antiserum pseudomonas aeruginosa
Anuncio
ANTISERUM PSEUDOMONAS AERUGINOSA SEROTYPING OF PSEUDOMONAS AERUGINOSA IVD 1- CLINICAL VALUE In hospital, Pseudomonas aeruginosa infections can take on epidemic proportions. This very serious situation may require temporary closure of the department in which these infections occur. It is essential to investigate the epidemiological pathway of these hospital infections, to identify their origin (very often so-called “aseptic” solutions used for disinfection of non-autoclavable instruments and catheters), or to exclude the responsibility of the nursing staff, possibly healthy carriers (throat, stools) of Pseudomonas aeruginosa not responsible for the epidemic. This epidemiological survey must determine whether or not all of the strains of Pseudomonas aeruginosa isolated during the epidemic are identical. Following identification of the species, determination of the O-antigen group provides essential and sometimes sufficient information for epidemiological surveys. 2- INTENDED USE P. aeruginosa antisera are used for serological identification of cultures of P. aeruginosa by the slide agglutination method, for epidemiological purposes. 3- PRINCIPLE The test is based on agglutination, by specific sera, of bacteria possessing the corresponding antigens. Anti-Pseudomonas aeruginosa (anti-O) agglutinating sera According to the classification established by Habs (1) and completed by the International Pseudomonas Sub-Committee, there are 16 O-antigen groups, numbered from 1 to 16. These antisera are obtained by immunizing rabbits with heated bacterial suspensions (which destroys heat-labile H-antigen). Specificity is then determined by cross-saturation. 1) Monovalent sera 16 monovalent sera numbered from 1 to 16 are available. Strong cross-reactions are observed between groups O:2 and O:5, and between groups O:7 and O:8 and between groups O:13 and O:14. Monovalent sera corresponding to these groups are consequently absorbed. 2) Polyvalent sera To facilitate typing, 4 serum mixtures are prepared and designated by the acronyms PMA, PME, PMC and PMF. They have the following compositions: PMA = P1 + P3 + P4 + P6 PME = P2 + P5 + P15 + P16 PMC = P9 + P10 + P13 + P14 PMF = P7 + P8 + P11 + P12 4- HOW SUPPLIED Polyvalent sera and monovalent sera are supplied in 3 ml dropper bottles (60 tests). • Polyvalent sera Antiserum Pseudomonas aeruginosa polyvalent PMA Code : 58922 Antiserum Pseudomonas aeruginosa polyvalent PMC Code : 58942 Antiserum Pseudomonas aeruginosa polyvalent PME Code : 58932 Antiserum Pseudomonas aeruginosa polyvalent PMF Code : 58952 Code : 58901 Code : 58902 Code : 58903 Code : 58904 Code : 58905 Code : 58906 Code : 58907 Code : 58908 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P9 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P10 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P11 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P12 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P13 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P14 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P15 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P16 Code : 58909 Code : 58910 Code : 58911 Code : 58912 Code : 58913 Code : 58914 Code : 58915 Code : 58916 • Monovalent sera Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P1 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P2 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P3 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P4 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P5 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P6 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P7 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P8 1 5- STORAGE Sera stored at +2-8°C in the absence of contamination are stable until the expiry date indicated on the kit (even when opened). 6- MATERIAL REQUIRED BUT NOT SUPPLIED • Glass slide. • Plastic or platinum inoculation loop. • Physiological saline. 7- PRECAUTIONS FOR USE • Always comply with current techniques and precautions concerning protection against microbiological hazards, for handling and elimination of material and biological products used for the agglutination reaction. • These sera contain < 0.1% sodium azide. Sodium azide can react with lead or copper present in the plumbing forming explosive metallic azides. When eliminating these reagents, rinse abundantly with water to avoid the formation of azide deposits. • Do not dilute reagents. 8- PROCEDURE Serotyping is performed after identification of the species on a fresh, pure culture of P. aeruginosa isolated on non-selective agar medium. Perform a control test on the strain to be tested in physiological saline: • Take one loop of culture. • Suspend these bacteria in a drop of physiological saline, ensuring homogeneous suspension. No agglutination should be observed with physiological saline. If agglutination is observed, it correspond to a self-agglutinating strain and the test with antisera cannot be performed. • Start by testing agglutination with polyvalent sera, then with the specific sera corresponding to the mixture giving marked agglutination. • Deposit 1 drop of immune serum on the slide. • Take one loop of fresh, pure culture of P. aeruginosa. • Suspend these bacteria in a drop of serum, ensuring homogeneous suspension gradually adding bacteria to the serum. • Shake the slide with a gently rotary movement. • Examine the mixture with the naked eye over a dark surface or over a concave mirror. 9- INTERPRETATION OF THE RESULTS A positive reaction corresponds to the appearance of agglutination in a maximum of 5 minutes. O-antigen agglutination is fine and regular and is very easily distinguished from any poorly emulsified fragments of bacterial colony. Note : : In the case of failure (for example with strains producing a lot of mucosal antigens), it is recommended to prepare a very thick suspension in distilled water from a fresh, pure culture on agar and heat this suspension at 120°C for 30 minutes (autoclave). This suspension is centrifuged, the supernatant is eliminated, and the test is performed on the bacterial pellet. 10-TEST PERFORMANCES/QUALITY CONTROL The activity of each Pseudomonas aeruginosa agglutinating serum is controlled with the following panel of reference strains: Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Strains aeruginosa CIP 59.33 aeruginosa CIP 59.34 aeruginosa CIP 59.35 aeruginosa CIP 59.36 aeruginosa CIP 59.37 aeruginosa CIP 59.39 aeruginosa CIP 59.38 aeruginosa CIP 59.40 aeruginosa CIP 59.41 aeruginosa CIP 59.43 aeruginosa CIP 59.44 aeruginosa CIP 59.45 aeruginosa CIP 60.92 aeruginosa CIP 72.12 aeruginosa CIP 72.13 aeruginosa CIP 74.21 / / / / / / / / / / / / / ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC 33348 33349 33350 33351 33352 33354 33353 33355 33356 33357 33358 33359 33360 Serotype P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11 P12 P13 P14 P15 P16 2 11-QUALITY CONTROL OF THE MANUFACTURER All manufactured reagents are prepared according to our Quality System, starting from reception of raw material to the final commercialization of the product. Each lot is submitted to quality control assessments and is only released to the market, after conforming to pre-defined acceptance criteria. The records relating to production and control of each single lot are kept within Bio-Rad. 12-LIMITS OF USE • Identification of the bacterial species must be performed before determination of the serogroup. • About 5% of strains of Pseudomonas aeruginosa are unstable and self-agglutinating. • About 1% of stable strains of Pseudomonas aeruginosa belong to groups other that 1 to 16. Typing these new O groups appears to be of limited practical value. 13-REFERENCES 1.HABS I. Z. Hyg., 144, 218-228. 2.VIEU J.F., ALLOS G., HASSAN-MASSOUD B., SANTOS-FERREIRA M.O. et TSELENTIS G.. Existe-t-il une épidémiologie géographique des sérogroupe O de Pseudomonas aeruginosa. Bull. Soc. Path. Ex., 1984, 77, 288-294. Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33 09/2003 code: 18316 - A4 3 ANTISERUM PSEUDOMONAS AERUGINOSA SÉROTYPAGE DES BACILLES PYOCYANIQUES IVD 1- INTÉRÊT CLINIQUE En milieu hospitalier, les infections dues au bacille pyocyanique (Pseudomonas aeruginosa) peuvent revêtir une allure épidémique. Elles sont alors redoutables et peuvent entraîner la fermeture provisoire du service dans lequel elles sévissent. Il devient alors impérieux de rechercher la filière épidémiologique de ces infections hospitalières, pour en trouver l’origine (il s’agit très souvent de solutions dites “aseptiques” utilisées pour la désinfection du matériel et des sondes médicales non autoclavables), ou pour disculper le personnel soignant, éventuellement porteur sain (gorge, selles) de bacilles pyocyaniques non responsables de l’épidémie. Pour cette enquête épidémiologique, on doit rechercher si toutes les souches de bacille pyocyanique, isolées au cours de l’épidémie, sont identiques ou non. Suite à l’identification d’espèce, la détermination du groupe antigénique O fournit une information indispensable et parfois suffisante pour les enquêtes épidémiologiques. 2- BUT DU TEST Les antisérums P. aeruginosa sont destinés à l'identification sérologique des cultures de P. aeruginosa par la méthode d'agglutination sur lame, à des fins épidémiologiques. 3- PRINCIPE Le test repose sur l'agglutination, par des sérums spécifiques, de bactéries possédant les antigènes correspondants. Sérums agglutinants anti-pyocyaniques (anti-O) Suivant la classification établie par HABS (1) et complétée par le Sous-Comité International des Pseudomonas, il existe 16 groupes antigéniques O numérotés de 1 à 16. Ces antisérums sont obtenus par immunisation de lapin au moyen de suspensions bactériennes chauffées (l’antigène H thermolabile est ainsi détruit). La spécificité est ensuite obtenue par saturation croisée. 1) Sérums monovalents 16 sérums monovalents numérotés de 1 à 16 sont disponibles. Il existe de fortes réactions croisées entre les groupes 0 : 2 et 0 : 5, d’une part, et entre les groupes 0 : 7 et 0 : 8 d’autre part, ainsi qu’entre les groupes 0 : 13 et 0 : 14. Les sérums monovalents correspondant à ces groupes sont absorbés en conséquence. 2) Sérums polyvalents Pour faciliter le typage, 4 mélanges de sérums sont préparés et désignés par les sigles PMA, PME, PMC et PMF. Leur composition est la suivante : PMA = P1 + P3 + P4 + P6 PME = P2 + P5 + P15 + P16 PMC = P9 + P10 + P13 + P14 PMF = P7 + P8 + P11 + P12 4- PRÉSENTATION Les sérums polyvalents et les sérums monovalents sont présentés en flacons compte-gouttes de 3 ml (60 tests) • Sérums polyvalents Antiserum Pseudomonas aeruginosa polyvalent PMA Code : 58922 Antiserum Pseudomonas aeruginosa polyvalent PMC Code : 58942 Antiserum Pseudomonas aeruginosa polyvalent PME Code : 58932 Antiserum Pseudomonas aeruginosa polyvalent PMF Code : 58952 Code : 58901 Code : 58902 Code : 58903 Code : 58904 Code : 58905 Code : 58906 Code : 58907 Code : 58908 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P9 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P10 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P11 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P12 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P13 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P14 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P15 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P16 Code : 58909 Code : 58910 Code : 58911 Code : 58912 Code : 58913 Code : 58914 Code : 58915 Code : 58916 • Sérums monovalents Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P1 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P2 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P3 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P4 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P5 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P6 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P7 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P8 1 5- CONSERVATION Les sérums conservés à + 2 - 8°C et en absence de contamination sont stables jusqu'à la date de péremption indiquée sur le coffret (y compris après ouverture). 