GUIÓN DE PRÁCTICAS DE GENÉTICA

GUIÓN DE PRÁCTICAS
DE
GENÉTICA
3º CC. MAR 2005/06
Área de Genética de la Universidad de Vigo
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LISTADO DE PRÁCTICAS
PRÁCTICA 1. Inferencia y verificación de proporciones mendelianas en maíz.
PRÁCTICA 2. Manejo de Drosophila en el laboratorio.
PRÁCTICA 3. Conceptos de genética mediante simulación por ordenador.
PRÁCTICA 4. Seminarios de problemas.
AULAS Y LABORATORIOS
LABORATORIO 25 DE GENÉTICA. Prácticas 1 y 2
El laboratorio 25 está en el 3º piso, Bloque B, Edificio de Ciencias Experimentais
AULAS DE INFORMÁTICA. Práctica 3
Las aulas de informáticas están en el 1º piso, Bloque D, Edificio de Ciencias Experimentais.
AULAS DE DOCENCIA. Práctica 4
Las aulas de docencia están en el 1º piso, Bloque C, Edificio de Ciencias Experimentais.
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PRÁCTICA 1: INFERENCIA Y VERIFICACIÓN DE PROPORCIONES
MENDELIANAS EN MAÍZ
OBJETIVOS
-
Aprendizaje de la inferencia mendeliana
Utilización de la prueba Ji-cuadrado en Genética
-
Interés y aplicaciones del organismo de estudio
El ciclo biológico del maíz
El origen del maíz como especie
El maíz en experimentación genética
Métodos de muestreo
Verificación de hipótesis nulas: homogeneidad
Estimación de proporciones fenotípicas en cruzamientos
CONTENIDOS
PLAN DE TRABAJO
I.
Métodos de muestreo de la variabilidad fenotípica
II. Planteamiento y verificación de hipótesis genéticas: casos simples (mazorcas grupo I)
III. Planteamiento y verificación de hipótesis genéticas: casos complejos (mazorcas grupo II)
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
Strickberger, Genética (1985)
Fincham, Genética (1986)
Levine L & Schwartz N., Laboratory exercises in genetics (1973)
3
INTRODUCCIÓN
El maíz es popularmente conocido por su importancia alimentaria y económica. Ha sido el
alimento básico de las culturas precolombinas y un sustento principal de las economías locales
durante gran parte del siglo XX. La importancia comercial del maíz se basa en:





Sus propiedades nutritivas
Su alta productividad
La facilidad de su cultivo y adaptabilidad
La posibilidad de conservación y almacenamiento a largo plazo
La variabilidad fenotípica de impacto comercial
Además de su importancia comercial, esta especie ha tenido una considerable importancia
científica en la genética de plantas vasculares, debido a las ventajas experimentales que permite
su biología:
 Es fácil de cultivar y de manipular para efectuar cruces dirigidos
 Presenta variabilidad genética para caracteres fenotípicos
 Es un sistema genético cómodo con 10 pares cromosómicos visibles
Ciclo de vida y biología
El maíz es una planta angiosperma monoica con sexos separados en inflorescencias. Su nombre
científico es Zea mays (n=10). Posee un ciclo de vida con alternancia entre una fase gametofítica y
una esporofítica, aunque la primera está muy reducida. Como planta representativa del tipo C4
(capaces de fijar directamente el CO2), posee un crecimiento rápido, y no necesita suelos muy
fertilizados. La planta crece durante aproximadamente cinco meses hasta que se desarrollan las
inflorescencias masculinas y femeninas. Llegado este momento es posible manipular la
fecundación, bien protegiendo las inflorescencias femeninas, bien cortando las masculinas antes
de que maduren. Las inflorescencias masculinas pueden utilizarse para polinizar hasta 500
inflorescencias femeninas. Tras la fecundación, se desarrolla el fruto en forma de mazorca que
agrupa a un conjunto de granos con las semillas. Muchos caracteres genéticos que afectan al
fenotipo de los granos pueden analizarse sobre la mazorca, ya que sus granos constituyen una
progenie numerosa del cruzamiento parental. En 1977 se conocían ya 350 loci individuales que
afectan al fenotipo de la planta o del grano.
Origen del maíz comercial
Hoy en día se barajan varias hipótesis para explicar el origen del maíz:
 A partir de un pariente próximo (Zea mexicana), con el que aún hibrida.
 A partir de una especie extinguida parecida a Zea mexicana
 A partir de una especie extinguida parecida a Zea mays
La mayoría de investigadores coinciden en que la planta de maíz, tal como se conoce
actualmente, se originó por selección artificial desarrollada consciente o inconscientemente
durante los últimos 10.000 años. Se sabe por restos arqueológicos que los indios mexicanos
cultivaban y seleccionaban sus variedades de maíz desde hace más de 5000 años (se tienen
registros similares de manipulaciones para mejorar variedades de palmeras datileras en el Egipto
de los faraones). Ello ha llevado a una inmensa diversificación regional de variedades
identificables por caracteres fenotípicos de la mazorca, tal como ya hizo constar en su día Charles
Darwin.
