Elementos genéticos móviles Genética I - 2015 Flávio Silva Junqueira de Souza photo credit: Robert Martienssen, Cold Spring Harbor Laboratory Elementos genéticos móviles - hay elementos genéticos que pueden moverse (transponerse) de un lugar a otro en el genoma - ocurren en los genomas de todos los seres vivos en que han sido buscados - no tienen función definida (pueden ser considerados parásitos moleculares) pero influyen en la evolución de los genomas - en organismos multicelulares (animales, plantas) gran parte del genoma está compuesto por restos inactivos de elementos transponibles - son usados como herramientas moleculares para modificar genomas - denominaciones: elementos genéticos transponibles, transposones, "genes saltarines" (jumping genes) etc Locus Dotted (Dt) en maíz - Marcus Rhoades (1938): descubrió herencia no-mendeliana de algunos loci de maíz; - analisó mazorcas de una autofecundación de un maíz negro mexicano y encontró que la marzorca tenía granos que segregaban de la siguiente manera: 12 granos pigmentados 3 granos moteados (dotted) 1 grano incoloro Locus Dotted (Dt) en maíz - hipótesis de Rhoades: dos loci involucrados; A(a) y Dt(dt) A grano pigmentado a grano incoloro Dt produce efecto variegado dt no produce efecto variegado - el alelo Dt causa la reversión a A Locus Dotted (Dt) en maíz - la cantidad y tamaño de las manchas en el grano de maíz dependen del momento en el desarrollo en que ocurre la reversión a A Locus Dotted (Dt) en maíz - Rhoades razonó que las reversiones en linea germinal deberían ser heredables. Para probarlo encontró anteras pigmentadas en plantas a/a; Dt/- y las cruzó con plantas a/a; dt/dt plantas a/a; Dt/- X plantas a/a - el polen de las anteras pigmentadas dió origen a granos totalmente pigmentados, lo que muestra que el fenotipo pigmentado es causado por un evento de reversión que ocurrió en la linea germinal - primer caso de un alelo mutante inestable (alelo que revierte a muy alta tasa) Barbara McClintock - en la década de 1930 estudió la citogenética del maíz, caracterizando sus 10 cromosomas; - visualizó el proceso de crossing-over en cromátidas hermanas durante la meiosis en el maíz (1931); - estudió el ciclo de breakage-fusion-bridge en cromosomas inestables de maíz, causado por la pérdida de un telómero antes de la división celular; - descubrió que algunos elementos genéticos podían moverse (transponerse) en el genoma, causando la activación o inactivación de genes; - llamó a los genes móviles "elementos controladores" (controlling elements) - ganó el Premio Nobel en 1983 Sistema Ds/Ac en maíz - McClintock observó que el locus Dissociator (Ds) en el cromosoma 9 de maíz causaba inestabilidad (rotura) en el cromosoma durante el desarrollo, llevando a la pérdida de los loci C (Colored), Sh (Shrunken) y Wx (Waxy); pérdida de C (grano pigmentado) lleva al fenotipo c (no pigmentado) - la rotura en el locus Ds solo ocurre en presencia del locus Activator (Ac), localizado en otra zona del genoma - el locus Ac no tiene una localización definida; en distintas cepas de maíz Ac se localiza en distintas ubicaciones en el genoma Sistema Ds/Ac en maíz C Ds / C Ds; Ac/Ac+ x c Ds+ / c Ds+; Ac+/Ac+ Ac: presente Ac+: ausente Ds: presente Ds+: ausente C: grano pigmentado c: grano incoloro Cu: alelo C inactivado por inserción del Ds - la presencia de algunos granos incoloros con manchas oscuras indicaba que Ds podía insertarse en C sin causar rotura y después salir de C restaurando su funcionalidad (siempre que Ac esté presente) Sistema Ds/Ac en maíz - la presencia de algunos granos incoloros con manchas oscuras indicaba que Ds podía insertarse en C sin causar rotura y después salir de C restaurando su funcionalidad (siempre que Ac esté presente) Sistema Ds/Ac en maíz - otros experimentos de McClintock mostraron que el elemento Ac también podía insertarse en C y inactivarlo. La inactivación era revertida cuando Ac volvía a moverse; - estos resultados indicaban tanto Ds como Ac eran elementos móviles relacionados funcionalmente; - McClintock los llamó elementos controladores y dedujo que participaban de la regulación génica - los genes