6- MATÉRIEL NÉCESSAIRE NON FOURNI • Lame de verre • Õse en plastique ou en platine • Eau physiologique 7- PRÉCAUTIONS D'UTILISATION • Respecter à tout moment les techniques et précautions en vigueur en matière de protection contre les dangers microbiologiques, tant pour la manipulation que pour l'élimination du matériel et des produits biologiques utilisés pour la réaction d'agglutination. • Ces sérums contiennent de l'azoture de sodium à une concentration < 0,1%. L’azoture de sodium peut réagir avec le plomb ou le cuivre présents dans les tuyaux d’évacuation et produire ainsi des azotures métalliques explosifs. Lors de leur élimination, rincer abondamment à grande eau pour éviter la formation de dépôts d’azoture. • Ne pas diluer les réactifs. 8- MODE OPÉRATOIRE Le sérotypage est effectué, après identification de l'espèce, à partir d'une culture pure et fraîche de P. aeruginosa isolée sur milieu gélosé non sélectif. Réaliser un contrôle de la souche à tester en eau physiologique : • Prélever 1 öse de la culture. • Mettre ces bactéries en suspension dans une goutte d'eau physiologique en prenant soin de faire une suspension homogène. Il ne doit pas y avoir d'agglutination avec l'eau physiologique. S'il y a agglutination, il s'agit d'une souche auto-agglutinable et le test avec les antisérums n'est pas réalisable. • Rechercher d’abord l’agglutination avec les sérums polyvalents, puis avec les sérums spécifiques correspondant au mélange donnant une agglutination nette. • Déposer sur une lame 1 goutte d'immunsérum. • Prélever 1 öse d'une culture pure et fraîche de P. aeruginosa. • Mettre ces bactéries en suspension dans la goutte de sérum en prenant soin de faire une suspension homogène par adjonction progressive des bactéries dans le sérum. • Agiter la lame par un léger mouvement rotatif. • Observer le mélange à l'oeil nu au-dessus d'une surface sombre ou au-dessus d'un miroir concave. 9- INTERPRETATION DES RÉSULTATS Une réaction positive se traduit par l'apparition d'une agglutination en 5 minutes maximum. L’agglutination O est fine et régulière et se distingue très facilement de fragments de colonie bactérienne mal émulsionnés éventuellement présents. Remarque : En cas d’échec (par exemple avec des souches produisant beaucoup d’antigènes muqueux), il est conseillé d’effectuer une suspension très épaisse en eau distillée à partir d’une culture pure et fraîche prélevée sur gélose, de chauffer cette suspension à 120°C pendant 30 minutes (autoclave). Cette suspension est centrifugée, le surnageant est éliminé, et la détection est réalisée à partir du culot bactérien. 10-PERFORMANCES / CONTRÔLE QUALITÉ DU TEST L'activité de chaque sérum agglutinant anti-Pseudomonas aeruginosa est contrôlée à l'aide d'un panel de souches de référence suivant : Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Souches aeruginosa CIP 59.33 aeruginosa CIP 59.34 aeruginosa CIP 59.35 aeruginosa CIP 59.36 aeruginosa CIP 59.37 aeruginosa CIP 59.39 aeruginosa CIP 59.38 aeruginosa CIP 59.40 aeruginosa CIP 59.41 aeruginosa CIP 59.43 aeruginosa CIP 59.44 aeruginosa CIP 59.45 aeruginosa CIP 60.92 aeruginosa CIP 72.12 aeruginosa CIP 72.13 aeruginosa CIP 74.21 / / / / / / / / / / / / / ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC 33348 33349 33350 33351 33352 33354 33353 33355 33356 33357 33358 33359 33360 Sérotype P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11 P12 P13 P14 P15 P16 2 11-CONTRÔLE QUALITÉ DU FABRICANT Tous les produits fabriqués et commercialisés par la société Bio-Rad sont placés sous un système d'assurance qualité de la réception des matières premières jusqu'à la commercialisation des produits finis. Chaque lot de produit fini fait l'objet d'un contrôle de qualité et n'est commercialisé que s'il est conforme aux critères d'acceptation. La documentation relative à la production et au contrôle de chaque lot est conservée par le fabricant. 12-LIMITES D’UTILISATION • L'identification d'espèce bactérienne doit être effectuée avant la détermination du sérogroupe. • 5% environ de souches de Pseudomonas aeruginosa sont instables, auto-agglutinables. • 1% environ de souches stables de Pseudomonas aeruginosa appartiennent à d’autres groupes que 1 à 16. L’intérêt pratique du typage de ces nouveaux groupes O paraît limité. 13-RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1.HABS I. Z. Hyg., 144, 218-228. 2.VIEU J.F., ALLOS G., HASSAN-MASSOUD B., SANTOS-FERREIRA M.O. et TSELENTIS G.. Existe-t-il une épidémiologie géographique des sérogroupe O de Pseudomonas aeruginosa. Bull. Soc. Path. Ex., 1984, 77, 288-294. Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33 04/2003 code: 18317 - A4 3 ANTISERUM PSEUDOMONAS AERUGINOSA SEROTIPIFICACION DE LA PSEUDOMONAS AERUGINOSA IVD 1- VALOR CLINICO En el hospital, las infecciones de Pseudomonas aeruginosa pueden adquirir proporciones epidémicas. Esta gravísima situación puede requerir el cierre temporal del departamento en el que se han producido estas infecciones. Es fundamental investigar el recorrido epidemiológico de estas infecciones hospitalarias para identificar su origen (a menudo llamadas soluciones “asépticas” utilizadas para desinfectar los instrumentos no autoclaves y los catéteres), o para excluir la responsabilidad del personal de enfermería, portadores posiblemente sanos (garganta, deposiciones) de la Pseudomonas aeruginosa, no responsables de la epidemia. Este estudio epidemiológico deberá determinar si todas las cepas de Pseudomonas aeruginosa aisladas durante la epidemia son idénticas. Tras la identificación de las especies, la determinación del grupo del antígeno O ofrece una información fundamental y a veces suficiente para los estudios epidemiológicos. 2- USO DESTINADO Los antisueros de la P. aeruginosa se utilizan para la identificación serológica de los cultivos de P. aeruginosa mediante el método de aglutinación en portaobjetos y con fines epidemiológicos. 3- PRINCIPIO La prueba se basa en la aglutinación, con determinados sueros, de lasbacterias que poseen los correspondientes antígenos. Suero aglutinante (anti-O) de la anti-Pseudomonas aeruginosa Según la clasificación establecida por Habs (1) y completada por el Subcomité Internacional de Pseudomonas, hay 16 grupos de antígenos-O, numerados del 1 al 16. Estos antisueros se obtienen inmunizando conejos con suspensiones bacterianas calentadas (que destruyen el antígeno-H termolábil). A continuación se determina la especificidad mediante la saturación cruzada. 1) Sueros monovalentes Se encuentran disponibles 16 sueros monovalentes, numerados del 1 al 16. Entre los grupos O:2 y O:5 se observan fuertes reacciones cruzadas, y entre los grupos O:7 y O:8 y entre los grupos O:13 y O:14. Por consiguiente, los sueros monovalentes correspondientes a estos grupos son absorbidos. 2) Sueros polivalentes Para facilitar el tipificado, se han preparado 4 mexclas de sueros y se han designado con los acrónimos PMA, PME, PMC y PMF. Tienen las siguientes composiciones: PMA = P1 + P3 + P4 + P6 PME = P2 + P5 + P15 + P16 PMC = P9 + P10 + P13 + P14 PMF = P7 + P8 + P11 + P12 4- COMO SE SUMINISTRAN Los sueros polivalentes y los sueros monovalentes se suministran en frascos cuentagotas de 3 ml (60 pruebas). • Sueros Polyvalentes Antiserum Pseudomonas aeruginosa polyvalent PMA Código : 58922 Antiserum Pseudomonas aeruginosa polyvalent PMC Código : 58942 Antiserum Pseudomonas aeruginosa polyvalent PME Código : 58932 Antiserum Pseudomonas aeruginosa polyvalent PMF Código : 58952 Código : 58901 Código : 58902 Código : 58903 Código : 58904 Código : 58905 Código : 58906 Código : 58907 Código : 58908 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P9 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P10 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P11 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P12 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P13 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P14 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P15 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P16 • Sueros monovalentes Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P1 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P2 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P3 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P4 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P5 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P6 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P7 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P8 Código : 58909 Código : 58910 Código : 58911 Código : 58912 Código : 58913 Código : 58914 Código : 58915 Código : 58916 1 5- ALMACENAJE Los sueros almacenados a +2 – 8ºC en ausencia de contaminación se mantienen estables hasta la fecha de caducidad que se indica en el kit (incluso una vez abiertos). 6- MATERIAL NECESARIO PERO NO SUMINISTRADO • Portaobjetos de cristal. • Asa de extensión de plástico o de platino • Suero fisiológico 7- PRECAUCIONES DE USO • Observe siempre las técnicas y las precauciones habituales relacionadas con la protección contra los riesgos microbiológicos para la manipulación y la eliminación de los materiales y los productos biológicos utilizados para la reacción de la aglutinación. • Estos sueros contienen azida de sodio < 0,1%. La azida de sodio puede reaccionar con el plomo o el cobre presente en las tuberías formando azidas metálicas explosivas. Cuando elimine estos reactivos, aclare con abundante agua para evitar la formación de depósitos de azidas. • No diluya los reactivos. 8- PROCEDIMIENTO La serotipificación se realiza tras identificar las especies en un cultivo fresco y puro de P. aeruginosa aislado en un medio de agar no selectivo. Realice una prueba de calidad en la cepa que vaya a probar en el suero fisiológico: • Tome un bucle de cultivo. • Coloque estas bacterias en una gota de suero fisiológico asegurándose que resulte una suspensión homogénea. No debería observarse ninguna aglutinación con el suero fisiológico. Si se produce la aglutinación, significa que corresponde a una cepa autoaglutinante y no puede realizarse la prueba con los antisueros. • Empiece probando la aglutinación con los sueros polivalentes, después con los sueros específicos correspondientes a la mezcla que ha ofrecido una marcada aglutinación. • Deposite 1 gota de cada suero inmune en el portaobjetos. • Tome un bucle de cultivo fresco y puro de P. aeruginosa. • Coloque estas bacterias en cada gota de suero asegurándose que resulte una suspensión homogénea y vaya añadiendo gradualmente bacterias al suero. • Agite el portaobjetos con un suave movimiento rotatorio. • Examine la mezcla a simple vista encima de una superficie oscura o encima de un espejo cóncavo. 9- INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS Una reacción positiva corresponde a la aparición de la aglutinación en un plazo máximo de 5 minutos. La aglutinación del antígeno-O es fina y regular y puede distinguirse fácilmente de los fragmentos escasamente emulsionados de la colonia bacteriana. Nota : : En caso de fallo (por ejemplo con las cepas que producen muchos antígenos mucosos) se recomienda preparar una suspensión muy espesa en agua destilada de un cultivo fresco y puro en un agar y calentar esta suspensión a 120ºC durante 30 minutos (autoclave). Esta suspensión se centrifuga, se elimina el sobrenadante y se realiza la prueba en la masa bacteriana). 10-RESULTADOS DE LA PRUEBA/CONTROL DE CALIDAD La actividad de todos los sueros aglutinantes de la Pseudomonas aeruginosa se controlan con la siguiente tabla de cepas de referencia: Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Cepas aeruginosa CIP 59.33 aeruginosa CIP 59.34 aeruginosa CIP 59.35 aeruginosa CIP 59.36 aeruginosa CIP 59.37 aeruginosa CIP 59.39 aeruginosa CIP 59.38 aeruginosa CIP 59.40 aeruginosa CIP 59.41 aeruginosa CIP 59.43 aeruginosa CIP 59.44 aeruginosa CIP 59.45 aeruginosa CIP 60.92 aeruginosa CIP 72.12 aeruginosa CIP 72.13 aeruginosa CIP 74.21 / / / / / / / / / / / / / ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC 33348 33349 33350 33351 33352 33354 33353 33355 33356 33357 33358 33359 33360 Serotipo P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11 P12 P13 P14 P15 P16 2 11-CONTROL DE CALIDAD DEL FABRICANTE Todos los reactivos fabricados se preparan de conformidad con nuestro Sistema de Calidad, desde la recepción de las materias primas hasta la comercialización final del producto. Todos los lotes se someten a evaluaciones del control de calidad y solamente se lanzan al mercado tras comprobar el cumplimiento de los criterios de aceptación previamente establecidos. Se utiliza Bio-Rad para los registros relativos a la producción y al control de cada lote individual. 12-LIMITACIONES DE USO • La identificación de las especies bacterianas debe realizarse antes de determinar el serogrupo. • Aproximadamente el 5% de las cepas de Pseudomonas aeruginosa son inestables y autoaglutinantes. • Aproximadamente el 1% de las cepas de Pseudomonas aeruginosa pertenecen a grupos distintos del 1 al 16. El tipificar estos nuevos grupos O no parece tener demasiado valor práctico. 13-REFERENCIAS 1.HABS I. Z. Hyg., 144, 218-228. 2.VIEU J.F., ALLOS G., HASSAN-MASSOUD B., SANTOS-FERREIRA M.O. et TSELENTIS G.. Existe-t-il une épidémiologie géographique des sérogroupe O de Pseudomonas aeruginosa. Bull. Soc. Path. Ex., 1984, 77, 288-294. Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33 09/2003 code: 18318 - A4 3 ANTISERUM PSEUDOMONAS AERUGINOSA SEROTYPISIERUNG VON PSEUDOMONAS AERUGINOSA IVD 1- KLINISCHE BEDEUTUNG Pseudomonas aeruginosa-Infektionen können in Krankenhäusern epidemieartige Ausmaße annehmen. Eine solch ernste Situation kann zur vorübergehenden Schließung der Station, in der die Infektion ausgebrochen ist, führen. Es ist daher von wesentlicher Bedeutung, den epidemiologischen Weg dieser Krankenhausinfektionen aufzuklären und den Ausgangsherd zu identifizieren (häufig sind dies so genannte “aseptische” Lösungen zur Desinfektion von nicht autoklavierbaren Geräten und Kathetern) und unter dem Pflegepersonal nach Trägern (Sputum,Stuhlproben) von Pseudomonas aeruginosa zu suchen sowie möglicherweise gesunde Überträger, die nicht für den Infektionsausbruch verantwortlich sind, auszuschließen. Im Rahmen der epidemiologischen Überwachung muss bestimmt werden, ob alle während des Ausbruchs Pseudomonas aeruginosa-Stämme identisch sind. identifizierten Nach Identifizierung der Spezies liefert die Bestimmung der O-Antigen-Gruppen hierfür wesentliche und z.T. ausreichende Informationen. 2- VERWENDUNGSZWECK P. aeruginosa-Antiseren sind für die serologische Identifizierung von P. aeruginosa-Kulturen mittels Objektträgeragglutination bei epidemiologischen Untersuchungen vorgesehen. 3- TESTPRINZIP Der Test basiert auf der Agglutination von Bakterien mit entsprechenden Antigene mit den spezifischen Antiseren. Agglutinierende Anti-Pseudomonas aeruginosa (anti-O)-Antiseren Gemäß der von Habs (1) festgelegten und dem Internationalen Pseudomonas-Sub-Committee vervollständigten Klassifizierung existieren 16 O-Antigen-Gruppen, die von 1 bis 16 durchnummeriert sind. 1) Monovalente Seren Es stehen 16 monovalente Seren zur Verfügung, die von 1 bis 16 durchnummeriert sind. Starke Kreuzreaktionen treten mit den 0-Antigengruppen O:2 und O:5 sowie mit den 0-Antigengruppen O:7 und O:8 auf und zwischen den 0-Antigengruppen O:13 und O:14 . Daher werden die entsprechenden monovalenten Antiseren konsequent absorbiert. 2) Polyvalente Seren Um die Typisierung zu vereinfachen , stehen 4 Mischungen von Antiseren zur Verfügung, die mit den Akronymen PMA, PME, PMC und PMF bezeichnet werden. PMA = P1 + P3 + P4 + P6 PME = P2 + P5 + P15 + P16 PMC = P9 + P10 + P13 + P14 PMF = P7 + P8 + P11 + P12 4- INHALT DER TESTPACKUNG Die polyvalenten und monovalenten Seren werden in Tropffläschchen mit jeweils 3 ml (60 Tests) geliefert. • Polyvalente Seren Antiserum Pseudomonas aeruginosa polyvalent PMA Art.Nr: : 58922 Antiserum Pseudomonas aeruginosa polyvalent PMC Art.Nr : 58942 Antiserum Pseudomonas aeruginosa polyvalent PME Art.Nr: 58932 Antiserum Pseudomonas aeruginosa polyvalent PMF Art.Nr : 58952 Art.Nr : 58901 Art.Nr : 58902 Art.Nr : 58903 Art.Nr : 58904 Art.Nr : 58905 Art.Nr : 58906 Art.Nr : 58907 Art.Nr : 58908 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P9 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P10 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P11 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P12 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P13 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P14 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P15 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P16 Art.Nr : 58909 Art.Nr : 58910 Art.Nr : 58911 Art.Nr : 58912 Art.Nr : 58913 Art.Nr : 58914 Art.Nr : 58915 Art.Nr : 58916 • Monovalente Seren Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P1 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P2 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P3 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P4 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P5 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P6 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P7 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P8 1 5- LAGERUNG Bei +2-8°C gelagerte Seren sind (nach dem Öffnen und ohne Kontamination) bis zu dem auf der Packung angegebenen Verfallsdatum haltbar (auch dem Öffnen). 6- ZUSÄTZLICH BENÖTIGTE MATERIALIEN • Glasobjektträger. • Kunststoff- oder Platin-Impföse. • Physiologische Kochsalzlösung. 7- VORSICHTSMASSNAHMEN BEI DER VERWENDUNG • Beachten Sie beim Umgang und bei der Entsorgung von biologischen Materialien, die für Agglutinationsreaktionen verwendet werden, stets die aktuellen Verfahren Techniken und Vorsichtsmaßnahmen zum Schutz gegen mikrobiologische Gefahren. • Die Seren enthalten < 0,1% Natriumazid. Natriumazid kann mit Blei oder Kupfer in Leitungen unter Bildung explosiver Metallazide reagieren. Um die Azidbildung zu vermeiden, Leitungen mit reichlich Wasser nachspülen, wenn diese Reagenzien über den Abfluss entsorgt werden. • Die Antiseren nicht verdünnen. 8- TESTABLAUF Die Serotypisierung wird nach der Identifizierung der Spezies mit frischem Zellmaterial einer P. aeruginosa Reinkultur durchgeführt, die auf einem nicht- selektivem Nährboden isoliert wurde.. Vor der Typisierung sollte eine Kontrolle der Teststämme in physiologischer Kochsalzlösung durchgeführt werden: • Eine Impföse mit Zellmaterial abimpfen . • Die Bakterien in schrittweise in physiologischer Kochsalzlösung suspendieren, bis eine homogene Suspension vorliegt. In der physiologischen Kochsalzlösung darf keine Agglutination auftreten . Falls doch eine Agglutination beobachtet wird, handelt es sich um einen autoagglutinierenden Stamm. Eine weitere Typisierung mit den Antiseren kann daher nicht erfolgen. • Zunächst werden die Teststämme auf ihre Agglutination mit den polyvalenten Seren überprüft, anschließend wird mit den entsprechenden monovalenten Antiseren der Mischung weitergetestet, die eine Agglutination zeigt . • Einen Tropfen des Antiserums auf einen Objektträger geben. • Eine Impföse mit frischem Zellmaterial einer P. aeruginosa-Reinkultur abimpfen. • Die Bakterien schrittweise in dem Antiserum suspendieren, bis eine möglichst homogene Suspension vorliegt. • Den Objektträger schwenken. • Die Mischung mit bloßem Auge über einer dunklen Oberfläche oder über einem konkaven Spiegel untersuchen. 9- INTERPRETATION DER ERGEBNISSE Die Reaktion ist positiv , wenn innerhalb von höchstens 5 Minuten eine Agglutination auftritt. Die O-Antigen-Agglutination ist fein und gleichmässig und leicht von Fragmenten der Bakterienkolonie zu unterscheiden. Anmerkung : Treten Schwierigkeiten bei der Testdurchführung auf (zum Beispiel bei Stämmen mit schleimigem Koloniewachstum) wird empfohlen, eine sehr dichte Bakteriensuspension in destilliertem Wasser mit einer frischen Reinkultur von Agarplatten herzustellen und diese 30 Minuten auf 120°C zu erhitzen (Autoklavieren). Die Suspension wird anschließend abzentrifugiert, der Überstand entfernt und ein neuer Test mit dem Bakteriensediment durchgeführt. 10-TESTEIGENSCHAFTEN/QUALITÄTSKONTROLLE Die Reaktivität jedes agglutinierenden Pseudomonas aeruginosa-Serums wird mit folgenden Referenzstämmen kontrolliert: Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Stämme aeruginosa CIP 59.33 aeruginosa CIP 59.34 aeruginosa CIP 59.35 aeruginosa CIP 59.36 aeruginosa CIP 59.37 aeruginosa CIP 59.39 aeruginosa CIP 59.38 aeruginosa CIP 59.40 aeruginosa CIP 59.41 aeruginosa CIP 59.43 aeruginosa CIP 59.44 aeruginosa CIP 59.45 aeruginosa CIP 60.92 aeruginosa CIP 72.12 aeruginosa CIP 72.13 aeruginosa CIP 74.21 / / / / / / / / / / / / / ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC 33348 33349 33350 33351 33352 33354 33353 33355 33356 33357 33358 33359 33360 Serotyp P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11 P12 P13 P14 P15 P16 2 11-QUALITÄTSKONTROLLE DES HERSTELLERS Alle von der Firma Bio-Rad hergestellten Reagenzien unterliegen einem Qualitätssicherungssystem vom Rohstoffeingang bis zur Vermarktung der Fertigprodukte. Jede Fertigproduktcharge wird einer Qualitätskontrolle unterzogen und nur dann verkauft, wenn sie den Abnahmekriterien entspricht. Die Unterlagen bezüglich Herstellung und Kontrolle der einzelnen Chargen werden bei Bio-Rad aufbewahrt. 12-GRENZEN DES TESTS • Die Identifizierung der Bakterienspezies muss vor der Bestimmung der Serogruppe erfolgen. • Ca. 5% der Pseudomonas aeruginosa-Stämme sind instabil und autoagglutinabel. • Ca. 1% der stabilen Pseudomonas aeruginosa-Stämme gehören anderen Gruppen als den Gruppen 1 bis 16 an. Die Typisierung dieser neuen O-Gruppen ist jedoch von begrenztem praktischem Wert. 13-LITERATUR 1.HABS I. Z. Hyg., 144, 218-228. 2.VIEU J.F., ALLOS G., HASSAN-MASSOUD B., SANTOS-FERREIRA M.O. et TSELENTIS G.. Existe-t-il une épidémiologie géographique des sérogroupe O de Pseudomonas aeruginosa. Bull. Soc. Path. Ex., 1984, 77, 288-294. Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33 09/2003 code: 18319 - A4 3 ANTISERUM PSEUDOMONAS AERUGINOSA SIEROTIPIZZAZIONE DELLA PSEUDOMONAS AERUGINOSA IVD 1- INTERESSE CLINICO In ambito ospedaliero, le infezioni da Pseudomonas aeruginosa possono assumere proporzioni epidemiche. Tale situazione, molto grave, può rendere necessaria la chiusura temporanea del reparto in cui si verificano le infezioni. È fondamentale svolgere indagini accurate del percorso epidemiologico di tali infezioni ospedaliere, al fine di individuarne l’origine (molto spesso le cosiddette soluzioni “asettiche” impiegate per la disinfezione di strumenti e cateteri non autoclavabili), o di escludere la responsabilità del personale infermieristico, possibile portatore sano (espettorato, feci) di Pseudomonas aeruginosa non responsabile dell’epidemia. L’indagine epidemiologica ha lo scopo di determinare se tutti i ceppi di Pseudomonas aeruginosa isolati durante l’epidemia sono identici. Un volta identificate le specie, la determinazione del gruppo antigene O fornisce le informazioni essenziali e talvolta sufficienti per le indagini epidemiologiche. 2- SCOPO DEL TEST Gli antisieri P. aeruginosa sono utilizzati per l'identificazione sierologica di colture di P. aeruginosa mediante metodo di agglutinazione su vetrino per scopi epidemiologici. 3- PRINCIPIO Il test si basa sull’agglutinazione, mediante sieri specifici, di batteri che possiedono gli antigeni corrispondenti. Sieri agglutinanti Anti-Pseudomonas aeruginosa (anti-O) Secondo la classificazione stabilita da Habs (1) e completata dall’ International Pseudomonas Sub-Committee, esisitono 16 gruppi antigene O, numerati da 1 a 16. I presenti antisieri sono ricavati mediante l’immunizzazione di conigli con sospensioni batteriche dopo riscaldamento (in modo da distruggere l’antigene H labile al calore). La specificità è successivamente determinata mediante saturazione crociata. 1) Sieri monovalenti Sono disponibili 16 sieri monovalenti numerati da 1 a 16. Tra i gruppi O:2 e O:5, tra i gruppi O:7 e O:8 e tra i gruppi O:13 e O:14 si osservano forti reazioni crociate. Di conseguenza, i sieri monovalenti corrispondenti a tali gruppi vengono assorbiti. 2) Sieri polivalenti Per facilitare la tipizzazione, vengono preparate 4 miscele di siero designate con gli acronimi PMA, PME, PMC e PMF. Questi presentano le seguenti composizioni: PMA = P1 + P3 + P4 + P6 PME = P2 + P5 + P15 + P16 PMC = P9 + P10 + P13 + P14 PMF = P7 + P8 + P11 + P12 4- CONFEZIONE I sieri monovalenti e polivalenti sono confezionati in flaconi contagocce da 3 ml (60 test). • Sieri polivalenti Antiserum Pseudomonas aeruginosa polyvalent PMA Codice : 58922 Antiserum Pseudomonas aeruginosa polyvalent PMC Codice : 58942 Antiserum Pseudomonas aeruginosa polyvalent PME Codice : 58932 Antiserum Pseudomonas aeruginosa polyvalent PMF Codice : 58952 Codice : 58901 Codice : 58902 Codice : 58903 Codice : 58904 Codice : 58905 Codice : 58906 Codice : 58907 Codice : 58908 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P9 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P10 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P11 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P12 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P13 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P14 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P15 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P16 • Sieri monovalenti Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P1 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P2 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P3 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P4 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P5 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P6 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P7 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P8 Codice : 58909 Codice : 58910 Codice : 58911 Codice : 58912 Codice : 58913 Codice : 58914 Codice : 58915 Codice : 58916 1 5- CONSERVAZIONE I sieri conservati a + 2 - 8 °C in assenza di contaminazioni sono stabili fino alla data di scadenza indicata sulla confezione (anche se aperti). 6- MATERIALE NECESSARIO MA NON FORNITO • Vetrino. • Ansa da inoculo in plastica o platino. • Soluzione fisiologica. 7- PRECAUZIONI PER L’USO • Attenersi sempre alle tecniche e precauzioni di routine in materia di protezione da rischi biologici, per la manipolazione e l'eliminazione di materiale e altri prodotti biologici impiegati per la reazione di agglutinazione. • I sieri contengono < 0,1% di sodio azide. La sodio azide può reagire con il piombo o il rame presenti nelle tubature e formare azidi metalliche esplosive. Eliminare tali reagenti risciacquando abbondantemente con acqua al fine di evitare la formazione di depositi di azidi. • Non diluire i reagenti. 8- PROCEDURA La sierotipizzazione va eseguita dopo l’identificazione delle specie su una coltura fresca e pura di P. aeruginosa isolata su terreno agar non selettivo. Eseguire un test di controllo sul ceppo da testare in soluzione fisiologica: • Prelevare un’ansa di coltura. • Sospendere i batteri in una goccia di soluzione fisiologica, assicurando una sospensione omogenea. Non si dovrebbero osservare agglutinazioni con la soluzione fisiologica. Il verificarsi di un’agglutinazione indica che si tratta di un ceppo auto-agglutinante e non è possibile interpretare la reazione con l’antisiero. • Cominciare con l'esame dell'agglutinazione con i sieri polivalenti, successivamente con i sieri specifici corrispondenti alla miscela che presentano agglutinazione marcata. • Dispensare 1 goccia di ciascun siero immune sul vetrino. • Prelevare un'ansa di cultura fresca e pura di P. aeruginosa. • Sospendere detti batteri in una goccia di siero, aggiungere gradualmente i batteri al siero in modo da garantire una sospensione omogenea. • Agitare il vetrino con un leggero movimento rotatorio. • Esaminare la miscela ad occhio nudo su una superficie scura o su uno specchio concavo. 9- INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI Una reazione positiva corrisponde all’apparizione di agglutinazione in un massimo di 5 minuti. L’agglutinazione con antigene O risulta fine e normale e si distingue con facilità da qualunque altro frammento scarsamente emulsionato di colonia batterica. Nota : : Nel caso di fallimento del test (per esempio con ceppi che producono molti antigeni della mucosa), si raccomanda di preparare una sospensione molto densa in acqua distillata a partire da una coltura fresca e pura su terreno agar e riscaldare la sospensione a 120 °C per 30 minuti (in autoclave). Centrifugare tale sospensione, eliminare il surnatante ed eseguire il test sul precipitato batterico. 10-PRESTAZIONI DEL TEST / CONTROLLO DI QUALITA L’attività di ciascun siero agglutinante Pseudomonas aeruginosa è controllata mediante i seguenti panel di ceppi di riferimento: Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Ceppi aeruginosa CIP 59.33 aeruginosa CIP 59.34 aeruginosa CIP 59.35 aeruginosa CIP 59.36 aeruginosa CIP 59.37 aeruginosa CIP 59.39 aeruginosa CIP 59.38 aeruginosa CIP 59.40 aeruginosa CIP 59.41 aeruginosa CIP 59.43 aeruginosa CIP 59.44 aeruginosa CIP 59.45 aeruginosa CIP 60.92 aeruginosa CIP 72.12 aeruginosa CIP 72.13 aeruginosa CIP 74.21 / / / / / / / / / / / / / ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC 33348 33349 33350 33351 33352 33354 33353 33355 33356 33357 33358 33359 33360 Sierotipo P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11 P12 P13 P14 P15 P16 2 11-CONTROLLO DI QUALITA DEL PRODUTTORE Tutti i reagenti prodotti sono preparati in ottemperanza al nostro Sistema di Qualità, dal ricevimento delle materie prime fino alla commercializzazione finale del prodotto. Ciascun lotto è sottoposto a valutazioni per il controllo della qualità ed è immesso sul mercato solo se conforme ai criteri di accettazione prestabiliti. I dati relativi alla produzione e al controllo di ciascun lotto sono tenuti presso Bio-Rad. 12-LIMITI D’USO • Prima della determinazione del sierogruppo deve essere eseguita l’identificazione delle specie batteriche. • Il 5% circa dei ceppi di Pseudomonas aeruginosa risulta instabile e autoagglutinante. • L’1% circa dei ceppi di Pseudomonas aeruginosa appartiene a gruppi diversi da quelli compresi tra 1 e 16. La tipizzazione di nuovi gruppi O presenta un valore pratico limitato. 13-BIBLIOGRAFIA 1.HABS I. Z. Hyg., 144, 218-228. 2.VIEU J.F., ALLOS G., HASSAN-MASSOUD B., SANTOS-FERREIRA M.O. et TSELENTIS G.. Existe-t-il une épidémiologie géographique des sérogroupe O de Pseudomonas aeruginosa. Bull. Soc. Path. Ex., 1984, 77, 288-294. Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33 09/2003 code: 18320 - A4 3 ANTISERUM PSEUDOMONAS AERUGINOSA DETERMINAÇÃO DO SEROTIPO DE PSEUDOMONAS AERUGINOSA IVD 1- INTERESSE CLINICO Em meio hospitalar, as infecções por Pseudomonas aeruginosa podem assumir proporções epidémicas. Esta situação muito grave pode exigir o encerramento temporário do departamento onde se verifiquem tais infecções. É essencial investigar o percurso epidemiológico destas infecções hospitalares, identificar a sua origem (muitas vezes as chamadas soluções “assépticas” utilizadas para desinfecção de instrumentos e cateteres esterilizáveis em autoclave) ou excluir a responsabilidade do pessoal de enfermagem, possíveis portadores saudáveis (garganta, fezes) de Pseudomonas aeruginosa não responsáveis pela epidemia. Este inquérito epidemiológico deverá determinar se todas as estirpes de Pseudomonas aeruginosa isoladas durante a epidemia são, ou não, idênticas. Depois da identificação das espécies, a determinação do grupo de O-antigénio fornece informações essenciais e, por vezes, suficientes para os inquéritos epidemiológicos. 2- FINALIDADE Os anti-soros P. aeruginosa são utilizados para identificação serológica de culturas de P. aeruginosa pelo método de aglutinação em lâmina, para fins epidemiológicos. 3- PRINCIPIO O teste baseia-se na aglutinação, por soros específicos, de bactérias que possuam os antigénios correspondentes. Soros aglutinantes anti-Pseudomonas aeruginosa (anti-O) De acordo com a classificação estabelecida por Habs (1) e completada pela Subcomissão Internacional de Pseudomonas, existem 16 grupos de O-antigénios, numerados de 1 a 16. Estes anti-soros são obtidos por imunização de coelhos com suspensões bacterianas aquecidas (que destruem o H-antigénio termolábil). A especificidade é então determinada por saturação cruzada. 1) Soros monovalentes Existem 16 soros monovalentes numerados de 1 a 16. Observam-se fortes reacções cruzadas entre os grupos O:2 e O:5, e entre os grupos O:7 e O:8 e entre os grupos O:13 e O:14. Os soros monovalentes correspondentes a estes grupos foram, por isso, absorvidos. 