necesitamos 2 horas. Las ventajas es que pueden esterilizarse instrumentos metálicos sin
miedo a que se oxiden, y también sustancias en polvo, viscosas, vidrios…
· Agentes químicos: Su efectividad depende de la concentración del agente utilizado, y del
tiempo de exposición.
· Antisepsia: Agente que reduce y controla la presencia de microorganismos potencialmente
patógenos sobre piel o mucosas.
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Alcohol: 50 – 70 %. Dañan la membrana de los microorganismos y desnaturalizan proteínas
celulares.
Peróxido de hidrógeno: Antiséptico débil, con capacidad oxidante y formador de radicales
libres. Se utiliza para desinfectar superficies, brick…
· Desinfectante: Agente que elimina la carga microbiana total en superficies inanimadas
(habitaciones, mesas, campanas…).
Cloro: Utilizado en forma de lejía. Actúa sobre proteínas y ácidos nucléicos.
Óxido de etileno: Esterilización gaseosa utilizado en la industria farmacéutica. Se
utiliza para desinfectar materiales termosensibles.
· Filtración: membranas de celulosa con distintos tamaños de poros. En microbiología
utilizamos filtros de 0,45 µm, o 0,22µm. Estas membranas no retienen ni virus ni
micoplasmas. Se utiliza para esterilizar emulsiones oleosas o soluciones termolábiles
(antibióticos, aceites, vitaminas).
Métodos de siembra
Utilizamos un asa de siembra. Tenemos que esterilizarla primero, luego pasamos la boca del
tubo de cristal por el mechero, e introducimos el asa de siembra. Por tensión superficial, se
adhiere una pequeña cantidad de medio de cultivo (inóculo). Podemos sembrar ese inóculo en
otro tubo (previamente pasado por el mechero) o en una placa de Petri.
Todo esto, siempre cerca del mechero, para trabajar en un ambiente estéril.
· Siembra en estrías en placa: Lo primero es coger un inóculo. Hacemos un zig-zag o estría
sobre la placa de agar (en una zona determinada). Partiendo de esta primera zona, y
calentando previamente el asa de siembra, cogemos una parte de los primeros
microorganismos y volvemos a hacer un zig-zag. Este proceso se repite tantas veces como sea
necesario hasta que observemos colonias independientes. Colonias axénicas.
Después podemos coger un inóculo de cada colonia y ponerlos en una placa independiente,
para tener placas son un solo tipo de microorganismos (colonias axénicas).
· Siembra en profundidad: Partimos de la muestra inicial con microorganismos que queremos
estudiar. Cogemos 1 mL de la muestra inicial con 9 mL de medio de cultivo. Después, 1 mL del
tubo que acabamos de utilizar con 9 mL de medio de cultivo. Así varias veces (al menos 6).
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Después, se toman 100 L con una pipeta, y se esparcen en una placa de Petri (con bolitas
metálicas, con el asa de siembra…). Esto se incuba durante el tiempo necesario y con la
temperatura óptima del microorganismo. Al día siguiente, tenemos una placa con colonias
axénicas.
Morfología de las colonias bacterianas
Hay que observar la forma, elevación, márgenes, colores…
Conservación de cultivos bacterianos
· Refrigeración: Mantiene cultivos durante un corto periodo de tiempo. La temperatura a la
que lo conservamos es de 4ºC. Como mucho, podemos conservar así un cultivo un mes.
Después, podemos volver a sembrar en otra placa y empezar de nuevo el proceso.
· Ultracongelación: de -20ºC a -95ºC. Antes de congelarlo, añadimos un preservante para que
la congelación y la descongelación sean suaves. Estos preservantes pueden ser glicerol, leche
en polvo… El tiempo de conservación puede ser 1 año o 2.
· Liofilización: Proceso de congelación, desecación, y puesta en vacío.
· Colecciones de cultivo tipo: Instituciones públicas donde mantienen al microorganismo a lo
largo del tiempo. Estudian la mejor forma de conservarlo, lo renombran con un nombre y un
número (aunque ya tiene un nombre inicial) y lo mantienen a disposición del que pueda
necesitarlo. La institución española es la CECT. La americana es la ATCC, la alemana es la DSM.
Crecimiento microbiano
Se trata del incremento del número de células o microorganismos. En la célula inicial se crea
un septo en el centro con la membrana plasmática y la pared celular. Previamente ha
duplicado todos sus componentes, por lo que al dividirse, las células hijas son exactamente
iguales que la célula madre. Esta división se denomina en bacterias “fisión binaria”.
El tiempo requerido depende de varios factores: La nutrición a disposición del
microorganismo, la genética, el tipo de célula…
El estudio del crecimiento bacteriano se hace a partir de una curva de crecimiento.
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· Cultivo discontinuo
Se trata de un envase con un medio de cultivo y células en su interior. El número de células va
en aumento, mientras que el número de nutrientes disminuye.