El maíz en la experimentación genética
La planta del maíz se ha utilizado en todas las ramas de la genética. Ha sido relevante en el
desarrollo de la genética mendeliana clásica, y la citogenética, especialmente a mediados del
siglo pasado (experimentos de Chrighton, McClintock, etc.). Además de su uso en investigación
genética básica, también ha sido una especie sometida a mejora por métodos de genética
cuantitativa:
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



Selección de progenitores y selección masal.
Obtención de cepas consanguíneas y de sus variedades híbridas.
Hibridación con especies relacionadas para conseguir resistencia a plagas
Transgénesis
Plan de trabajo
Para esta práctica se utilizan mazorcas comerciales obtenidas de la empresa Carolina Biological
Supply (USA). Estas mazorcas surgen de diversos cruzamientos con progenitores que difieren en
uno o varios genes que afectan al color o la consistencia del grano. El fin último de la práctica es
que los alumnos deduzcan los genes causantes de la segregación en un determinado cruzamiento,
a partir del conocimiento del fenotipo de los padres y de los granos en la descendencia, así como
de algunas particularidades de la biología de la especie. Los cruzamientos (mazorcas) están
clasificados por (presumible) orden de dificultad desde los más fáciles (grupo I) a los más
complejos (grupo II). Paralelamente se introducen la aplicación básica de las pruebas de Jicuadrado de homogeneidad y contingencia. Durante la práctica, también se plantearán, con
ejemplos, algunos de los problemas inherentes al método científico y a las pruebas de hipótesis.
Los objetivos concretos de esta práctica de cara al alumno son:







El planteamiento de un diseño experimental para resolver un problema biológico
La elaboración correcta de la hipótesis nula H0
La aplicación de distintas estrategias de muestreo
La estima de proporciones fenotípicas
La elaboración de hipótesis bajo inferencia mendeliana
La verificación de hipótesis.
El análisis de algunos mecanismos epistáticos
Materiales
En la tabla se muestran los códigos de las mazorcas de maíz y el fenotipo de los progenitores (P
púrpura, R rojo, A amarillo, B blanco). Es importante reflexionar sobre el hecho de que la
variabilidad no depende del genotipo de la hembra.
GRUPO I (color o forma)
GRUPO II (color)
6500 (P X P)
6690 (R X R)
6520 (R X R)
6700 (A X A)
6502 (P X A)
6680 (A X A)
6522 (R X B)
6670 (P X P)
6660 (P X P)
6662 (P X B)
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DESARROLLO DE LA PRACTICA
I. METODOS DE MUESTREO
1) ¿Influyen los métodos de conteo de un mismo fenómeno biológico sobre los resultados?
2) Las muestras obtenidas por distintos investigadores, ¿tienen la propiedad aditiva?
3) ¿Qué es una hipótesis nula?
4) ¿Cuál sería la hipótesis nula para enfocar la resolución de la primera pregunta?
5) ¿Qué metodología seguiremos para probar la hipótesis nula?
6) ¿Con qué herramienta estadística podemos comprobar la hipótesis nula?
Si has contestado adecuadamente a las cuestiones anteriores tienes ya el diseño experimental
necesario para comenzar a resolver el problema. Ahora sigue estos pasos:
7) Siguiendo algún método de muestreo individual sobre las mazorcas (por ejemplo, se pueden
elegir granos al azar, de filas, de columnas, en diagonal etc.), registra el fenotipo de 30
granos (individuos) y el código de la mazorca a la que corresponden. El conteo sobre cada
mazorca se puede hacer por parejas.
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8) Registra los datos en estas tablas:
6500
Púrpura
Amarillo
Total
Grupo 1
Grupo 2
Grupo 3
Grupo 4
Grupo 5
6502
Púrpura
Amarillo
Total
Grupo 1
Grupo 2
Grupo 3
Grupo 4
Grupo 5
9) Aplica a los datos la prueba de verificación de la hipótesis nula
10) ¿Cómo se interpreta la prueba de ji-cuadrado?
11) Si el ji-cuadrado no es significativo, ¿Podemos concluir que H0 es falsa o cierta?
12) Si el ji-cuadrado es significativo, ¿Podemos concluir que Ho es falsa o cierta?
13) ¿Cuál es la interpretación biológica de los resultados de la prueba a la luz de la H0?
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II. PLANTEAMIENTO Y VERIFICACIÓN DE HIPÓTESIS GENÉTICAS: CASOS SIMPLES
Objetivo: Inferir las proporciones observadas en cada mazorca y comprobar su ajuste con una jicuadrado de bondad de ajuste.
Tabla 1. Mazorcas grupo I
Cruce
Proporciones
6500
3 púrpura: 1 amarillo
6520
3 rojo: 1 blanco
6502
1 púrpura: 1 amarillo
6522
1 rojo: 1 blanco
Progenitores
púrpura × púrpura
rojo × rojo
púrpura × amarillo
rojo × blanco
14) ¿Qué son las proporciones fenotípicas y las genotípicas?
15) A la vista de los datos ¿cuál sería la mejor estima de las proporciones fenotípicas?
16) ¿Cómo podemos expresar simplemente las proporciones fenotípicas de un cruzamiento, para
verificar su ajuste a una H0?
17) Diseña una hipótesis genética para verificar la segregación observada en el grupo de
mazorcas muestreado.
