Tema 4 - BioScripts
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Genética Microbiana Tema 4 Mutagénesis Mutagénesis = inducción de mutaciones Mutágeno = agente físico o químico que induce mutaciones Mutágeno = agente físico o químico que aumenta la frecuencia de mutaciones espontáneas Mutación espontánea = producida en ausencia de mutágenos Mutación espontánea = debida a errores de la maquinaria celular y a daños asociados al metabolismo Replicación DNA DNA Errores Transcripción RNA Proteínas Metabolismo Replicación DNA DNA Errores Transcripción RNA Proteínas Daños Metabolismo Replicación del DNA DNA polimerasa III DNA polimerasa I Heteromultímeros Contienen una subunidad autocorrectora 3’ G – A – C – T – A – G – G – A – C – T – 5’ C – T – G – A – T – T Exonucleasa 3’ 5’ 3’ G – A – C – T – A – G – G – A – C – T – 5’ C – T – G – A – T – C – C – T – G – A... Tasa de error (en E. coli) 10-10 por par de nucleótidos Autocorrección de la DNA Pol III (“proofreading”) Reparación de emparejamientos erróneos (“mismatch repair”) 3’ G – A – C – T – A – G – G – A – C – T – 5’ C – T – G – A – T – C – T – T – G – A... Replicación 3’ G – A – C – T – A – G – A – A – C – T – 5’ C – T – G – A – T – C – T – T – G – A... 3’ G – A – C – T – A – G – G – A – C – T – 5’ C – T – G – A – T – C – T – T – G – A... Corrección de emparejamientos erróneos producidos durante la replicación Problema: ¿corregir a G-C o a A-T? Solución: distinguir cuál es la cadena molde CH3 adenina N NH NH2 6-metil-adenina Formación de 6meA: postreplicativa DNA adenina metiltransferasa (Metilasa Dam) Diana de Dam: 5’-GATC-3’ Frecuencia esperada/observada en los genomas de E. coli and Salmonella: 3-5 sitios GATC / kb Número total de sitios GATC en el genoma: > 20,000 5’ 3’ GATC CTAG 3’ 5’ Replicación 5’ 3’ GATC CTAG 3’ 5’ Metilación 5’ 3’ GATC CTAG 3’ 5’ DNA transitoriamente hemimetilado 5’ A C GATC CTAG A C GATC CTAG MutS A C MutS GATC CTAG MutL MutH A C MutS MutL GATC CTAG 5’ 5’ A C GATC CTAG 5’ RecJ 5’ A GATC 3’ 5’ A GATC 3’ Pol III Mutantes sin autocorreción Mutantes sin reparación de emparejamientos erróneos (Dam-, MutH-, MutL- o MutS- ) Frecuencias más altas de mutación espontánea (Mutantes “mutadores”) GTCTGGCTGGCTGGCTGGC FS5, FS25, FS45, FS65 5’- GTCTGGCTGGCTGGC-3’ FS2, FS84 GTCTGGCTGGC Mutágeno = agente físico o químico que aumenta la frecuencia de mutaciones espontáneas F Q Radiaciones ionizantes Radiaciones no ionizantes (UV) Análogos de bases Sustancias intercalantes Oxidantes Alquilantes Radiaciones ionizantes Electromagnéticas: rayos X, rayos γ Partículas subatómicas: rayos α, β, cósmicos, protones y neutrones producidos en las reacciones nucleares, etc. Roturas en el DNA Alteración de bases Radicales libres H20 H2 e- H20 H20+ + e- 0+ + H 20 H+ + OH OH- H20* . +H . . . OH + H Frecuencia de mutaciones letales (%) Inducción de mutaciones por rayos X 16 8 2 2000 4000 6000 Dosis (Roentgen) 1 Roentgen = cantidad de radiación que produce 2 x 109 pares de iones en 1 cm3 de agua Radiación ultravioleta Absorción selectiva a 260 nm Dímeros de pirimidina Mutágenos químicos 1. Análogos de bases O guanina adenina 2-aminopurina 2AP: Puede emparejarse con T y con C CG C 2AP Transición CG T 2AP TA TA 5BU: Puede emparejarse con A y con G TA 5BU A CG 5BU G Transición TA CG Mutágenos químicos 2. Agentes intercalantes 3’AGGAAATTTTTTA 3’AGGAAATTTTTTA 5’TCCTTTAAAAAAT 5’TCCTTTAAAA–AT T -1 +1 1 En secuencias codificadoras de proteína, DESFASE 2 En sitios de unión de proteínas reguladoras, posibilidad de unión alterada Consecuencias Mutágenos químicos 3. Agentes oxidantes OH O2 . . Defensa celular ??? Superóxido