2) Soros polivalentes Para facilitar a classificação, foram preparadas 4 misturas de soros, as quais são designadas pelos acrónimos PMA, PME, PMC e PMF. Apresentam as seguintes composições: PMA = P1 + P3 + P4 + P6 PME = P2 + P5 + P15 + P16 PMC = P9 + P10 + P13 + P14 PMF = P7 + P8 + P11 + P12 4- APRESENTAÇÃO Os soros polivalentes e monovalentes são fornecidos em frascos conta-gotas de 3 ml (60 testes). • Soros polivalentes Antiserum Pseudomonas aeruginosa polyvalent PMA Ref. : 58922 Antiserum Pseudomonas aeruginosa polyvalent PMC Ref. : 58942 Antiserum Pseudomonas aeruginosa polyvalent PME Ref. : 58932 Antiserum Pseudomonas aeruginosa polyvalent PMF Ref. : 58952 Ref. : 58901 Ref. : 58902 Ref. : 58903 Ref. : 58904 Ref. : 58905 Ref. : 58906 Ref. : 58907 Ref. : 58908 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P9 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P10 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P11 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P12 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P13 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P14 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P15 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P16 Ref. : 58909 Ref. : 58910 Ref. : 58911 Ref. : 58912 Ref. : 58913 Ref. : 58914 Ref. : 58915 Ref. : 58916 • Soros monovalentes Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P1 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P2 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P3 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P4 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P5 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P6 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P7 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P8 1 5- CONSERVAÇÃO Os soros conservados a +2-8°C, na ausência de contaminação, mantêm-se estáveis até ao termo do prazo de validade indicado na embalagem (mesmo depois de abertos). 6- MATERIAL NECESSARIO MAS NÃO FORNECIDO • Lâmina de vidro. • Ansa de inoculação em plástico ou platina. • Soro fisiológico. 7- PRECAUÇÕES DE UTILIZAÇÃO • No manuseamento e eliminação de materiais e produtos biológicos utilizados para a reacção de aglutinação, respeitar sempre as técnicas e precauções actualmente vigentes no que diz respeito à protecção contra riscos microbiológicos. • Estes soros contêm < 0,1% de azida sódica. A azida sódica pode reagir com o chumbo ou cobre presentes nas canalizações, formando azidas metálicas explosivas. Na eliminação destes reagentes, lavar as canalizações com água abundante, por forma a evitar a formação de depósitos de azida. • Não diluir os reagentes. 8- MODO DE FUNCIONAMENTO A determinação do serotipo é efectuada, após identificação das espécies, em cultura pura e fresca de P. aeruginosa isolada em meio agar não selectivo. Efectuar um teste de controlo na estirpe a testar em soro fisiológico: • Recolher uma ansa de cultura. • Colocar estas bactérias em suspensão numa gota de soro fisiológico, assegurando a suspensão homogénea. Não deverá observar-se qualquer aglutinação com o soro fisiológico. Se se observar aglutinação, esta corresponde a uma estirpe auto-aglutinante e o teste com anti-soros não poderá ser efectuado. • Comece por testar a aglutinação com soros polivalentes, seguidos dos soros específicos correspondentes à mistura fornecendo uma aglutinação marcada. • Depositar na lâmina 1 gota de soro imune. • Recolher uma ansa de cultura fresca pura de P. aeruginosa. • Colocar estas bactérias em suspensão numa gota de soro, assegurando a suspensão homogénea por adição gradual de bactérias ao soro. • Agitar a lâmina em ligeiro movimento rotativo. • Examinar a mistura a olho nu contra uma superfície escura ou contra um espelho côncavo. 9- INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS Uma reacção positiva corresponde ao aparecimento de aglutinação num máximo de 5 minutos. A aglutinação O-antigénio é fina e regular e distingue-se muito facilmente de quaisquer fragmentos fracamente emulsificados de colónia bacteriana. Nota : Em caso de insucesso (por exemplo, com estirpes que produzam grande quantidade de antigénios de mucosa), recomendase preparar uma suspensão muito espessa em água destilada de cultura fresca e pura em agar e aquecer esta suspensão a 120°C durante 30 minutos (autoclave). Esta suspensão é centrifugada, sendo o sobrenadante eliminado, e o teste é efectuado com o fundo bacteriano. 10-DESEMPENHOS DO TESTE / CONTROLO DE QUALIDADE A actividade de cada soro aglutinante Pseudomonas aeruginosa é controlada com o seguinte painel de estirpes de referência: Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Estirpes aeruginosa CIP 59.33 aeruginosa CIP 59.34 aeruginosa CIP 59.35 aeruginosa CIP 59.36 aeruginosa CIP 59.37 aeruginosa CIP 59.39 aeruginosa CIP 59.38 aeruginosa CIP 59.40 aeruginosa CIP 59.41 aeruginosa CIP 59.43 aeruginosa CIP 59.44 aeruginosa CIP 59.45 aeruginosa CIP 60.92 aeruginosa CIP 72.12 aeruginosa CIP 72.13 aeruginosa CIP 74.21 / / / / / / / / / / / / / ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC 33348 33349 33350 33351 33352 33354 33353 33355 33356 33357 33358 33359 33360 Serotipo P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11 P12 P13 P14 P15 P16 2 11-CONTROLO DA QUALIDADE DE FABRICO Todos os reagentes são fabricados de acordo com o nosso Sistema de Qualidade, desde a recepção das matérias primas até à comercialização final do produto. Cada lote é submetido a avaliações de controlo de qualidade, sendo comercializado apenas quando em total conformidade com os critérios de aceitação predefinidos. Os registos relativos à produção e controlo de cada lote são arquivados pela Bio-Rad. 12-LIMITES DE UTILIZAÇÃO • A identificação das espécies bacterianas deve ser efectuada antes da determinação do serogrupo. • Cerca de 5% das estirpes de Pseudomonas aeruginosa são instáveis e auto-aglutinantes. • Cerca de 1% das estirpes estáveis de Pseudomonas aeruginosa pertencem a grupos diferentes de 1 a 16. A determinação do tipo destes novos grupos O não parece apresentar grande valor prático. 13-REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 1.HABS I. Z. Hyg., 144, 218-228. 2.VIEU J.F., ALLOS G., HASSAN-MASSOUD B., SANTOS-FERREIRA M.O. et TSELENTIS G.. Existe-t-il une épidémiologie géographique des sérogroupe O de Pseudomonas aeruginosa. Bull. Soc. Path. Ex., 1984, 77, 288-294. Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33 09/2003 code: 18321 - A4 3 ANTISERUM PSEUDOMONAS AERUGINOSA SEROTYPNING AV PSEUDOMONAS AERUGINOSA IVD 1- KLINISK BETYDELSE På sjukhus kan Pseudomonas aeruginosa-infektioner anta epidemiska proportioner. Den mycket allvarliga situationen kan kräva temporär avstängning av den avdelning där infektionerna förekommer. Det är mycket viktigt att undersöka den epidemiologiska reaktionsvägen hos sjukhusinfektionerna så att deras ursprung identifieras (mycket ofta så kallade aseptiska lösningar som används för desinficering av instrument och katetrar som inte kan köras i autoklav) eller för att utesluta sjukhuspersonalens ansvar, möjliga friska bärare (hals, avföring) av Pseudomonas aeruginosa som inte orsakar epidemin. Den epidemiologiska undersökningen måste bestämma om alla stammar av Pseudomonas aeruginosa som är isolerade under epidemin är identiska eller inte. Efter artidentifiering ger bestämning av O-antigengruppen nödvändig och ibland tillräcklig information för epidemiologiska undersökningar. 2- AVSEDD ANVÄNDNING P. aeruginosa antisera är avsedda för serologisk identifiering av odlingar av P. aeruginosa med hjälp av objektglasagglutination, i epidemiologiskt syfte. 3- PRINCIP Testet baseras på agglutination i specifika sera av bakterier som har motsvarande antigener. Agglutinationssera anti-Pseudomonas aeruginosa (anti-O) Enligt klassificeringen som etablerats av Habs (1) och slutförts av International Pseudomonas Sub-Committee, finns det 16 Oantigengrupper, numrerade från 1 till 16. Dessa antisera erhålls genom att immunisera kaniner med värmda bakteriesuspensioner (som förstör värmelabilt H-antigen). Specificitet bestäms därefter genom korssaturation. 1) Monovalenta sera Det finns 16 monovalenta sera numrerade från 1 till 16. Kraftiga korsreaktioner observeras mellan grupperna O:2 och O:5, grupperna O:7 och O:8 och grupperna O:13 och O:14. Monovalenta sera motsvarande dessa grupper absorberas följaktligen. 2) Polyvalenta sera För att förenkla typning har fyra serumblandningar beretts som tilldelats akronymerna PMA, PME, PMC och PMF. De har följande sammansättning: PMA = P1 + P3 + P4 + P6 PME = P2 + P5 + P15 + P16 PMC = P9 + P10 + P13 + P14 PMF = P7 + P8 + P11 + P12 4- INNEHÅLL Polyvalenta sera och monovalenta sera levereras i 3 ml droppflaskor (60 test). • Polyvalenta sera Antiserum Pseudomonas aeruginosa polyvalent PMA Kod : 58922 Antiserum Pseudomonas aeruginosa polyvalent PMC Kod : 58942 Antiserum Pseudomonas aeruginosa polyvalent PME Kod : 58932 Antiserum Pseudomonas aeruginosa polyvalent PMF Kod : 58952 Kod : 58901 Kod : 58902 Kod : 58903 Kod : 58904 Kod : 58905 Kod : 58906 Kod : 58907 Kod : 58908 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P9 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P10 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P11 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P12 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P13 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P14 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P15 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P16 Kod : 58909 Kod : 58910 Kod : 58911 Kod : 58912 Kod : 58913 Kod : 58914 Kod : 58915 Kod : 58916 • Monovalenta sera Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P1 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P2 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P3 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P4 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P5 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P6 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P7 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P8 1 5- FÖRVARING Sera som förvaras vid +2–8 °C utan att utsättas för kontamination är stabila till utgångsdatumet på förpackningen (även om de öppnas). 6- NÖDVÄNDIGT MATERIAL SOM EJ INGÅR • Objektglas. • Inokulationsögla av plast eller platina. • Fysiologisk koksaltlösning. 7- FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER VID ANVÄNDNING • Undvik mikrobiologiska risker genom att alltid hantera och eliminera material och biologiska produkter som används vid agglutinationsreaktionen enligt rådande tekniker och angivna försiktighetsåtgärder. • Dessa sera innehåller 0,1 % natriumazid. Natriumazid kan reagera med bly eller koppar i ledningar och bilda explosiva metallazider. Undvik ansamling av azider genom att spola rikligt med vatten när reagenserna slås ut i avloppet. • Späd inte reagenser. 8- FÖRFARANDE Serotypning görs efter artidentifiering på en färsk och ren odling av P. aeruginosa isolerad på ett icke-selektivt agarmedium. Gör ett kontrolltest på stammen som ska testas i fysiologisk saltlösning: • Ta en ögla av odlingen. • Suspendera bakterierna i en droppe med fysiologisk koksaltlösning och se till att få en homogen suspension. Ingen agglutination ska obser veras med fysiologisk koksaltlösning. Om agglutination obser veras motsvarar det en självagglutinerande stam och testet med antisera kan inte utvärderas. • Börja med att testa agglutination med polyvalenta sera, sedan med de specifika sera som motsvarar den blandning som ger en tydlig agglutination. • Applicera 1 droppe immunserum på objektglaset. • Ta en ögla ren och färsk odling av P. aeruginosa. • Suspendera bakterierna i en serumdroppe och se till att bakterier gradvis tillsätts i serumet genom homogen suspension. • Skaka objektglaset varsamt med en mjukt roterande rörelse. • Undersök blandningen med blotta ögat över en mörk yta eller över en konkav spegel. 