· Fase de latencia: las células se adaptan al medio, por lo que aún no crecen demasiado. Esta
fase depende en gran medida de los factores presentes en el medio.
· Fase exponencial o logarítmica: las células crecen rápidamente. Es la fase más interesante a
nivel comercial, de estudios y experimentos…
· Fase estacionaria: El crecimiento se paraliza debido a la falta de nutrientes.
· Fase de muerte: Ya no hay nutrientes, en cambio sí hay muchos desechos. Las células no
pueden alimentarse y mueren.
El tiempo de generación es el tiempo necesario para que una población celular se duplique.
Se puede calcular sabiendo el número inicial de microorganismos y la velocidad de división.
La velocidad de crecimiento de un cultivo (denominada K) es K = n/t
n = es el número de generaciones en un tiempo t dado. n =( Log
El tiempo de generación de un cultivo (g) es:
- Log
)/0.301
g = 1/k
Ejercicio: una población bacteriana aumenta de 103 a 109 células en 10 horas, ¿cuál es la
velocidad de crecimiento (k) y cuál es el tiempo de generación del cultivo (g)?
(Log 109 – log103) / 0.301 10 = k => (9 – 3 ) / 3.01 = k =>
k = 2 generaciones/hora
g = ½ = 0.5 minutos por generación, es decir, cada 30 minutos se divide.
A partir de una curva de crecimiento se puede calcular la velocidad de crecimiento viendo la
diferencia en el eje Y entre 2 puntos.
· Cultivo continuo
Se trata de un cultivo en el que continuamente insertamos nutriente fresco, y sacamos células
crecidas. En este tipo de cultivos mantenemos siempre la fase logarítmica, que es la más
productiva. Se utiliza un quimiostato, que consta de un reservorio (con medio de cultivo
nuevo), un recipiente de cultivo, una bomba peristáltica (que introduce y saca el material
crecido) y un desagüe.
Factores que afectan al crecimiento de microorganismos
· Temperatura
Es el factor que más afecta a los microorganismos. Cada especie tiene temperaturas mínimas
y máximas a la que pueden vivir, y una temperatura óptima.
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· Organismos Psicrófilos: Crecen a temperaturas muy bajas, entre 0ºC y 20ºC. Su
temperatura óptima es de 15 ºC. Suelen vivir en océanos o en el hielo. Su adaptación se debe
a que sus enzimas tienen una mayor cantidad de hélices α que de láminas β en su estructura
secundaria. Sus proteínas tienen más aminoácidos polares, y sus membranas son de ácidos
grasos no saturados (algunos psicrófilos tienen en su membrana ácidos grasos poliinsaturados).
· Organismos Mesófilos: Crecen a temperaturas moderadas, entre 15 – 20 ºC y 45ºC.
Su temperatura óptima es de 20 – 45ºC. Son la inmensa mayoría de los microorganismos
conocidos (sobre todo patógenos).
· Organismos Termófilos: Crecen a altas temperaturas, entre 45ºC y 65ºC. Su
temperatura óptima es de 55 – 65ºC. Existen organismos hipertermófilos que tienen una
temperatura óptima de 80 ºC, y siempre son arqueas. Viven en las tuberías de agua caliente,
zonas volcánicas, fumarolas… Sus membranas tienen ácidos saturados y no poseen ácidos
grasos en su membrana, sino hidrocarburos de cadena larga unidos por enlaces éter. Algunos
ejemplos son Pyrococcus ocultum (hipertermófila) o Thermus aquaticus (termófila).
· Niveles de pH
La mayoría de ambientes tienen un pH de 5.9.
· Organismos acidófilos: Viven en pH muy ácidos. Existen bacterias (Thiobacillus),
arqueas (sulfolobus) y hongos y algas, que utilizan minerales de azufre y hierro que van a
oxidar y producen ácido sulfúrico.
· Organismos alcalófilos: Viven en pH muy alcalinos. Existen algunas bacterias como
las Bacillus, algunas arqueas como las Natronobacterias, algunas algas y hongos. Producen
suelos altamente carbonatados y bicarbonatados, produciendo enzimas importantes en la
industria.
· Agua y presión osmótica
El agua es necesaria para todos los seres vivos, ya que en ella se encuentran diferentes sales
necesarias para la vida.
La presión osmótica también es un factor limitante, ya que si la presión en el exterior de la
célula es mayor que en el interior, la célula tenderá a asimilar agua y a hincharse. Si es al
contrario, el agua saldrá de la célula, dejándola seca.
· Halófilos: Son organismos que viven en presencia de concentraciones elevadas de
sales. Los menos tolerantes viven en ambientes con un 1 – 6 %, los moderados en ambientes
de 6 – 15 % y los extremos en concentraciones de 15 – 30 %.
· Osmófilos: Son capaces de tolerar altas concentraciones de azúcar.
· Xerófilos: Capaces de vivir en ambientes muy secos.