dismutasa H2O2 Catalasa Timina Adenina Guanina Timin-glicol Diamino-formamido-pirimidina Diamino-hidroxiformamido-pirimidina Mutágenos químicos 4. Agentes alquilantes Metanosulfonato de etilo (MMS) Etanosulfonato de etilo (EMS) Nitrosoguanidina Dietilsulfato Metilación y/o alquilación de bases (-CH3, -CH2-CH3) N1-Alquil-Adenina N3-Alquil-Adenina N7-Alquil-Adenina N3-Alquil-Guanina N7-Alquil-Guanina O6-Alquil-Guanina N3-Alquil-Citosina O2-Alquil-Citosina N3-Alquil-Timina O2-Alquil-Timina O6-Alquil-Timina Otros tipos de daño en el DNA Mitomicina Cis-platino Hidroxilamina (etc.) Entrecruzamiento de cadenas Desaminación de la citosina (C U) Reparación del DNA 1. Reversión del daño (fotorreactivación) 2. Escisión y resíntesis 3. Recombinación DNA glicosilasa Endonucleasa de incisión DNA glicosilasa Endonucleasa de sitio apurínico/ apirimidínico Exonucleasa DNA polimerasa Ligasa Coordinación de sistemas de reparación: la respuesta S.O.S. RecA RecA RecA RecA RecA LexA RecA RecA Autodigestión Desrepresión del regulón S.O.S. Regulón SOS: conjunto de operones regulados por LexA p LexA AUG UAA caja S.O.S. p AUG caja S.O.S. UAA LexA autodigerido - - RecA activada Daño en el DNA - Regulón SOS: jerarquía de genes + + + Genes de reparación por escisión Gen sulA (inhibición de la división celular) Genes dinB y umuDC (DNA polimerasas propensas a error) RecBCD RecJ RecA RuvA RecG Helicasas Ligasa Ejemplo de la importancia de la recombinación como mecanismo de reparación: Los mutantes de Salmonella deficientes en recombinación no producen infección Patogénesis de Salmonella 6 días bazo hígado Invasión del epitelio intestinal Supervivencia en macrófagos Gastroenteritis Fiebre tifoidea Tipos de mutaciones producidas por diferentes mutágenos Sustituciones Espontáneas Análogos de bases Agentes alquilantes Agentes intercalantes Inducción de SOS Desfases Inserciones + + + + - + -/+ - + + + + Deleciones + + Irradiación Cultivo en fase exponencial Recrecimiento en la oscuridad Escrutinio o selección Cultivo en fase exponencial étodos de Gen Mezclar una alícuota conBacteriana el mutágeno ética Lavar para eliminar mutágeno éticael Bacteriana (si es necesario) Recrecimiento Escrutinio o selección Ejemplo de escrutinio: búsqueda de auxótrofos étodos de Gen étodos de Gen é é Cultivo recrecido Medio completo Medio mínimo Enriquecimiento con penicilina Sólo crecen los protótrofos Crecen todos Cultivo en medio mínimo Cultivo en medio rico Añadir penicilina 1 2 3 4 5 6 Ade Gua Cys Met Thi 7 His 8 Phe Tyr 9 Glu Asn Ura Asp Arg 10 Thy Ser DAP Gly Leu Ile Lys Val Trp Thr Pro Glt 1 2 3 4 5 6 Ade Gua Cys Met Thi 7 His 8 Phe Tyr 9 Glu Asn Ura Asp Arg 10 Thy Ser DAP Gly Leu Ile Lys Val Trp Thr Pro Glt 1 2 3 4 5 6 Ade Gua Cys Met Thi 7 His 8 Phe Tyr 9 Glu Asn Ura Asp Arg 10 Thy Ser DAP Gly Leu Ile Lys Val Trp Thr Pro Glt Fenotipos seleccionables: facilitan la detección de mutantes Ejemplos: Nar- Resistencia a clorato Gpt- Resistencia a azaguanina Gyr- Resistencia a ácido nalidíxico His- Osmorresistencia (en fondo Hisc) Fuc- Crecimiento con propanodiol Ura3 - Crecimiento en Acido fluoroorótico Fenotipos seleccionables: facilitan la detección de mutantes Silvestre Ura3 FOA Mutante ura3 FOA Compuesto tóxico Escrutinios bacterianos para la detección de carcinógenos Bruce Ames, ~1970: Agentes carcinogénicos para humanos son mutagénicos para las bacterias Reversión HisHis+ étodos de Gen étodos de Gen é é Medio mínimo Medio mínimo + carcinógeno Ensayo de Ames étodos de Gen X no es un mutágeno é étodos de Gen é Medio mínimo + sustancia X én Medio mínimo é Medio mínimo + sustancia X X es un mutágeno