eran imaginados como unidades estáticas; la idea de que se podían mover de esa manera regulando la actividad génica era revolucionaria; Sistema Ds/Ac en maíz - desde la década de 1980 se conocen las bases moleculares del sistema Ds/Ac Ac elementos Ds - el elemento Ac es un transposón de DNA que codifica una transposasa; como tal puede transponerse de manera autónoma (elemento autónomo); - los elementos Ds tienen deleciones y son defectivos en el gen de la transposasa; debido a eso dependen de la transposasa de un elemento Ac para moverse (elemento noautónomo) transposición en el sistema Ac/Ds excisión al producirce la excisión se restablece (o no) la unión cromosómica Transposones en maíz - hay varios transposones autónomos y no-autónomos en maíz Elementos móviles en bacterias - las investigaciones en elementos genéticos móviles en maíz se estancaron por falta de herramientas moleculares; - en la década de 1960 los conocimientos de genética bacteriana eran ya muy avanzados (conjugación, fagos, operón lac, etc); - se descubrieron mutaciones en el operón lac que revertian a una tasa muy alta (como las causadas por Ac/Ds en maíz); - las mutaciones eran polares: a veces inactivaban todos los genes del operón, a veces inactivaban sólo los más lejanos del promotor. Y, A inactivos lac operon Z, Y, A inactivos Elementos móviles en bacterias - los primeiros elementos móviles de bacterias encontrados fueron las insertion sequences (IS) que inactivaban el operón lac; transducción especializada del fago lambda puede llevar parte del operón lac y incorporarlo a la partícula viral Insertion sequences (IS) de E. coli - los primeiros elementos móviles de bacterias encontrados fueron las insertion sequences (IS) que inactivaban el operón lac; CsCl gradient - fagos con operones lac con mutaciones polares cargaban mas material genético (DNA) que los con el operón lac salvaje (tenían una inserción). Insertion sequences (IS) de E. coli - el DNA de los fagos con mutaciones del operón, cuando eran hibridados con DNA de fagos con el operón salvaje, formaban loops Insertion sequences (IS) de E. coli - las mutaciones polares del operón lac son debidas a la inserción de los elementos IS adentro del operón, interrumpiendo los genes; - existen naturalmente en el cromosoma y en plásmidos de bacterias; - son elementos autónomos (pueden transponerse solos); - tienen una estructura muy simple: codifican una transposasa; los extremos tienen secuencias repetidas invertidas Insertion sequences (IS) de E. coli - durante la inserción de los elementos IS mediada por la transposasa, la secuencia-blanco del genoma sufre una duplicación: complejo transposasa + IS elementos IS Insertion sequences (IS) - mecanismo de inserción Insertion sequences (IS) - mecanismo de inserción Transposones compuestos en bacterias - algunos transposones bacterianos poseen dos elementos IS en sus extremos y se transponen como una unidad; pueden moverse de un plásmido al cromosoma o a otro plásmido; - los segmentos invertidos pueden estar en la misma orientación o no; las dos transposasas pueden ser activas o solo una; - frecuentemente llevan genes de resistencia a antibioticos en la parte central; plásmidos conjugativos con ese tipo de transposón pueden transmitir la resistencia entre bacterias Transposones compuestos en bacterias - ejemplos de transposones compuestos de bacterias: Tn5 Tn9 Tn10 Kan: kanamycin; Ble: phleomycin; Str: streptomycin; Cam: chloramphenicol; Tet: tetracyclin Transposones compuestos en bacterias - plásmidos R conjugativos confieren resistencia múltiple a antibioticos - contienen varios elementos Tn/IS y genes de resistencia ejemplo: plásmido R100 - contiene los transposones Tn10 y Tn9 y con múltiples genes de resistencia a antibioticos - se transfiere entre bacterias entéricas Transposones no-compuestos en bacterias - los transposones de DNA que vimos hasta ahora (Ac, IS, Tn10 etc) se mueven por un mecanismo de cortar-y-pegar (cut-and-paste; transposición no replicativa o conservativa); - hay transposones de DNA que se mueven por un mecanismo replicativo; en ese caso generan una copia extra en el sitio de