18) Aplica a los datos la prueba de verificación de la hipótesis nula
Fenotipo
Purpúra
Amarillo
Observados
Esperados
19) ¿Cómo se interpreta la prueba de ji-cuadrado?
20) ¿Cuál es la interpretación biológica de los resultados de la prueba a la luz de la H0?
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III. PLANTEAMIENTO Y VERIFICACIÓN DE HIPÓTESIS GENÉTICAS: CASOS COMPLEJOS
(mazorcas grupo II)
Tabla 2. Mazorcas grupo II
CRUCE
PROPORCIONES
6690
9 rojo: 7 blanco
6700
13 amarillo: 3 púrpura
6680
9 amarillo: 3 blanco: 4 púrpura
6660
12 púrpura: 3 amarillo: 1 blanco
6662
2 púrpura: 1 amarillo: 1 blanco
6670
9 púrpura: 3 rojo: 4 blanco
PADRES
rojo x rojo
amarillo x amarillo
amarillo x amarillo
púrpura x púrpura
púrpura x blanco
púrpura x púrpura
21) ¿Cuántas clases fenotípicas se pueden observar en estas mazorcas?
22) ¿Se pueden explicar esas segregaciones con el modelo 3:1 o 1:1 anterior?
23) ¿Se te ocurren otros mecanismos alternativos?
EXPLICACION DEL MODELO PARA EL COLOR DEL GRANO DEL MAIZ
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NORMAS PARA DEDUCIR EL GENOTIPO PARENTAL:
 Si las proporciones en la F1 son parecidas podríamos estar ante un cruce de homocigoto por
heterocigoto, si son muy distintas se trataría de un cruce de heterocigotos
 Si las proporciones se desvían de la típicas cualitativamente, entonces estaríamos en un caso
de interacción y efectos epistáticos.
 Si las proporciones se desvían cuantitativamente entonces puede haber interacciones o
ligamiento.
 Cuando se conocen las rutas enzimáticas y las consecuencias de los mutantes específicos, el
fenotipo también nos permite hacer inferencias sobre el genotipo. Caso del maíz (epistático).
24) Vuelve a la Tabla 1 y propón una nueve hipótesis genética que explique los resultados a la
luz de los mecanismos bioquímicos descritos.
 Mazorca 6500 – Púrpura × Púrpura = 3 Púrpura + 1 Amarillo
 Mazorca 6520 – Rojo × Rojo = 3 Rojo + 1 Blanco
 Mazorca 6502 – Púrpura × Amarillo = 1 Púrpura + 1 Amarillo
 Mazorca 6522 – Rojo 1: Blanco 1
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25) Ahora vuelve a la Tabla 2 y propón una nueve hipótesis genética que explique los resultados
a la luz de los mecanismos bioquímicos descritos.
 Mazorca 6690 – Rojo × Rojo = 9 Rojo : 7 Blanco
 Mazorca 6700 – Amarillo × Amarillo = 13 Amarillo : 3 Púrpura
 Mazorca 6660 – Púrpura × Púrpura = 12 Púrpura + 3 Amarillo + 1 Blanco
 Mazorca 6662 – Púrpura × Blanco = 2 Púrpura + 1 Amarillo + 1 Blanco
 Mazorca 6670 – Púrpura × Púrpura = 9 Púrpura + 3 Rojo + 4 Blanco
26) ¿Qué nombre recibe el tipo/s de interacción génica propuesto?
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PRÁCTICA 2: MANEJO DE Drosophila EN EL LABORATORIO
OBJETIVOS
• Manejo de Drosophila en el laboratorio.
• Polimorfismos Mendelianos y cromosómicos en Drosophila.
INTRODUCCIÓN
Probablemente Drosophila ("la mosca de la fruta") es el eucarionte mejor estudiado desde el punto
de vista genético. Este organismo fue introducido como animal de laboratorio para la
investigación genética en 1909 por el Dr. T.H. Morgan. Desde entonces se emplea como modelo
biológico en varias disciplinas. En Drosophila coinciden varias ventajas para su utilización en
estudios genéticos:
1- Rapidez del ciclo de vida (en D. melanogaster dura 10-12 días a 25º).
2- Pocos cromosomas (en D. melanogaster 2N=8).
3- Existencia de abundantes polimorfismos genéticos.
4- Posee cromosomas gigantes (politénicos) en las glándulas salivares de las larvas.
5- Es una especie cosmopolita (distribuida en todo el mundo).
Sin embargo, quizás muchos de vosotros os habréis preguntado qué sentido tiene el utilizar una
especie, aún con muchas ventajas desde el punto de vista genético, tan diferente de nosotros
mismos o de otros animales más interesantes biológica o comercialmente. A pesar de que la
pregunta tiene sentido, la respuesta es clara y contundente. Existen tres buenas razones que
justifican la utilización de animales sencillos como modelos biológicos de estudio, para a partir de
los descubrimientos realizados en dichos modelos poder extrapolar nuestros resultados a animales
más complejos o incluso a nosotros mismos.
La primera de estas razones proviene del campo de la evolución. Se ha confirmado que todos los
organismos vivos conocidos, poseen una misma estructura a nivel molecular, y un funcionamiento
básico muy semejante, como consecuencia de que todos están emparentados y descienden de un
mismo antepasado común.