9- UTVÄRDERING AV RESULTATEN En positiv reaktion motsvarar agglutination inom högst 5 minuter. O-antigenagglutination är fin och regelbunden och går mycket lätt att skilja från dåligt emulgerade fragment av bakteriekoloni. Obs : Om testet misslyckas (till exempel med stammar som producerar mycket slemhinneantigen) rekommenderas du att bereda en mycket tjock suspension i destillerat vatten från en färsk och ren odling på agar och värma suspensionen i 120 °C i 30 minuter (autoklav). Suspensionen centrifugeras, supernatanten elimineras och testet utförs på bakteriepelleten. 10-TESTRESULTAT/KVALITETSKONTROLL Aktiviteten hos agglutinationsserum Pseudomonas aeruginosa kontrolleras med följande panel av referensstammar: Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Stammar aeruginosa CIP 59.33 aeruginosa CIP 59.34 aeruginosa CIP 59.35 aeruginosa CIP 59.36 aeruginosa CIP 59.37 aeruginosa CIP 59.39 aeruginosa CIP 59.38 aeruginosa CIP 59.40 aeruginosa CIP 59.41 aeruginosa CIP 59.43 aeruginosa CIP 59.44 aeruginosa CIP 59.45 aeruginosa CIP 60.92 aeruginosa CIP 72.12 aeruginosa CIP 72.13 aeruginosa CIP 74.21 / / / / / / / / / / / / / ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC 33348 33349 33350 33351 33352 33354 33353 33355 33356 33357 33358 33359 33360 Serotyp P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11 P12 P13 P14 P15 P16 2 11-TILLVERKARENS KVALITETSKONTROLL Alla reagenser tillverkas och bereds i enlighet med vårt kvalitetssystem, från mottagandet av råmaterial till den slutliga marknadsföringen av produkten. Varje parti genomgår en kvalitetskontroll och släpps endast ut på marknaden om det överensstämmer med fördefinierade acceptanskriterier. Handlingar som beskriver produktion och kontroll av varje enskilt parti sparas hos Bio-Rad. 12-ANVÄNDNINGENS BEGRÄNSNINGAR • Identifiering av bakterieart måste göras innan serogruppen bestäms. • Omkring 5 % av Pseudomonas aeruginosa-stammarna är instabila och självagglutinerande. • Omkring 1 % av stabila Pseudomonas aeruginosa-stammar tillhör andra grupper än 1 till 16. Typning av dessa nya O-grupper verkar ha ett begränsat praktiskt värde. 13-REFERENSER 1.HABS I. Z. Hyg., 144, 218-228. 2.VIEU J.F., ALLOS G., HASSAN-MASSOUD B., SANTOS-FERREIRA M.O. et TSELENTIS G.. Existe-t-il une épidémiologie géographique des sérogroupe O de Pseudomonas aeruginosa. Bull. Soc. Path. Ex., 1984, 77, 288-294. Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33 11/2003 code: 18322 - A4 3 ANTISERUM PSEUDOMONAS AERUGINOSA SEROTYPEBESTEMMELSE AF PSEUDOMONAS AERUGINOSA IVD 1- KLINISK VÆRDI Pseudomonas aeruginosa-infektioner kan udvikle sig til deciderede epidemier på hospitaler. En sådan alvorlig situation kan kræve lukning af den afdeling, hvor infektionerne optræder. Det er vigtigt at undersøge den epidemiologiske udvikling for disse hospitalsinfektioner for at kunne identificere kilden (ofte anvendes såkaldte "aseptiske" løsninger til desinficering af udstyr og katetre, som ikke kan autoklaveres) eller udelukke sygeplejepersonalets ansvar, der muligvis er sunde smittebærere (hals, afføring) af Pseudomonas aeruginosa, og som ikke er ansvarlige for epidemien. Denne epidemiologiske undersøgelse skal afgøre, om alle Pseudomonas aeruginosa-stammer, som isoleres under epidemien, er identiske. Efter identifikation af arterne giver bestemmelsen af O-gruppen for antigener vigtige og til tider tilstrækkelige oplysninger til de epidemiologiske undersøgelser. 2- FORMÅL P. aeruginosa-antisera anvendes til serologisk identifikation af P. aeruginosa-kulturer ved hjælp af pladeagglutinationsmetoden til epidemiologiske formål. 3- PRINCIP Testen er baseret på agglutination, med specifikke sera, af bakterier, der besidder de tilsvarende antigener. Agglutinationssera til anti-Pseudomonas aeruginosa (anti-O) Ifølge den klassificering, der er etableret af Habs (1) og fuldført af den internationale Pseudomonas-underkomité, findes der 16 Oantigengrupper, som er nummereret fra 1 til 16. Disse antisera opnås ved at vaccinere kaniner med opvarmede bakteriesuspensioner (som ødelægger varmefølsomt H-antigen). Specificiteten bestemmes derefter af krydsmætning. 1) Monovalente sera Der findes 16 monovalente sera, der er nummereret fra 1 til 16. Der observeres stærke krydsreaktioner mellem grupperne O:2 og O:5, mellem grupperne O:7 og O:8 og mellem grupperne O:13 og O:14. Monovalente sera, som svarer til disse grupper, bliver således absorberet. 2) Polyvalente sera Med henblik på at lette typebestemmelsen forberedes 4 serumblandinger, som betegnes af akronymerne PMA, PME, PMC og PMF. De har følgende sammensætninger: PMA = P1 + P3 + P4 + P6 PME = P2 + P5 + P15 + P16 PMC = P9 + P10 + P13 + P14 PMF = P7 + P8 + P11 + P12 4- EMBALLAGE Polyvalente og monovalente sera leveres i pipetteflasker à 3 ml (60 tests). • Polyvalente sera Antiserum Pseudomonas aeruginosa polyvalent PMA Kode : 58922 Antiserum Pseudomonas aeruginosa polyvalent PMC Kode : 58942 Antiserum Pseudomonas aeruginosa polyvalent PME Kode : 58932 Antiserum Pseudomonas aeruginosa polyvalent PMF Kode : 58952 Kode : 58901 Kode : 58902 Kode : 58903 Kode : 58904 Kode : 58905 Kode : 58906 Kode : 58907 Kode : 58908 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P9 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P10 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P11 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P12 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P13 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P14 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P15 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P16 Kode : 58909 Kode : 58910 Kode : 58911 Kode : 58912 Kode : 58913 Kode : 58914 Kode : 58915 Kode : 58916 • Monovalente sera Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P1 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P2 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P3 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P4 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P5 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P6 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P7 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P8 1 5- OPBEVARING Seraene er stabile indtil udløbsdatoen på etiketten, hvis de opbevares ved +2 – 8°C, og der ingen kontamination forekommer (selv i åben tilstand). 6- KRÆVET MATERIALE, DER IKKE MEDFØLGER • Glasplade. • Plastic- eller platininokulationspodepind. • Fysiologisk saltvand. 7- FORHOLDSREGLER FOR BRUG • Benyt altid de aktuelle teknikker og følg de gældende forholdsregler med henblik på forebyggelse af mikrobielle risici ved håndtering og bortskaffelse af materialer og biologiske produkter, der er anvendt i agglutinationsreaktionen. • Seraene indeholder 0,1% natriumazid. Natriumazid kan reagere med bly- eller kobberrør og danne højeksplosive metalazider. Når du fjerner disse reagenser, skal du skylle med rigelige mængder vand for at undgå dannelse af azidaflejringer. • Undgå at fortynde reagenserne. 8- PROCEDURE Serotypebestemmelse udføres efter identifikation af arterne på en frisk, ren P. aeruginosa-kultur, der er isoleret på ikke-selektivt agarmedium. Udfør en kontroltest på den stamme, du vil teste, i fysiologisk saltvand: • Tag en smule af kulturen op med en podepind. • Opløs disse bakterier i en dråbe fysiologisk saltvand, og sørg for en ensartet suspension. Der bør ikke kunne observeres agglutination med fysiologisk saltvand. Hvis der observeres agglutination, er der tale om en selvagglutinerende stamme, og du kan ikke udføre testen med antisera. • Start med at teste agglutinationen med polyvalente sera og derefter med de specifikke sera, som svarer til den blanding, der giver den angivne agglutination. • Placér 1 dråbe immunserum på pladen. • Tag en smule frisk, ren P. aeruginosa-kultur op med en podepind. • Opløs disse bakterier i en serumdråbe, og sørg for en ensartet suspension ved at tilføje bakterier til serum gradvist. • Ryst pladen med en forsigtig, drejende bevægelse. • Undersøg blandingen ved direkte aflæsning, mens du holder pladen hen over en mørk overflade eller et hulspejl. 9- FORTOLKNING AF RESULTATERNE En positiv reaktion viser sig som forekomst af agglutination inden for maksimalt 5 minutter. Agglutination af O-antigen er fin og regelmæssig og meget let at skelne fra eventuelle fragmenter af bakteriekolonier, som ikke er helt emulgerede. Bemærk : Ved fejl (f.eks. med stammer, der producerer mange mucosale antigener) anbefales det at tilberede en meget tyk suspension i destilleret vand fra en frisk, ren kultur på agar og opvarme suspensionen ved 120°C i 30 minutter (autoklavering). Centrifugér suspensionen for at fjerne supernatanten, og udfør testen på den koncentrerede bakterieklump. 10-YDEEVNE FOR TESTEN OG KVALITETSKONTROL Aktiviteten for hvert Pseudomonas aeruginosa-agglutinationsserum kontrolleres ved hjælp af følgende udvalg af referencestammer: Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Stammer aeruginosa CIP 59.33 aeruginosa CIP 59.34 aeruginosa CIP 59.35 aeruginosa CIP 59.36 aeruginosa CIP 59.37 aeruginosa CIP 59.39 aeruginosa CIP 59.38 aeruginosa CIP 59.40 aeruginosa CIP 59.41 aeruginosa CIP 59.43 aeruginosa CIP 59.44 aeruginosa CIP 59.45 aeruginosa CIP 60.92 aeruginosa CIP 72.12 aeruginosa CIP 72.13 aeruginosa CIP 74.21 / / / / / / / / / / / / / ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC 33348 33349 33350 33351 33352 33354 33353 33355 33356 33357 33358 33359 33360 Serotype P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11 P12 P13 P14 P15 P16 2 11-PRODUCENTENS KVALITETSKONTROL Alle producerede reagenser fremstilles ifølge vores kvalitetssikringssystem, lige fra modtagelsen af råmaterialerne til markedsføringen af slutproduktet. Hvert parti gennemgår kvalitetskontrol og markedsføres kun, hvis det opfylder de foruddefinerede kvalitetskriterier. Dokumentation vedrørende produktion og kontrol af hvert parti opbevares inden for Bio-Rad. 12-BEGRÆNSNINGER FOR BRUG • Identifikation af bakteriearterne skal udføres før bestemmelsen af serogruppen. • Omtrent 5 % af Pseudomonas aeruginosa-stammerne er ustabile og selvagglutinerende. • Omtrent 1% af de stabile Pseudomonas aeruginosa-stammer tilhører andre grupper end gruppe 1 – 16. Typebestemmelsen af disse nye O-grupper lader til at være af begrænset praktisk værdi. 13-REFERENCER 1.HABS I. Z. Hyg., 144, 218-228. 2.VIEU J.F., ALLOS G., HASSAN-MASSOUD B., SANTOS-FERREIRA M.O. et TSELENTIS G.. Existe-t-il une épidémiologie géographique des sérogroupe O de Pseudomonas aeruginosa. Bull. Soc. Path. Ex., 1984, 77, 288-294. Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33 11/2003 code: 18323 - A4 3 ANTISERUM PSEUDOMONAS AERUGINOSA URČENÍ SÉROTYPU PSEUDOMONAS AERUGINOSA 1- KLINICKÝ VÝZNAM Infekce způsobené Pseudomonas aeruginosa mohou v nemocnicích nabývat epidemických rorměrů. Tato velmi vážná situace může vyžadovat dočasné uzavření oddělení, kde se tato infekce objevila. Je nezbytně nutné sledovat epidemiologické cesty těchto nemocničních infekcí, aby se nalezl původ infekce (velmi často se jedná o tzv. „aseptické“ roztoky používané pro desinfekci katetrů a nástrojů, které není možno autoklávovat), nebo aby se vyloučila možnost bacilonosičů Pseudomonas aeruginosa mezi ošetřovatelským personálem (výtěr krku, vzorek stolice). Takový epidemiologický přehled musí určit zdali všechny kmeny Pseudomonas aeruginosa, izolované během epidemie, jsou identické. Po identifikaci druhu bakterie následuje určení O-antigenní skupiny jako podstatná a někdy dostačující informace pro epidemiologický přehled. 