inserción; - no tienen elementos IS en los extremos, sí tienen secuencias invertidas; - codifican una transposasa y una resolvasa (enzima que actua en la recombinación); poseen un sitio de resolución y pueden tener también genes de resistencia a antibioticos Transposones no-compuestos en bacterias - la transposasa corta una unión fosfodiester en una hebra (nick) de un inverted repeat (IR) y otra unión en la hebra complementaria del otro IR; transposasa también corta las hebras de DNA-blanco; - los extremos 3' del IR se unen a los extremos 5' del DNA blanco; - el DNA es replicado desde los extremos 3' del DNA-blanco; res res - ligación del DNA forma un cointegrado (forma fusionada de los dos fragmentos de DNA); - recombinación sitio-específica entre los dos sitios res mediada por la resolvasa (resolución); - cada fragmento de DNA ahora tiene una copia del transposón Regulación de la transposición - la inserción de transposones puede interrumpir genes y causar aberraciones cromosómicas; el exceso de transposición puede ser letal; - mecanismos de regulación aseguran que la tasa de transposición de elementos genéticos móviles sea bajo; - mecanismos observados: inhibición de la transcripción de la transposasa por una proteina represora codificada en el transposón (p. ej. Tn3); inhibición de la transcripción de la transposasa por metilación del DNA del promotor; inhibición de la unión de la transposasa a las secuencias IS por metilación del DNA; inhibición de la traducción del mRNA de la transposasa por un RNA antisentido expresado de manera abundante; degradación rápida de la transposasa (no se acumula proteina); acción en cis de la transposasa (la enzima se une fuertemente al DNA inmediatamente después de ser traducida; no difunde a otras zonas del genoma) Regulación de la transposición - transposón Tn10 (compuesto): promotor bidireccional produce el mRNA de la transposasa y un RNA antisentido que se solapan en 36 bp - RNA antisentido es 30 veces más abundante que el mRNA; híbridos RNA:RNA inhiben la traducción de la transposasa Regulación de la transposición - transposón Tn10 (compuesto): metilación Dam completa (ambas hebras) de sitios GATC presentes en el promotor impide la transcripción de la transposasa; la misma metilación de la secuencia IS impide la unión de la transposasa; sitios metilados - además, la transposasa es muy inestable, difunde poco y actua solamente en la inserción desde donde fue traducida (acción en cis) Transposones en Drosophila - en Drosophila, 10% del genoma está compuesto por restos de transposones, la vasta mayoría inactivos; - los elementos P son los más estudiados transposones de DNA de moscas; - codifican una transposasa y están flanqueados por secuencias invertidas repetidas; - se mobilizan por el sistema de cut-and-paste (como el Ac de maíz o el IS de bacterias) ; - son usados como herramientas moleculares elemento-P Disgénesis del híbrido - en Drosophila, la cruza entre hembras de laboratorio con machos salvajes genera híbridos infértiles; - estos híbridos tienen varias mutaciones y aberraciones cromosómicas; - si la cruza es entre un macho de laboratorio y una hembra salvaje, los híbridos son fértiles; - la causa de la disgénesis del híbrido es la mobilización excesiva de elementos-P en los embriones de hembras de laboratorios, que normalmente no tienen el elemento-P; - las hembras salvajes producen un represor de la mobilización de elementos-P (pequeños RNAs llamados piRNA que reprimen la expresión de la transposasa por RNAi) Disgénesis del híbrido - el elemento-P solo es activo en células germinales, pero no en células somáticas; - el gen de la transposasa tiene 3 intrones; la regulación es a nivel del splicing; - en células somáticas, sólo se splicean los intrones 1 y 2; la proteina resultante trunca es un represor de la actividad del transposon; - en células germinales los tres intrones sufren splicing; la proteina (87 kD) es la transposasa Disgénesis del híbrido - en la disgénesis del híbrido, falta un represor citoplasmático que reprima la transposición del elemento P en los embriones; - ese represor en embriones está compuesto por RNAs