La segunda razón es de índole práctica. Numerosas veces se ha comprobado en la práctica que
dicha extrapolación es útil y ajustada. Por ejemplo, cuando se descubrieron ARN autoprocesables
en protozoos, se predijo con éxito que deberían aparecer también en otros organismos.
La tercera y última es de sentido común, muchas veces la alternativa no está a nuestro alcance
(podemos simular en laboratorio la evolución de una población de bacteria o de virus durante
20000 generaciones, pero no sería viable diseñar un experimento que hiciese lo mismo con vacas;
así mismo, muchos diseños experimentales no podrían desarrollarse en seres humanos por
razones puramente éticas).
BIOLOGÍA Y ECOLOGÍA DE LAS DROSOPHILAS.
La "mosca de la fruta" es un insecto perteneciente al orden Díptera. El género Drosophila está
compuesto por mosquitas, de unos pocos milímetros de longitud, especializadas en alimentarse de
frutos y vegetales en descomposición o parcialmente fermentados. Uno de los productos típicos
de las fermentaciones de estas frutas es el ácido acético, por el que estas moscas se sienten
irremediablemente atraídas (de ahí su otro nombre vulgar de "moscas del vinagre"). Es un género
muy cosmopolita distribuido en prácticamente cualquier clima, altitud y latitud (en concreto la
especie Drosophila melanogaster se encuentra en la mayor parte del planeta). El ciclo de vida, al
igual que el de otros dípteros es relativamente complejo, pasando por varias fases o etapas (Ver
figura 1):
Huevo: Las hembras ponen unos 200 huevos blancos en forma de saco de unos 0.5 mm de
longitud. Poseen unas extensiones de la membrana externa en posición anterodorsal, que impiden
que el huevo se hunda en la superficie semilíquida de su medio natural (frutas en
descomposición).
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Larva: Después de un día de desarrollo (a 20º C) eclosiona una pequeña larva de color blanco.
Esta larva posee 12 segmentos no aparentes (1 cabeza, 3 torácicos y 8 abdominales), dos capas
epidérmicas (endo y exocutícula) y numerosos órganos internos que pueden visualizarse por
transparencia. En todas las larvas existen 2 linajes celulares bien diferenciados:
1- Las células larvarias: muy diferenciadas, que han perdido su capacidad de división
celular y sólo pueden aumentar por lo tanto el tamaño de la larva a costa de incrementar
su volumen celular y replicar muchas veces su material hereditario (pero sin división
celular posterior). Es decir son habitualmente poliploides.
2- Las células imagales o imaginales: células poco diferenciadas, de pequeño tamaño,
diploides y localizadas en ciertas áreas o regiones denominadas discos imaginales.
Retienen la capacidad de dividirse y diferenciarse, dando lugar a las estructuras de la
mosca adulta durante la metamorfosis. Ya están parcialmente diferenciadas para dar lugar
a ciertas estructuras. Las larvas son muy voraces y se pasan todo el rato comiendo.
Después de unos cuatro días aproximadamente de crecimiento (a 20º C) desarrollan el
tamaño mínimo para convertirse en pupa.
Pupa: En un momento determinado, la exocutícula de la larva se endurece y se vuelve oscura, se
forma la pupa o imago. El proceso lo inicia una hormona llamada ecdisona. Durante el mismo,
todos los tejidos larvarios son destruidos y utilizados como fuente energética para, a partir de los
discos imaginales, formar una mosca adulta. Este estadio suele durar de 3 a 5 días.
Adulto: El imago suele salir rompiendo el extremo anterior del pupario. Al principio la mosca es
muy alargada, sin el pigmento característico de la forma adulta y con las alas completamente
plegadas. Durante las próximas horas después de emerger, la mosca inyecta linfa a las alas, para
que se desplieguen y se puedan secar y madura sexualmente. En unas 8-9 horas ya es un adulto
con plena capacidad funcional. Su vida no suele pasar de los 20 días a 20º C.
Reproducción: Es una especie dioica (con sexos separados), polígama (los machos y las hembras
pueden aparearse múltiples veces) y de fecundación interna. Existe un cortejo bastante sofisticado,
previo a la cópula, que puede variar mucho de especie a especie. Las hembras suelen copular
unas 3 o cuatro veces a lo largo de su vida, aunque son capaces de guardar el esperma de su
primera cópula durante toda la vida.
TÉCNICAS DE MANEJO Y MANIPULACIÓN EN LABORATORIO
Los procedimientos para capturar estas especies en su medio natural suelen ser indirectos,
utilizando recipientes que contengan frutas fermentadas, levadura fresca o cualquier otro medio
artificial preparado con los componentes anteriores (o incluso añadiéndole acético). Estos
contenedores se dejan un par de días en su hábitat natural, bosques y prados, y posteriormente se
va a recoger las moscas (bien tapando el recipiente, bien utilizando una red entomológica). En
algunas especies particulares muy especializadas es posible capturar los ejemplares directamente
en su medio natural mientras copulan o se alimentan.
Cultivo en laboratorio: Las moscas se suelen poner en un medio de cultivo en estado de gel que se
añade a un frasco que se tapa con algodón. El medio de cultivo posee tres componentes básicos:
1- Una fuente nutritiva: glúcidos y azucares (harina) y proteínas (levadura).