2- POUŽITÍ Antiséra P. aeruginosa se používají k sérologické identifiakci kultur P. aeruginosa pomocí aglutinační metody na sklíčku, pro epidemiologické účely. 3- PRINCIP Test je založen na aglutinaci bakterií vykazujících odpovídající antigen pomocí specifického antiséra. Anti-Pseudomonas aeruginosa (anti-O) aglutinační séra Podle klasifikace zavedené Habsem (1) a dokončené International Pseudomonas Sub-Commitee existuje 16 O-antigenních skupin, číslovaných od 1 do 16. Tato antiséra se získávají imunizací králíků zahřátou bakteriální suspenzí (zničení teplotně labilních H-antigenů). Specifita je pak určována pomocí křížové saturace. 1) MONOVALENTNÍ SÉRA K dispozici je 16 monovalentních sér číslovaných od 1 do 16. Silné křížové reakce probíhají mezi skupinami O : 2 a O : 5, O : 7 a O : 8, O : 13 a O : 14. Monovalentní séra odpovídající těmto skupinám jsou proto absorbována. 2) POLYVALENTNÍ SÉRA K usnadnění sérotypizace jsou připraveny 4 směsi označené akronymy PMA, PME, PMC a PMF. Mají následující složení: PMA = P1 + P3 + P4 + P6 PME = P2 + P5 + P15 + P16 PMC = P9 + P10 + P13 + P14 PMF = P7 + P8 + P11 + P12 4- BALENÍ Polyvalentní séra a monovalentní séra jsou dodávána ve 3 ml kapacích lahvičkách (60 testů). • Polyvalentní séra Polyvalentní antisérum Pseudomonas aeruginosa PMA kód: 58922 Polyvalentní antisérum Pseudomonas aeruginosa PMC kód : 58942 Polyvalentní antisérum Pseudomonas aeruginosa PME kód: 58932 Polyvalentní antisérum Pseudomonas aeruginosa PMF kód : 58952 Monovalentní antisérum Pseudomonas aeruginosa P1 kód : 58901 Monovalentní antisérum Pseudomonas aeruginosa P9 kód : 58909 Monovalentní antisérum Pseudomonas aeruginosa P2 kód : 58902 Monovalentní antisérum Pseudomonas aeruginosa P10 kód : 58910 Monovalentní antisérum Pseudomonas aeruginosa P3 kód : 58903 Monovalentní antisérum Pseudomonas aeruginosa P11 kód : 58911 Monovalentní antisérum Pseudomonas aeruginosa P4 kód : 58904 Monovalentní antisérum Pseudomonas aeruginosa P12 kód : 58912 Monovalentní antisérum Pseudomonas aeruginosa P5 kód : 58905 Monovalentní antisérum Pseudomonas aeruginosa P13 kód : 58913 Monovalentní antisérum Pseudomonas aeruginosa P6 kód : 58906 Monovalentní antisérum Pseudomonas aeruginosa P14 kód : 58914 Monovalentní antisérum Pseudomonas aeruginosa P7 kód : 58907 Monovalentní antisérum Pseudomonas aeruginosa P15 kód : 58915 Monovalentní antisérum Pseudomonas aeruginosa P8 kód : 58908 Monovalentní antisérum Pseudomonas aeruginosa P16 kód : 58916 • Monovalentní séra 5- UCHOVÁVÁNÍ Séra uchovávaná při +2-8 °C jsou stabilní i po otevření do data exspirace uvedeného na obalu výrobku, jestliže nejsou kontaminována. 6- POTŘEBNÝ MATERIÁL, KTERÝ NENÍ SOUČÁSTÍ DODÁVKY • Podložní mikroskopické sklíčko. • Platinová očkovací klička. • Fyziologický roztok. 7- OCHRANA ZDRAVÍ A BEZPEČNOST PRÁCE • Dodržujte běžně používané techniky a zásady bezpečnosti práce s mikrobiologicky nebezpečným materiálem při práci s biologickými produkty používanými k aglutinační reakci, stejně tak i při jejich likvidaci. • Séra obsahují < 0.1 % azidu sodného. Azid sodný může vytvářet s olovem nebo mědí obsaženou ve vodovodním potrubí výbušné kovové azidy. Při likvidaci těchto reagencií je hojně řeďte vodou, aby se zabránilo tvorbě azidových usazenin. • Neřeďte reagencie. 8- PRACOVNÍ POSTUP Sérotypizace se provádí až po identifikaci druhu bakterie na čerstvé, čisté kultuře P. aeruginosa izolované na neselektivním agarovém médiu. Kontrolní test provádějte s testovaným kmenem ve fyziologickém roztoku: • Naberte jednu očkovací kličku kultury. • Tyto bakterie resuspendujte v kapce fyziologického roztoku, vytvořte homogenní suspenzi. Ve fyziologickém roztoku nesmí dojít k aglutinaci. Jestliže je pozorována aglutinace, jedná se o samoaglutinující kmen a test pomocí antiséra není možno interpretovat. • Začněte testovat aglutinaci s polyvalentními séry a následně se specifickými monovalentními séry odpovídajícími složení polyvalentní směsi poskytující výraznou aglutinaci. • • • • • Naneste 1 kapku imunního séra na mikroskopické podložní sklíčko. Odeberte jednu očkovací kličku čerstvé, čisté kultury P. aeruginosa. Tyto bakterie resuspendujte v kapce séra, vytvořte homogenní suspenzi postupným přidáváním baktérií k séru. Protřepejte sklíčko jemnými krouživými pohyby. Směs prohlédněte proti tmavému pozadí nebo lépe za pomoci konkávního zrcadla. 9- INTERPRETACE VÝSLEDKŮ O positivní reakci se jedná v případě, kdy se aglutinace objeví maximálně do pěti minut. O-antigenní aglutinace je jemná a pravidelná, lze jí snadno odlišit od jakýchkoliv špatně emulsifikovaných fragmentů bakteriální kolonie. Poznámka: V případě selhání (např. s kmeny produkujícími mnoho mukosálních antigenů), je doporučeno připravit hustou suspenzi bakterií v destilované vodě z čerstvé a čisté kolonie na agaru, zahřáté na 120 °C po dobu 30 minut (autokláv). Tato suspenze se centrifuguje, odstraní se supernatant, a test se provádí s bakteriální peletou. 10- ÚČINNOST TESTU/KONTROLA KVALITY Aktivita každého aglutinačního séra Pseudomonas aeruginosa je kontrolována následujícími referenčními kmeny: Kmeny Sérotyp Pseudomonas aeruginosa CIP 59.33 / ATCC 33348 P1 Pseudomonas aeruginosa CIP 59.34 / ATCC 33349 P2 Pseudomonas aeruginosa CIP 59.35 / ATCC 33350 P3 Pseudomonas aeruginosa CIP 59.36 / ATCC 33351 P4 Pseudomonas aeruginosa CIP 59.37 / ATCC 33352 P5 Pseudomonas aeruginosa CIP 59.39 / ATCC 33354 P6 Pseudomonas aeruginosa CIP 59.38 / ATCC 33353 P7 Pseudomonas aeruginosa CIP 59.40 / ATCC 33355 P8 Pseudomonas aeruginosa CIP 59.41 / ATCC 33356 P9 Pseudomonas aeruginosa CIP 59.43 / ATCC 33357 P10 Pseudomonas aeruginosa CIP 59.44 / ATCC 33358 P11 Pseudomonas aeruginosa CIP 59.45 / ATCC 33359 P12 Pseudomonas aeruginosa CIP 60.92 / ATCC 33360 P13 Pseudomonas aeruginosa CIP 72.12 P14 Pseudomonas aeruginosa CIP 72.13 P15 Pseudomonas aeruginosa CIP 74.21 P16 11- KONTROLA KVALITY PROVÁDĚNÁ VÝROBCEM Všechny vyráběné a komercionalizované reagencie jsou kontrolovány kompletním systémem kontroly kvality začínajícím od přijetí surovin až po komercionalizaci produktu. Každá šarže je podrobena kontrole kvality a je uvolněna na trh pouze tehdy, jestliže odpovídá stanoveným kritériím. Dokumentace vztahující se k výrobě a kontrole každé jednotlivé šarže je uchovávána ve společnosti Bio-Rad. 12- MEZE UŽITÍ • Vlastnímu určení séroskupiny musí předcházet identifikace druhu bakterie. • Okolo 5% kmene Pseudomonas aeruginosa je nestabilních a samoaglutinujících. • Okolo 1% stabilních kmenů Pseudomonas aeruginosa nepatří do žádné ze skupin 1 až 16. Určení sérotypu těchto nových Oskupin má z praktického hlediska malý význam. 13- LITERATURA Viz anglická verze. Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33 09/2003 code: 18316 - A4 ANTISERUM PSEUDOMONAS AERUGINOSA TYPOWANIE SEROLOGICZNE PSEUDOMONAS AERUGINOSA 1 - ZNACZENIE KLINICZNE W szpitalach zakażenia Pseudomonas aeruginosa mogą występować epidemicznie. Niebezpieczeństwo zakażeń na oddziale może wymagać czasowego zamknięcia oddziału. Niezbędne jest poznanie epidemiologii zakażeń szpitalnych w celu wykrycia ich źródła (często jest nim „antyseptyczny” roztwór do dezynfekcji sprzętu i narzędzi, których nie można wyjałowić w autoklawie) oraz dla wykluczenia udziału w powstaniu epidemii osób z personelu medycznego, które mogą być zdrowymi nosicielami tych bakterii (w gardle, w przewodzie pokarmowym). Badania epidemiologiczne wymagają wytypowania wszystkich wyizolowanych podczas danej epidemii szczepów Pseudomonas aeruginosa w celu potwierdzenia (lub wykluczenia) ich pokrewieństwa. Po zidentyfikowaniu gatunku, niezbędnych informacji, często wystarczających dla potrzeb dochodzenia epidemiologicznego, dostarcza oznaczenie antygenu grupowego O. 2 - ZASTOSOWANIE Surowice przeciwko P.aeruginosa służą do identyfikacji serologicznej hodowli pałeczek P.aeruginosa metodą aglutynacji szkiełkowej, w celach epidemiologicznych. 3 – ZASADA METODY Test polega na aglutynacji bakterii, posiadających odpowiednie antygeny, ze swoistą surowicą. Surowice aglutynujące anty-Pseudomonas aeruginosa (anty-O) Zgodnie z klasyfikacją grup O ustaloną przez Habs (1) i uzupełnioną przez Międzynarodowy Podkomitet Pseudomonas, wyróżnia się 16 grup antygenowych O, oznaczonych od 1 do 16. Surowice otrzymano przez immunizację królików zagotowaną zawiesiną bakterii (ciepło-chwiejny antygen H uległ uszkodzeniu). Swoistość surowic określono przez krzyżowe wysycanie. 1) Surowice monowalentne Dostępnych jest 16 surowic monowalentnych ponumerowanych od 1 do 16. Występują silne reakcje krzyżowe pomiędzy grupami O:2 i O:5, grupami O:7 i O:8 i grupami O:13 i O:14. Surowice monowalentne, odpowiadające tym grupom są w rezultacie absorbowane. 2) Surowice poliwalentne Aby ułatwić typowanie, sporządzono 4 mieszanki surowic, oznaczone PMA, PME, PMC i PMF. Mają one następujący skład: PMA = P1 + P3 + P4 + P6 PME = P2 + P5 + P15 + P16 PMC = P9 + P10 + P13 + P14 PMF = P7 + P8 + P11 + P12 4 - POSTAĆ ODCZYNNIKA Surowice poliwalentne i monowalentne znajdują się w fiolkach z kroplomierzem po 3 ml (60 testów). • Surowice poliwalentne Antiserum Pseudomonas aeruginosa polyvalent PMA Antiserum Pseudomonas aeruginosa polyvalent PME • Nr kat. 58922 Nr kat. 58932 Antiserum Pseudomonas polyvalent PMC Antiserum Pseudomonas polyvalent PMF aeruginosa Nr kat. 58942 aeruginosa Nr kat. 58952 Surowice monowalentne Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P1 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P2 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P3 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P4 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P5 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P6 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P7 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P8 Nr kat. 58901 Nr kat. 58902 Nr kat. 58903 Nr kat. 58904 Nr kat. 58905 Nr kat. 58906 Nr kat. 58907 Nr kat. 58908 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P9 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P10 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P11 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P12 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P13 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P14 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P15 Antiserum Pseudomonas aeruginosa monovalent P16 Nr kat. 58909 Nr kat. 58910 Nr kat. 58911 Nr kat. 58912 Nr kat. 58913 Nr kat. 58914 Nr kat. 58915 Nr kat. 58916 5 - PRZECHOWYWANIE Surowice, przechowywane w temperaturze +2-8°C, nie zanieczyszczone, są trwałe zgodnie z datą ważności podaną na opakowaniu (również po otwarciu). 6 – INNE NIEZBĘDNE MATERIAŁY • Szkiełka podstawowe. • Eza platynowa lub ezy plastikowe. • Sól fizjologiczna. 7 – OSTRZEŻENIA DLA UŻYTKOWNIKA • Należy zapoznać się z aktualnymi technikami i środkami ostrożności zabezpieczającymi przed ryzykiem zakażenia podczas pracy i utylizacji materiału zakaźnego oraz produktów biologicznych używanych do reakcji aglutynacji. • Surowice zawierają < 0.1% azydek sodu. Związek ten może reagować z miedzią i ołowiem w zlewie i w rurach, tworząc wybuchowe azydki metali. Po wylaniu odczynników, należy spłukać zlew dużą ilością wody. • Nie rozcieńczać odczynników. 