pequeños (piRNAs) que llevan a la degradación del mRNA de la transposasa por RNA de interferencia (RNAi) Transgénesis con elemento P - un plásmido tiene las secuencias IR del elemento P con el trasgén y un factor de selección (rosy) pero sin transposasa; - el segundo plásmido expresa la transposasa pero tiene mutaciones en las secuencias IR y no se puede insertar; - los plásmidos son inyectados en el polo posterior de un embrión rosy- (blastodermo) ; el plásmido se inserta en algunos nucleos; - moscas de la F1 con ojos rojos (rosy) tienen el transgén en todas sus células Retrovirus y retrotransposones - los retrovirus tienen genoma de RNA; al entrar en una célula, el RNA es convertido en DNA por la transcriptasa reversa y se integra al genoma del huésped (provirus); - el genoma del retrovirus produce las proteinas necesarias para formar la cápside y otras proteinas del virus Retrovirus y retrotransposones - el típico genoma de retrovirus está flanqueado por dos regiones repetidas (LTR, long terminal repeats) y los genes gag (forma la cápside), pol (transcriptasa reversa [RT], proteasa, integrasa) y env (glicoproteinas de la membrana del virus); genoma de retrovirus - los genoma animales contienen miles de copias de genomas de retrovirus inactivos; - 5-8% del genoma humano está compuesto por restos de antiguos retrovirus (ERV; endogenous retroviruses); las copias tienen múltiples mutaciones y ninguna puede formar un retrovirus infectivo; muchas consisten solamente de la región LTR Retrovirus y retrotransposones - retrotransposones de LTR son una clase especial de transposones derivados de retrovirus; son flanqueados por dos LTR pero no contienen todos los genes necesarios para formar una partícula viral; sí contienen la pol genoma de retrovirus elemento Ty de levadura elemento copia de Drosophila Retrovirus y retrotransposones - retrotransposones de LTR son una clase especial de transposones derivados de retrovirus; son flanqueados por dos LTR pero no contienen todos los genes necesarios para formar una partícula viral; sí contienen la región pol; ciclo simplificado de movimiento de un retrotransposón - la región LTR sirve como promotor; el transcripto codifica la RT y otras proteinas, que convierten la secuencia de RNA en una secuencia de DNA y lo integran al genoma; - la copia de DNA se integra en otro sitio del genoma (transposición replicativa) de la misma célula, no puede entrar a células vecinas como los genomas de retrovirus; Retrovirus y retrotransposones mecanismo de retrotranscripción (parte I) mediada por la transcriptasa reversa Retrovirus y retrotransposones mecanismo de retrotranscripción (parte II) mediada por la transcriptasa reversa Retrovirus y retrotransposones mecanismo de integración del DNA doble cadena del retrotransposón en un sitio del genoma la integrasa es la única enzima necesaria para ese proceso Elementos Ty en levaduras - levaduras tienen una familia de retrotransposones denominados Ty; - tienen ~6.3 kb y dos secuencias LTR (delta) de 330 bp; - hay varios tipos de Ty; el genoma típico de S. cerevisiae contiene ~30 copias de Ty1 y ~6 copias de Ty917; - se transcriben dos RNAs (5.7 y 5.0 kb) que codifican dos ORFs: TyA (similar a la proteina gag) y TyB (similar a la RT, proteasa y integrasa); Elementos Ty en levaduras - levaduras tienen una familia de retrotransposones denominados Ty; - tienen ~6.3 kb y dos secuencias LTR (delta) de 330 bp; - hay varios tipos de Ty; el genoma típico de S. cerevisiae contiene ~30 copias de Ty1 y ~6 copias de Ty917; Ty VLPs - mobilización de Ty genera virus-like particles (VLPs) en el citoplasma de las levaduras; - las VLPs no son infectivas; contienen RNA, DNA, retrotranscriptasa, integrasa y la proteina TyA procesada; Retrotransposones sin LTR - retrotransposones sin LTR también se movilizan por un RNA intermediario pero no contienen regiones LTR a los extremos; - los elementos LINE (long interspersed nucleotide elements) son comunes en mamíferos; corresponden a ~17% del genoma humano; - poseen dos ORFs; la ORF2 codifican una endonucleasa (en) y la transcriptasa reversa (rvt); son elementos autónomos; - el promotor