2- Un aglutinante, con el fin de conseguir un estado de gel, ni líquido ni sólido. Pues un
estado demasiado sólido impediría que las larvas se pudieran alimentar del medio de
cultivo, y un estado demasiado líquido podría impedir una correcta oxigenación de las
mismas durante la alimentación.
3- Inhibidores de crecimiento de hongos (competidores de la levadura) y de bacterias.
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Reconocimiento fenotípico del sexo: En Drosophila existe dimorfismo sexual, es decir que los
sexos se pueden distinguir morfológicamente. En los adultos, la distinción se puede realizar
atendiendo a (Ver figura 2):
1- El tamaño (las hembras son mayores).
2- Diferencias en el abdomen.
3- Existencia de un peine sexual en el segundo segmento de la primera pata de los
machos (cuya finalidad es sujetar a la hembra durante la cópula).
Obtención de hembras vírgenes: Ya que las hembras poseen la capacidad de guardar esperma de
cópulas anteriores durante toda su vida, si queremos hacer cruces controlados es imprescindible
utilizar hembras que sean vírgenes. Para conseguirlas se suelen utilizar tres métodos distintos:
1- Sexado de larvas en el tercer estadío (distinguiendo los ovarios de los testículos con
binocular), y aislamiento de las larvas hembras hasta su maduración.
2- Sexado de pupas (en los machos se puede distinguir el peine sexual) y aislamiento de
las hembras.
3- A partir de adultos, recogiendo todas las hembras recién emergidas hasta 8 horas
después de su nacimiento.
Propagación de líneas y nomenclatura: Habitualmente se utilizan 10-15 parejas para fundar un
frasco de cultivo típico de laboratorio de unos 250 ml de volumen. Cada 15-20 días las moscas de
una determinada línea se cambian a un frasco con medio nuevo para que funden una nueva
generación. Así, el mantenimiento de una línea en laboratorio durante todo un año suele implicar
unas 24 generaciones. Se recomienda mantener un mínimo de 2 frascos por línea.
Cuando se funda una nueva línea se suele escribir la abreviatura de los fenotipos "mutantes" de los
padres, así como la fecha en la que se inició el cultivo. Tradicionalmente el fenotipo de la hembra
se pone primero. Un ejemplo de etiqueta típica sería:
W×+
(10-10-04)
Alternativamente se usa la abreviatura del mutante y como subíndice una letra para el
correspondiente alelo, ejemplo: W+ / Ww
Manejo de las moscas en el laboratorio: Para eterizar (dormir) y examinar las moscas adultas el
procedimiento es el siguiente: Golpear la base de la botella para que las moscas se vayan al
fondo, quitar el tapón e invertir la botella sobre otra limpia, poner a esta nueva botella un tapón
de algodón empapado en éter y esperar unos segundos hasta que las moscas se duerman ( si se
espera demasiado tiempo las moscas se mueren). Una vez dormidas, depositarlas sobre una placa
de cristal y observar a la lupa.
IDENTIFICACIÓN DE MUTANTES DE Drosophila melanogaster:
MUTACIÓN
Salvaje (+)
Curly/Lobe (Cy/L)
Yellow (y)
White (w)
CARACTERÍSTICA FENOTÍPICA
Mosca con las características más frecuentes en la población
Alas curvadas y ojos en forma de riñón.
Cuerpo de color amarillo.
Ojos de color blanco.
CROMOSOMAS POLITÉNICOS.
En 1881 E.G. Balbiani encontró unas estructuras extraordinariamente peculiares en los núcleos de
ciertas células secretoras en dípteros. Sin embargo, hicieron falta 50 años para que se demostrara
que dichas estructuras eran cromosomas (Painter, Heitz y Bauer, 1933). Los cromosomas
politénicos se han encontrado en tejidos secretores como recto, tubos de Malpighi, intestino,
glándulas salivares, aunque es en estas últimas donde habitualmente alcanzan su desarrollo
máximo. Los cromosomas politénicos son el resultado de múltiples replicaciones del material
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nuclear sin ir seguidas de división celular. Como consecuencia se forman células poliploides en
los que los diferentes cromosomas homólogos se unen formando un complejo estable capaz de
amplificar hasta 1000 veces la estructura del cromosoma (en aquellos casos donde se han
producido más de 20 rondas de replicación).
Estos cromosomas se visualizan como estructuras alargadas unidas todas en un punto común el
cromocentro (lugar donde se unen todos los centrómeros). En Drosophila melanogaster se
observan claramente los 2 brazos de los cromosomas 2 y 3 y el brazo largo del X, unidos al
cromocentro (con algo de experiencia puede llegar a observarse un rudimento de condensación
que representa al cromosoma Y). También se aprecia un patrón de bandeado, formado por
regiones de mayor o menor condensación. En estos cromosomas también pueden visualizarse
PUFFS (abultamientos que representan zonas de transcripción activa) y anillos de Balbiani
(grandes zonas muy distendidas donde el nivel de transcripción es máximo, asociado a la
transcripción de ARN ribosómicos). Los cromosomas politénicos, por lo tanto, permiten la
localización visual de los genes en los cromosomas, y son pues extremadamente útiles para
obtener mapas físicos de distribución de genes en cromosomas. También se han utilizado para
estudiar el polimorfismo de bandas en las poblaciones, así como para detectar fenómenos de
reordenaciones cromosómicas y/o deleciones o duplicaciones.