8 - PROCEDURA Typowanie serologiczne jest wykonywane po identyfikacji gatunku z czystej, młodej hodowli E.coli uzyskanej na nie wybiórczym podłożu agarowym. Należy wykonać kontrolę szczepu w soli fizjologicznej: • Pobrać ezę hodowli. • Zmieszać bakterie z kroplą soli fizjologicznej, tworząc jednorodną zawiesinę. W soli fizjologicznej nie powinna wystąpić aglutynacja. Jej pojawienie się wskazuje na szczep auto-aglutynujący i nie można wówczas wykonać testu z surowicami. • Na szkiełko nanieść jedną kroplę surowicy. • Pobrać ezę młodej, czystej hodowli E.coli. • Bakterie zawiesić bezpośrednio w kropli surowicy, dodając je stopniowo, aby powstała jednorodna zawiesina. • Aglutynację oglądać gołym okiem lub przez szkło powiększające na ciemnym tle. 9 – INTERPRETACJA WYNIKÓW O reakcji dodatniej świadczy aglutynacja pojawiająca się w czasie maksymalnie 5 minut. Aglutynacja antygenu somatycznego O jest wyraźna, regularna i łatwo ją odróżnić od nie dostatecznie zawieszonych cząstek hodowli. Uwaga: W przypadku niepowodzenia (np. gdy szczep wytwarza dużo antygenu śluzowego), zaleca się sporządzenie gęstej zawiesiny w wodzie destylowanej z kolonii uzyskanych na podłożu agarowym i ogrzanie jej w temperaturze 120°C przez 30 minut (w autoklawie). Następnie zawiesinę należy odwirować, usunąć supernatant i wykonać aglutynację z osadem bakterii. 10 – WŁAŚCIWOŚCI TESTU / KONTROLA JAKOŚCI Aktywność każdej z surowic Pseudomonas aeruginosa jest kontrolowana przy użyciu następujących szczepów wzorcowych: Szczepy Pseudomonas aeruginosa CIP 59.33 / ATCC 33348 Pseudomonas aeruginosa CIP 59.34 / ATCC 33349 Pseudomonas aeruginosa CIP 59.35 / ATCC 33350 Pseudomonas aeruginosa CIP 59.36 / ATCC 33351 Pseudomonas aeruginosa CIP 59.37 / ATCC 33352 Pseudomonas aeruginosa CIP 59.39 / ATCC 33354 Pseudomonas aeruginosa CIP 59.38 / ATCC 33353 Pseudomonas aeruginosa CIP 59.40 / ATCC 33355 Pseudomonas aeruginosa CIP 59.41 / ATCC 33356 Pseudomonas aeruginosa CIP 59.43 / ATCC 33357 Pseudomonas aeruginosa CIP 59.44 / ATCC 33358 Pseudomonas aeruginosa CIP 59.45 / ATCC 33359 Pseudomonas aeruginosa CIP 60.92 / ATCC 33360 Pseudomonas aeruginosa CIP 72.12 Pseudomonas aeruginosa CIP 72.13 Pseudomonas aeruginosa CIP 74.21 Serotyp P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11 P12 P13 P14 P15 P16 11 - KONTROLA JAKOŚCI PRODUCENTA Wszystkie odczynniki są produkowane oraz sprzedawane zgodnie z naszym Systemem Jakości, zaczynając od otrzymania surowców do wykonania finalnego produktu. Każda seria odczynników jest poddana kontroli jakości i dopuszczona do sprzedaży po uzyskaniu określonych kryteriów. Dane dotyczące procesu produkcji oraz kontroli jakości każdej serii odczynników są archiwizowane u producenta. 12 - OGRANICZENIA METODY • Przed typowaniem serologicznym szczep należy oznaczyć do gatunku. • Około 5% szczepów Pseudomonas aeruginosa jest niestabilnych antygenowo i samo-aglutynujących. • Około 1% stabilnych szczepów Pseudomonas aeruginosa należy do innych grup niż wymienione 1 do 16. Typowanie nowych grup nie ma znaczenia w praktyce. 13 - LITERATURA 1. HABS I.Z. Hyg., 144, 218-228. 2. VIEU J.F., ALLOS G., HASSAN-MASSOUD B., SANTOS-FERREIRA M.O. I TSELENTIS G., Existe-t-il une epidemiologie geographique des serogroupe O de Pseudomonas aeruginosa. Bull. Soc. Path. Ex., 1984, 77, 288-294. Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33 09/2003 numer kat.: 18316 - A4 3 PSEUDOMONAS AERUGINOSA ANTISZÉRUM PSEUDOMONAS AERUGINOSA SZEROTIPIZÁLÁSA KLINIKAI JELENTŐSÉG 1- A kórházakban járványos méreteket ölthet a Pseudomonas aeruginosa fertőzések száma. Ha ez a súlyos helyzet áll elő, akkor átmenetileg le kell zárni az osztályt, ahol a fertőzés előfordult. Mindenképpen meg kell vizsgálni, hogy a kórházi fertőzések milyen útvonalon terjednek, azonosítani kell a forrásukat (igen gyakran „aszeptikus” oldatokról van szó, amelyeket autoklávban nem sterilezhető eszközök és katéterek fertőtlenítéséhez használnak), vagy ki kell zárni az ápoló személyzet felelősségét (torokváladék, széklet vizsgálat), akik feltehetőleg egészséges hordozói lehetnek olyan Pseudomonas aeruginosa-nak, amely nem felelős a járványért. A járványügyi felmérésnek el kell döntenie, hogy a járvány során izolált Pseudomonas aeruginosa összes törzse azonos-e, vagy sem. A species identifikálása után az O-antigén csoport meghatározása nyújtja az elengedhetetlenül szükséges, és olykor elégséges információt a járvány felméréséhez. FELHASZNÁLÁS 2- A P. aeruginosa antiszérumokat P. aeruginosa tenyészetek szerológiai identifikálásához használjuk, lemez agglutinációs módszer alkalmazásával, járványügyi célokra. ALAPELV 3- A teszt azon alapul, hogy a megfelelő antigénekkel ellátott baktériumok agglutinálnak a specifikus antiszérumok hatására. Anti-Pseudomonas aeruginosa (anti-O) agglutináló szérumok A Habs (1) által felállított és a Nemzetközi Pseudomonas Albizottság által kiegészített osztályozás szerint 16 O-antigén csoport van, amelyeket 1—16 között számozunk. Az antiszérumokat hőkezelt baktérium szuszpenziókkal immunizált nyulakból nyerjük. (A hevítés eltünteti a hőre labilis H-antigént.) A specificitást ezután kereszt-szaturációval határozzuk meg. 1) Monovalens savók 16, 1—16 sorszámot viselő monovalens agglutináló szérum kapható. Erős keresztreakciók figyelhetők meg az O:2 és az O:5 csoport, az O:7 és az O:8, valamint az O:13 és az O:14 csoport között. A fenti csoportoknak megfelelő monovalens szérumokat a zavaró agglutináció elkerülésére teljes kimerítés során nyerték. 2) Polivalens szérumok A tipizálás megkönnyítésére 4 szérumkeveréket készítettünk, amelyeknek a PMA, PME, PMC és PMF nevet adtuk. Az összetételük a következő: PMA = P1+P3+P4+P6 PME = P2+P5+P15+P16 PMC = P9+P10+P13+P14 PMF = P7+P8+P11+P12 KISZERELÉS 4- A polivalens és a monovalens szérumokat 3 ml-es cseppentősüvegben szállítjuk (60 teszt). • Polivalens szérumok Pseudomonas aeruginosa polivalens PMA antiszérum, 58922 Pseudomonas aeruginosa polivalens PME antiszérum, 58932 • Pseudomonas aeruginosa polivalens PMC antiszérum, 58942 Pseudomonas aeruginosa polivalens PMF antiszérum, 58952 Monovalens szérumok Pseudomonas aeruginosa monovalens P1 antiszérum, 58901 Pseudomonas aeruginosa monovalens P2 antiszérum, 58902 Pseudomonas aeruginosa monovalens P3 antiszérum, 58903 Pseudomonas aeruginosa monovalens P4 antiszérum, 58904 Pseudomonas aeruginosa monovalens P5 antiszérum, 58905 Pseudomonas aeruginosa monovalens P6 antiszérum, 58906 Pseudomonas aeruginosa monovalens P7 antiszérum, 58907 Pseudomonas aeruginosa monovalens P8 antiszérum, 58908 Pseudomonas aeruginosa monovalens P9 antiszérum, 58909 Pseudomonas aeruginosa monovalens P10 antiszérum, 58910 Pseudomonas aeruginosa monovalens P11 antiszérum, 58911 Pseudomonas aeruginosa monovalens P12 antiszérum, 58912 Pseudomonas aeruginosa monovalens P13 antiszérum, 58913 Pseudomonas aeruginosa monovalens P14 antiszérum, 58914 Pseudomonas aeruginosa monovalens P15 antiszérum, 58915 Pseudomonas aeruginosa monovalens P16 antiszérum, 58916 1 TÁROLÁS 5- A +2 - 8°C között tárolt, szennyeződéstől védett szérumok a dobozon feltüntetett szavatossági ideig stabilak (még felbontás után is). SZÜKSÉGES, DE NEM SZÁLLÍTOTT ANYAGOK 6• • • KEZELÉSI ELŐÍRÁSOK 7• • • 8- Üveg tárgylemez Műanyag vagy platina oltókacs Fiziológiás sóoldat. Mindig tartsuk be a mikrobiológiai veszélyforrások elleni védelemre vonatkozó aktuális kezelési, munkavédelmi és ártalmatlanítási előírásokat az agglutinációs reakcióhoz felhasznált anyagok és biológiai termékek feldolgozásakor. A szérumok < 0,1% nátriumazidot tartalmaznak. A nátriumazid képes reagálni a vízvezeték hálózat csöveinek ólom vagy réz falanyagával, s ennek során robbanásveszélyes fémazidok keletkeznek. Ha a reagenseket a lefolyóba öntjük ki, akkor utána bő vízzel mossuk át a csöveket, nehogy azidlerakódás keletkezzék. Ne hígítsuk fel a reagenseket. HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ A szerotipizálást nem szelektív agar táptalajon izolált P. aeruginosa tiszta, friss tenyészetéből végezzük, a species identifikálása után. Fiziológiás sóoldattal végezzünk egy párhuzamos kontrollvizsgálatot is a vizsgálandó törzzsel: • Vegyünk ki egy kacsnyit a tenyészetből. • Szuszpendáljuk a baktériumokat egy cseppnyi fiziológiás sóoldatban, ügyelve arra, hogy a szuszpenzió homogén legyen. A fiziológiás sóoldatban nem tapasztalhatunk agglutinációt. Ha mégis ez történik, akkor spontán agglutinálódó törzsről van szó, és a szerotipizálás nem végezhető el. • Először a polivalens szérumokkal kezdjük az agglutináció vizsgálatát, majd azokkal a specifikus szérumokkal folytassuk, amelyek megfelelnek a karakteres agglutinációt produkáló elegynek. • Cseppentsünk 1 cseppnyi immunsavót az üveglapra. • Vegyünk egy kacsnyit a P. aeruginosa friss, tiszta tenyészetéből. • Szuszpendáljuk a baktériumokat az antiszérum cseppjében. Hogy homogén szuszpenziót kapjunk, fokozatosan adagoljuk a baktériumokat a szérumhoz. • Finoman, forgató mozdulatokkal homogenizáljuk a lemez tartalmát. • Puszta szemmel vizsgáljuk meg az elegyet sötét háttér, vagy egy homorú tükör előtt. 9- AZ EREDMÉNYEK KIÉRTÉKELÉSE Pozitív reakció esetében legfeljebb 5 percen belül agglutinációt tapasztalunk. Az O-antigénes agglutináció finom szerkezetű és szabályos, s könnyű megkülönböztetni a baktériumtelep bármely rosszul emulgeált darabkájától. Megjegyzés: ha nem járunk sikerrel (például sok slime-antigént produkáló törzseknél), akkor készítsünk nagyon sűrű szuszpenziót desztillált vízzel agar táptalajon nőtt friss, tiszta tenyészetből, s ezt a szuszpenziót tartsuk 120°C-on 30 percen keresztül (autokláv). A szuszpenziót ezután lecentrifugáljuk, leöntjük a felülúszót, s a tesztet a baktériumüledékkel végezzük el. 10- MINŐSÉG/A SZÉRUMOK MINŐSÉGÉNEK ELLENŐRZÉSE A Pseudomonas aeruginosa agglutináló szérumok aktivitását az alábbi referencia törzsekkel ellenőrizzük. Törzsek Pseudomonas aeruginosa CIP 59.33 / ATCC 33348 Pseudomonas aeruginosa CIP 59.34 / ATCC 33349 Pseudomonas aeruginosa CIP 59.35 / ATCC 33350 Pseudomonas aeruginosa CIP 59.36 / ATCC 33351 Pseudomonas aeruginosa CIP 59.37 / ATCC 33352 Pseudomonas aeruginosa CIP 59.39 / ATCC 33354 Pseudomonas aeruginosa CIP 59.38 / ATCC 33353 Pseudomonas aeruginosa CIP 59.40 / ATCC 33355 Pseudomonas aeruginosa CIP 59.41 / ATCC 33356 Pseudomonas aeruginosa CIP 59.43 / ATCC 33357 Pseudomonas aeruginosa CIP 59.44 / ATCC 33358 Pseudomonas aeruginosa CIP 59.45 / ATCC 33359 Pseudomonas aeruginosa CIP 60.92 / ATCC 33360 Pseudomonas aeruginosa CIP 72.12 Pseudomonas aeruginosa CIP 72.13 Pseudomonas aeruginosa CIP 74.21 Szerotípus P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11 P12 P13 P14 P15 P16 2 11- A GYÁRTÓNÁL FOLYÓ MINŐSÉGELLENŐRZÉS Az összes termékünk a saját minőségellenőrző rendszerünk szerint készült, a nyersanyag átvételétől kezdve a termék forgalmazásáig. Minden egyes gyártási sorozat minőségét ellenőrizzük, és csak akkor hozzuk forgalomba, ha az megfelel az előre felállított kritériumoknak. Minden sorozat gyártási és minőségellenőrzési jegyzőkönyve megtalálható a Bio-Radnál. 12- AZ ALKALMAZÁS KORLÁTAI • • • A szerocsoport meghatározása előtt mindenképpen identifikálni kell a baktériumfajt. A Pseudomonas aeruginosa törzseinek körülbelül 5%-a instabil és spontán agglutinálódik. A Pseudomonas aeruginosa stabil törzseinek körülbelül 1%-a nem az 1—16 csoportba tartozik. Ezeknek az új O-csoportoknak a tipizálása nem jár különösebb gyakorlati haszonnal. 13- HIVATKOZÁSOK 1. 2. HABS I. Z. Hyg., 144, 218-228. VIEU J.F., ALLOS G., HASSAN-MASSOUD B., SANTOS-FERREIRA M.O. et TSELENTIS G.. Existe-t-il une épidémiologie géographique des sérogroupe O de Pseudomonas aeruginosa. Bull. Soc. Path. Ex., 1984, 77, 288-294. 3