se sobrepone con la región transcripta como la 5' UTR del RNA;a los extremos tiene pequeñas duplicaciones del DNA blanco (TSD, target site duplications) LINE-1 (6 kb) Retrotransposones sin LTR - la retrotranscripción y la inserción del elemento LINE-1 están acopladas: - ORF2 corta una hebra de la secuencia blanco (TTTT), que hibrida con la cola del RNA del LINE-1 y es usada como primer para la síntesis de las cadenas de DNA Retrotransposones sin LTR - hay retrotransposones sin LTR que no se pueden mobilizar solos; no codifican ninguna proteina y necesitan la transcriptasa reversa (ORF2) de un elemento LINE para transponerse (elementos no-autónomos); - estos elementos se denominan SINE (short interspersed nucleotide elements) y son muy comunes en mamíferos; - en humanos, hay 1 millón de copias de elementos Alu, que corresponden a ~15% del genoma; - SINEs comunes en ratones son los elementos B1 y B2; promotor (pol III) TSD: target site duplication monómeros derivados del RNA 7SL Elementos Alu - en humanos, hay 1 millón de copias de elementos Alu, que corresponden a ~15% del genoma; - tienen un promotor con cajas A y B, transcripto por la RNA polimerasa III; - poseen dos regiones duplicadas derivadas del gen del RNA 7SL (signal recognition particle): Elementos Alu - los RNAs de Alu interaccionan con los ribosomas; - cuando una molécula de RNA de ORF2 de un LINE es traducida, la cola poly A del Alu puede tomar el lugar de la cola poly A del RNA del LINE; - como resultado, la proteina ORF2 transpone el RNA del elemento Alu en lugar del RNA del LINE (los Alus son parásitos de parásitos) ORF2 Classificación de los elementos genéticos móviles clase II clase I (DNA) (intermediario de RNA) Abundancia de elementos genéticos móviles - ~43% de la secuencia del genoma humano corresponde a transposones; - solamente están activas algunas copias de LINE-1 (pueden causar enfermedades) Consecuencias de la actividad de transposones - en bacterias, los transposones participan del intercambio de genes entre individuos y especies (poco comun en eucariotas); - en general la actividad de los transposones es deleteria; causa mutaciones, hemofilia en humanos causada por inserciones de elementos LINE-1 en el gen del factor VIII - procesos de recombinación aberrante entre copias de transposones pueden dar origen a inversiones, deleciones y duplicaciones; - ocasionalmente puede contribuir para generar variación génica ventajosa (por ejemplo por exon shuffling o generando nuevas regiones regulatorias) Consecuencias de la actividad de transposones - exon shuffling causado por un error en la transposición puede, ocasionalmente, generar algun gen nuevo ventajoso para el organismo: Uso de transposones como herramientas - mutagénesis por inserción; - clonado posicional de genes (gene tagging); - estudio de secuencias regulatorias; - transgénesis en insectos, peces y otros organismos - terapia génica Peces transgénicos - utiliza el transposón de DNA Tol2, encontrado en el pez medaka - microinyección en embrión de 1-célula: plásmido con gen de interés flanqueado con sitios Tol2 mRNA de transposasa Tol2 - la transposasa integra gen de interés al genoma de las células del embrión (se genera un pez mosaico); - peces transgénicos pueden ser usados para generar una linea estable si el transgén se encuentra insertado en la linea germinal. Kawakami Genome Biology 2007 8(Suppl 1):S7 Sundaresan et al Gen Dev 1995 Enhancer trap - técnica para encontrar nuevos genes y enhancers expresados en regiones de interés de un organismo; - ejemplo: enhancer trap en Arabidopsis usando el sistema Ac/Ds - generación de plantas con el elemento Ac no transponible (sin las repeticiones flanqueantes) y un elemento Ds transponible con un promotor mínimo ríoarriba de un reportero (GUS) - si el elemento Ds se ubica cerca de un enhancer (E), el reportero se activará en una región específica Nakayama et al Plant Cell 2005 Enhancer trap - ejemplo: enhancer trap en Arabidopsis usando el sistema Ac/Ds flores de Arabidopsis expresando GUS en diferentes regiones (pétalos, anteras, sépalos) de acuerdo al sitio de inserción del elemento Ds modificado