OBTENCIÓN DE CROMOSOMAS POLITÉNICOS.
Para esta práctica se utilizará D. virilis ya que la larva es de mayor tamaño y su manejo es por
tanto más fácil. Se suelen utilizar larvas del tercer estadío (justo antes de convertirse en pupas). Se
coloca la larva sobre una superficie plana, y bien en seco, bien en agua destilada, se disecciona
separando la cabeza del cuerpo mediante la presión con dos punzones de disección Las dos
glándulas salivares están situadas a ambos lados del aparato bucal y son transparentes. Las células,
que son de gran tamaño tienen un aspecto granuloso, frecuentemente están asociadas con grasa
(ver figura 3). Una vez localizadas, se separan y se colocan en un portaobjetos con unas cuantas
gotas de orceina lacto-acética. Se deja que se tiña durante 10-20 minutos, y luego se deposita en
cubreobjetos pequeño sobre ella, se tapa con un papel de filtro y se realiza un aplastamiento
controlado ejerciendo presión sobre el mismo con el dedo pulgar. Entonces ya está lista para su
observación al microscopio a unos 100-400 aumentos (Ver figura 4). Las buenas preparaciones se
pueden fijar temporalmente usando laca de uñas para sellar el borde del cubre-objetos. Las
preparaciones para conservar se hacen utilizando hielo seco para fijar los cromosomas,
deshidratando con alcohol, y posteriormente añadiendo una resina epoxi (bálsamo de Canadá,
etc.).
Figura 1: Ciclo de vida y dimorfismo sexual en Drosophila melanogaster. (1) macho (2)hembra (3)
huevo (4,5,6) estadios de larva (7) paso de pupa a adulto.
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Figura 2: Vista ventral del abdomen de un macho y una hembra de Drosophila melanogaster.
Figura 3: Disección de la parte anterior de una larva de Drosophila en la que se muestran las dos
glándulas salivares.
Figura 4: Cromosomas politénicos de Drosophila.
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PRÁCTICA 3: CONCEPTOS BÁSICOS EN GENÉTICA MEDIANTE ANIMACIÓN
POR ORDENADOR
OBJETIVOS
•
Repasar los conceptos más importantes y/o complejos en Genética.
PROGRAMA VISUAL GENETIC PLUS.
Este programa de prácticas virtuales esta desarrollado en un entorno Windows y posee varias
prácticas interactivas de laboratorio. El programa está en inglés. Las prácticas están ordenadas por
áreas temáticas, cubriendo la mayor parte de los métodos explicados en la asignatura. Las
prácticas virtuales en este programa suelen llevar asociadas simulaciones explicativas en donde se
condensan los principios teóricos necesarios para resolver los distintos problemas. Las prácticas
virtuales de laboratorio que veremos serán:
1. Cruces Mendelianos
2. Análisis de ligamiento
3. Ligamiento al sexo en Drosophila
4. Efectos del género en cruzamientos prueba en Drosophila
Inicio del programa Visual Genetics Plus
1) Para iniciar el programa pulsa sobre el icono “openvg.exe” o sobre el acceso indirecto en
la carpeta “Ciencias” en el escritorio. Verás una pantalla como la siguiente:
2) Ahora pulsa sobre el botón “Classical Mendelian Genetics/Linkage” y te aparecerá la
siguiente pantalla:
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3) Pulsa en el botón “Select Individual modules” y verás la siguiente pantalla con los
módulos individuales:
4) Vamos a trabajar con los módulos 1, 3, 4 y 5.
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Modúlo 1. Cruces monohíbridos, dihíbridos y trihíbridos
1) Empecemos con el primero pulsando en el botón “1. Monohybrid, Dihybrid and Trihybrid
Mendelian Ratios”. Aquí se te explica en que consiste la práctica. Léelo con calma:
2) Una vez que lo has leído pulsa el botón “Continue”. Aparecerá la siguiente pantalla:
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3) Lee las instrucciones. La idea es hacer cruces para intentar averiguar el tipo de herencia
de los genes responsables de estos caracteres: color de la flor (blanco, púrpura), borde de
la hoja (aserrado, liso), y pilosidad del tallo (piloso, liso). Selecciona el cruce que quieres
hacer y pulsa el botón “Do Cross”. Aparecerá la siguiente pantalla:
4) Examina la F1 resultante. ¿Cuáles son los caracteres dominantes? Selecciona la opción
apropiada para cada una de los tres fenotipos en el recuadro “INTERPRETING THE F1”.
Ahora, fijándose en los genotipos de los parentales, deduce el fenotipo de la F1, indícalo
en el recuadro y pulsa “Check answer” para comprobar tu respuesta. Si has acertado verás
algo así:
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5) Ahora vamos a cruzar la F1 consigo misma. Pulsa el botón “Do F1 × F1 cross” y verás la
siguiente pantalla:
6) Predice la progenie que debería de producirse en la F2. Marca los fenotipos/genotipos
que piensas que van a aparecer. Indica la proporción esperada de cada uno de ellos.
Ahora pulsa el botón “Check progeny” para comprobar tu respuesta. Si aciertas aparecerá
la siguiente pantalla.