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Además, las arqueas son capaces de vivir en zonas de altas concentraciones de sal, por lo que
las salinas adquieren a veces un color pardo – morado.
· Presencia de oxígeno
· Aerobios: Pueden vivir en ambientes con un contenido de oxígeno en el aire de hasta
un 21%.
· Microaerófilos: Son aerobios, pero solo viven en ambientes con un contenido en
oxígeno menor al del aire.
· Anaerobios aerotolerantes: No necesitan el oxígeno para vivir, pero lo toleran.
· Anaerobios obligados o estrictos: No toleran el oxígeno, por lo que viven en
ambientes con algún otro compuesto mayoritario, como el hidrógeno.
Medición del crecimiento de un cultivo
Existen medidas indirectas (turbidez, peso, actividad metabólica…) y medidas directas
(contaje total de células, contaje de viables…)
Podemos determinar el número total de células mediante contaje directo. Necesitamos una
rejilla de unas dimensiones determinadas, en las que contamos las células existentes. Estos
datos pueden después extrapolarse al resto de la colonia. El problema de emplear este
método es que no es posible distinguir las células vivas de las muertas, y las células pequeñas
no son fácilmente visibles.
También podemos determinar el número de células estudiando el número de viables, o
células capaces de reproducirse. Se hace primero una dilución seriada (siempre teniendo en
cuenta que estos datos se extrapolarán al total) y el resultado se deja incubar para que forme
colonias axénicas. Contando el número de colonias, podemos estimar el número del que
partimos.
Turbidez
Podemos emplear un espectrómetro para estudiar la turbidez de un cultivo, y por tanto el
número aproximado de células (las células dispersan la luz que les atraviesa).
Control químico del crecimiento
Podemos controlar el crecimiento de nuestros microorganismos con agentes químicos o
antibióticos.
· Origen del antibiótico
· Natural: Sin modificaciones químicas.
· Sintético: Producido de forma química.
· Semisintético: Compuesto natural que es parcialmente modificado.
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· Efecto del antibiótico
· Agente microbicida: Compuesto que mata a los microorganismos.
· Bactericida: mata bacterias.
· Fungicida: Mata hongos.
· Viricida: mata virus.
· Bactenolíticos: Mata microorganismos por lisis celular.
· Agente estático: Inhibe el crecimiento de microorganismos.
· Bacteriostático: Inhibe el crecimiento de bacterias.
· Fungistático: Inhibe el crecimiento de hongos.
· Virustático: Inhibe el crecimiento de virus.
· Espectro activo del antibiótico
· De amplio espectro: Actúan sobre gran parte de los microorganismos (bacterias
Gram + o Gram -, otros organismos…).
· De corto espectro: Actúan sobre un determinado grupo de microorganismos, por
ejemplo sólo los Gram +, o los Gram -…
· Mecanismos de acción del antibiótico
· Inhibición de la síntesis de pared celular: Son los más selectivos, ya que las bacterias
tienen pared celular, pero las eucariotas no. Penicilina, cefaloforinas, vacoumicina, tetraciclina,
estrectomicina…
· Inhibición de síntesis proteica.
· Inhibición de síntesis de ácidos nucléicos o daños en membranas celulares.
· Antimetabólicos.
Medición de la actividad antimicrobiana
La actividad antimicrobiana puede medirse a través de ciertas concentraciones:
· CMI (Concentración mínima inhibitoria): Es la mínima concentración de un fármaco
que inhibe el crecimiento de un cierto patógeno. Tenemos un patógeno crecido formando un
césped en una placa, sobre la que ponemos discos con concentraciones cada vez mayores de
un tipo de antimicrobiano. Dejamos crecer a 37ºC y observamos cuál es el disco con menor
concentración que ha inhibido el crecimiento del patógeno.
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· CML (Concentración mínima letal): Es la mínima concentración de un fármaco capaz
de matar a un patógeno dado.
Mecanismos de resistencia de microorganismos frente a antibióticos
· Carecimiento de pared celular: Los antibióticos que actúan a este nivel, no funcionarán.
· Impermeabilidad al antibiótico.
· Presencia de enzimas capaces de inactivar al antibiótico.
· Modificación del centro diana: Los antibióticos no pueden por tanto reconocer el sitio de
actuación.
· Bombeo de los antibióticos hacia el exterior: A través de las translocasas.
· Intercambio genético entre microorganismos: Intercambio de plásmidos de resistencia, con
genes que codifican para la resistencia frente a antibióticos.
Antifúngicos
Los productos antifúngicos no matan nunca al organismo, ya que se trata de un eucariota. Solo
pueden inhibir su crecimiento, por lo que son micostáticos. Además, los hongos no tienen
pared celular.
Antivirales
Los virus necesitan una célula huésped para desarrollarse, por lo que los antivirales buscan
etapas vitales en las que poder actuar sin causar daño a la célula.
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