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7) Compara tu respuesta con el gráfico que aparece en el recuadro “BRANCHING
DIAGRAM”, que explica la segregación de los alelos en este cruce. Si quiere ver los
parentales originales pulsa el botón “Show parents”. Cuando hayas entendido este
resultado, pulsa el botón “Do Cross” para crear una nueva F1 o pulsa el botón “Go to Part
2” para explorar cruces atípicos:
8) Repite estos experimentos con cruces monohíbridos para los diferentes caracteres.
Experimenta con cruces dihíbridos y trihíbridos. Explora además cruces atípicos y escribe
todas tus conclusiones sobre la herencia de estos caracteres.
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Modúlo 2. Análisis de ligamiento
1) Ahora pasemos al segundo módulo que vamos a explorar pulsando en el botón “3.
Mapping genes by 3-point testcrosses”. Verás una pantalla en la que se te explica en que
consiste la práctica. Léelo con calma:
2)
3) Vamos a empezar desde cero con un nuevo mapa. Selecciona la opción “Begin with new
Map data” y pulsa el botón “Continue”. Se abrirá la siguiente pantalla:
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4) En las instrucciones se te indica que dispones de una serie de variedades puras
homocigotas para todos los alelos. Cada una de las variedades que se indican es
homocigota recesiva para los caracteres indicados (1 ó 2) y homocigota dominante para
los otros caracteres. Hay seis genes en total y queremos construir su mapa genético.
Diseña un cruce y pulsa el botón “Continue”. Si tu cruce es informativo, verás el botón
“Do cross”. Púlsalo y aparecerá una pantalla como ésta:
5) En la pantalla superior se te muestra la F1 resultante del cruce que has seleccionado.
Intenta predecir el genotipo y fenotipo de la variedad con la que la vas a cruzar en el
cruzamiento prueba Pulsa el botón “Continue” para verla:
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6) Ahora realiza el cruce pulsando el botón “Do Testcross” y verás la siguiente pantalla:
7) Examina los resultados obtenidos. Verás que se te indica la fase gamético de los
individuos que acabas de cruzar. Pulsa el botón “Continue” y aparecerá la siguiente
pantalla:
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8) Trata de identificar los tipos parentales y los tipos recombinantes entre la progenie el par
de genes activo (en este caso N&H). Pulsa en los recuadro blancos de la derecha de la
tabla para que aparezca una ‘R’ que identifique los tipos recombinantes (pulsando otra
vez sobre el recuadro la ‘R’ desaparece). Cuando hayas marcado los recombinantes, pulsa
en el botón “Total # Rec.” para calcular el número de recombinantes:
9) Ahora pulsa el botón “Get % Rec.” para calcular la frecuencia de recombinación:
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10) Pulsa el botón “Next Gene Pair” y repite el proceso hasta obtener la frecuencia de
recombinación de los tres pares. Cuando tengas las tres guarda los resultados pulsando el
botón “Save % Rec”:
11) Guarda los resultados por ahora pulsando el botón “SAVE MAPPING DATA” (sólo para
diskettes) y pulsa el botón “Do New Cross” para analizar otro cruce.
12) Diseña y realiza los cruces necesarios para resolver el mapa. Si aparece disponible el
botón “Advanced Analysis” y sigue las instrucciones.
13) Dibuja el mapa genético para estos genes:
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Módulo 4. Ligamiento al sexo
1) Elige el módulo 4 (ligamiento al sexo).
2) Lee detalladamente la explicación de este nuevo ejercicio. El objetivo es analizar la
segregación de dos mutaciones recesivas ligadas al cromosoma X: white (w) y miniaure
(m), que producen los fenotipos mutantes ojos blancos y alas cortas. Se trata de verificar si
se cumplen dos de las propiedades que permiten determinar si un carácter está o no
ligado al sexo: 1) Diferencias en la incidencia del carácter entre sexos y 2) Diferencias en
los resultados obtenidos en cruces recíprocos. Además, podremos determinar si existe o
no ligamiento entre los dos genes. Pulsa continuar.
3) Esta práctica reproduce paso por paso todo lo que es necesario realizar cuando se hace
un cruzamiento real de Drosophilas en el laboratorio. Cada uno de los frascos de cultivo
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contiene una línea pura de Drosophila. Tendrás que seguir las indicaciones que de forma
secuencial aparecen en la pantalla.
CRUZAMIENTO 1: hembra fenotipo salvaje x macho white miniature. Pulsa el botón
anesthesize para dormir las moscas
4) Arrastra con el ratón las moscas dormidas del frasco izquierdo al disco de observación
izquierdo. Arrastra las moscas dormidas del frasco derecho al disco de observación
derecho. Haz doble clic en la moscas para visualizar su fenotipo y sexo. Recuerda que los
machos se distinguen por la presencia de peines sexuales en las dos patas delanteras y la
coloración oscura de la parte posterior del abdomen.
5) Obtención F1: Elige una hembra de fenotipo salvaje y un macho doble mutante white
miniature. Para ello, arrastra el macho y la hembra al frasco P1xP2 en la ventana inferior.
Una vez que los padres se han cruzado, tendrás que retirarlos para que no se confundan
con la descendencia. Para ello, pulsa el botón anesthesize para dormir las moscas y
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retirar los padres al disco de observación (arrastrándolos con el ratón). Presiona view F1
para obtener la descendencia del cruzamiento F1.
6) Duerme las moscas de la F1 y visualiza su fenotipo en el disco de observación tal y como
has hecho anteriormente.
- Determina las proporciones fenotípicas de la descendencia contabilizando toda
la progenie.
- ¿Cómo explicas los resultados?
7) Presiona view table para conocer qué proporciones obtendrías en un experimento en el
que hubieses contabilizado muchos más individuos. Para continuar, presiona return to
experiment.
8) Obtención F2: Obtén la F2 cruzando un macho y una hembra de la F1. Para ello, arrastra
al frasco F1xF1 un macho y una hembra del disco de observación donde has
contabilizado la F1.
9) Retira nuevamente los adultos para que no se confundan con la progenie F2 (anestésialos
y arrástralos al disco de observación). Presiona view F2 para obtener la descendencia.
10) Anestesia la F2 y contabiliza las proporciones fenotípicas en el disco de observación.
Explica los resultados.
11) Presiona view table para conocer qué proporciones obtendrías en un experimento en el
que hubieses contabilizado muchos más individuos.
12) Observa las proporciones de la F2. ¿Existe alguna evidencia de ligamiento entre white y
minute?
13) Para continuar, presiona return to experiment.
14) Presiona Start new cross.
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15) CRUZAMIENTO 2: hembra salvaje x macho doble mutante para Bar y miniatura. Repite
todo el proceso hasta la F2 partiendo de este cruce recíproco.
16) Una vez hayas finalizado el cruzamiento 2, explica la discrepancia o similitud de los
resultados con los obtenidos en el cruzamiento 1.
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Módulo 5. Efectos del género en cruzamientos prueba en Drosophila
1) Elige el módulo 5.
2) Lee detenidamente el planteamiento de esta práctica. El objetivo es determinar cual es la
causa de las diferencias de segregación que se observan en ciertos cruces recíprocos.
Verás que no sólo la herencia ligada al sexo puede producir tales diferencias, y deducirás
cual es la explicación de tus resultados. Para ello, analizarás la herencia de dos
mutaciones recesivas de Drosophila: ojos púrpura (p), y coloración negra del cuerpo (b).
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3) En los frascos de la izquierda y derecha hay líneas puras de Drosophila cuyo genotipo se
indica en la pantalla. Procede a hacer un cruzamiento de un individuo púrpura con otro
de cuerpo negro, tal y como ya has hecho anteriormente:
a. Duerme las moscas
b. Visualiza su fenotipo sobre los discos de observación
c. Elige el macho y la hembra que vas a cruzar, y arrástralos al frasco P1xP2 para
obtener la F1
d. Retira los padres al disco de observación
e. Presiona view F1 para visualizar la descendencia
f. Duerme los individuos F1 y arrástralos al disco de observación para visualizar sus
fenotipos. ¿Cual es el genotipo de machos y hembras? ¿El resultado habría sido
distinto si hubieses realizado el cruzamiento recíproco?
4) A continuación, vas a hacer un cruzamiento prueba con los individuos de la F1. Para
elegir los individuos homocigotos recesivos de este cruzamiento, presiona show test cross
parents.
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5) Duerme a los individuos homocigotos recesivos y deposítalos en el disco de observación.
Ahora dispones en la pantalla de todo lo que necesitas para realizar el cruzamiento
prueba: los individuos F1 (ventana inferior) y los homocigotos recesivos (ventana
superior). El frasco donde harás el cruzamiento prueba es F1-TC, en la ventana inferior.
6) Haz el siguiente cruzamiento prueba: hembra F1 x macho homocigoto doble recesivo
(pb/pb). Para ello:
a. Arrastra los individuos al frasco F1-TC
b. Retira a los padres
c. Presiona view TC progeny para obtener la descendencia
d. Anestesia la progenie y visualízala en el disco de observación ¿Son los machos
iguales? ¿Son las hembras iguales? ¿Hay diferencias entre machos y hembras?
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7) Presiona view testcross data para obtener una relación detallada de tus resultados. ¿Hay
evidencia de ligamiento ente las mutaciones p y b?.
8) Presiona return to experiment.
9) Presiona Start new cross
10) Repite todo el proceso desde el principio. PERO HAZ EL CRUZAMIENTO PRUEBA
RECIPROCO: macho F1 x hembra doble homocigota recesiva.
11) Cuando hayas llegado al final del proceso, presiona view test cross data
12) En estos momentos dispones en tu pantalla de los datos de los tipos de cruzamiento que
has realizado. A continuación vas a analizar estos datos presionado start análisis.
13) Observa las diferencias de los resultados obtenidos en los dos tipos de cruzamientos
¿Cuál es la explicación?
14) Calcula la frecuencia de recombinación ente p y b. Para ello, haz una vez clic con el
ratón (en la fila all progeny) sobre cada una de las casillas que contiene cada fenotipo
recombinantes. El número total de recombinantes se va sumando automáticamente a
medida que los seleccionas.
15) Presiona show % recombinación para calcular la distancia entre loci. Verifica tu análisis
presionando check answer
16) Finalmente presiona show summary, y comprueba si la explicación que allí se da
coincide con la que tú has propuesto
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