Alimentos transgénicos

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T
T
G
T
DNA
recombinante
A
A
A
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G
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C
Capítulo
19
Alimentos transgénicos
ÁNGEL GIL HERNÁNDEZ
DANIEL RAMÓN VIDAL
Ë
Objetivos
n Entender el concepto de DNA recombinante y las principales técnicas moleculares
utilizadas actualmente en la ingeniería genética.
n Adquirir los conceptos de organismos modificados genéticamente y de alimentos transgénicos.
n Describir las bases de la obtención de las plantas transgénicas y algunos ejemplos de apli-
caciones de la ingeniería genética en agricultura.
n Conocer las bases de las modificaciones genéticas de las bacterias y otros microorganismos
usados comúnmente en la industria alimentaria mediante tecnología de DNA recombinante.
n Entender los procesos y modalidades utilizados en la obtención de los animales transgé-
nicos.
n Comprender los procedimientos utilizados para la clonación de animales.
n Conocer el protocolo que debe seguirse para solicitar la comercialización de los «nuevos
alimentos».
n Conocer las aplicaciones de las normas vigentes sobre el etiquetado y la trazabilidad de
nuevos alimentos e ingredientes en la Unión Europea.
n Comparar la legislación vigente en Estados Unidos con la de la Unión Europea en cuanto a
A
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C
T T
A
G
G
C
A
C
DNA
recombinante
n CONCEPTO Y CLASIFICACIÓN
n DNA RECOMBINANTE E INGENIERÍA
GENÉTICA
n Clonado molecular
n Enzimas de restricción
n Ligado de fragmentos de DNA
n Otras enzimas de interés en la tecnología del DNA
recombinante
n Vectores de clonación
n Selección del DNA recombinante
n Librerías genómicas
n Técnicas de visualización y cuantificación
de fragmentos de ácidos nucleicos
n APLICACIONES DE LA INGENIERÍA
GENÉTICA EN LA PRODUCCIÓN
DE ALIMENTOS
n Agricultura: plantas transgénicas
• Obtención de plantas transgénicas
• Aplicaciones de la ingeniería genética
en agricultura
n Industria alimentaria: microorganismos
modificados genéticamente
• Obtención de bacterias lácticas modificadas
genéticamente
• Aplicaciones en la industria alimentaria
de las bacterias lácticas modificadas
genéticamente
• Otras bacterias
• Obtención y aplicaciones de levaduras y hongos
filamentosos modificados genéticamente
A
A
A
T
G
T
C
Contenido
n INTRODUCCIÓN
A
T
T
T
G
T
n Producción animal: animales transgénicos
• Obtención de animales transgénicos
• Aplicaciones de los animales transgénicos
n EVALUACIÓN DE ALIMENTOS Y CULTIVOS
TRANSGÉNICOS
n COMERCIALIZACIÓN DE ORGANISMOS
MODIFICADOS GENÉTICAMENTE
O DE PRODUCTOS QUE LOS CONTENGAN
n Solicitud de autorización de comercialización
de un alimento transgénico en el ámbito comunitario
• Dictamen de la Autoridad
• Autorización
n Normas legislativas en España
• Informe de evaluación
• Régimen de autorización
n Etiquetado y trazabilidad de nuevos alimentos
y de nuevos ingredientes alimentarios: legislación
en la Unión Europea
• Etiquetado
• Trazabilidad
n SITUACIÓN LEGISLATIVA
DE LOS ALIMENTOS MODIFICADOS
GENÉTICAMENTE EN ESTADOS UNIDOS
Y ÚLTIMOS AVANCES
EN LA UNIÓN EUROPEA
n LEGISLACIÓN RELEVANTE
SOBRE ORGANISMOS MODIFICADOS
GENÉTICAMENTE
n RESUMEN
n BIBLIOGRAFÍA
n SITIOS WEB DE INTERÉS
Alimentos transgénicos
n INTRODUCCIÓN
Los organismos modificados genéticamente (OMG)
pueden definirse como organismos en los cuales el material
genético, formado por el ácido desoxirribonucleico (DNA),
ha sido alterado de un modo artificial mediante el uso de la
denominada tecnología del DNA recombinante o ingeniería
genética. Esta técnica permite aislar genes de cualquier organismo vivo donador, seleccionarlos y transferirlos a otro
organismo de una especie receptora que en la escala filogenética puede estar relacionada o distante de la donadora. En
los países hispanoparlantes los OMG también se denominan
organismos transgénicos.
Desde hace más de tres décadas se han desarrollado
nuevos microorganismos, plantas y animales mediante
estas técnicas genéticas, las que han permitido crear nuevos alimentos con distintas propiedades. Así, se han desarrollado nuevas variedades de plantas con resistencia a
insectos, virus o herbicidas, leguminosas con contenido
mejorado de algún aminoácido o cereales con un mayor
valor biológico de sus proteínas. También se han creado
plantas de cuyas semillas se obtienen aceites con composición nutricional mejorada u otras cuyos frutos presentan
un retraso en la maduración o tienen mejorada su textura
o color. Por otra parte, se han generado nuevos microorganismos que pueden producir aditivos alimentarios, como
colorantes y edulcorantes más eficaces, y se han obtenido
microorganismos modificados útiles en los procesos fermentativos destinados a la producción de alimentos. Estas
nuevas cepas de bacterias lácticas, levaduras y hongos filamentosos posibilitan el desarrollo de nuevos productos
o la prevención de problemas industriales, al estar limitada
su infección por virus, especialmente en el caso de las bacterias lácticas. Aunque el desarrollo de animales modificados genéticamente es más difícil y plantea mayores
problemas éticos, también se han desarrollado razas transgénicas para producir peces de mayor tamaño, mejorar la
composición de la carne y de la leche en los mamíferos o
aumentar la calidad de la lana, así como para producir proteínas con fines terapéuticos. Por otra parte, la clonación
de animales de granja es un hecho y, aunque es un proceso aún muy complejo no exento de riesgos, en el futuro
podrá permitir mayores producciones de alimentos con
mejor calidad.
Todos estos alimentos transgénicos han de pasar un proceso de evaluación complejo antes de llegar al consumidor.
Dicho proceso incluye el estudio de la mejora genética introducida (características del organismo donante y del receptor, sitio de inserción, patrón de expresión del gen transgénico y consecuencias potenciales de la modificación), la
seguridad alimentaria del alimento (características nutricionales, composición e inocuidad, toxicidad y alergenicidad
posibles, cambios potenciales en la ingesta e impacto nutricional a largo plazo) y el potencial impacto en el medio ambiente. Además, desde el 18 de abril de 2004 la nueva regulación sobre trazabilidad y etiquetado de los OMG es de
obligado cumplimiento en todos los estados miembros de la
CAPÍTULO
19
Unión Europea. La normativa establece que se indique la
presencia de un OMG en un producto cuando al menos el
0,9 % de uno de sus ingredientes sea OMG o proceda de un
OMG. Además, la normativa exige conocer con exactitud el
origen y los detalles del proceso de producción de los
nuevos OMG o de los alimentos que los contienen.
En este capítulo se analiza el concepto de OMG y se describen brevemente las técnicas más utilizadas en la tecnología del DNA recombinante. Asimismo, se describen las técnicas más comunes para la producción de microorganismos,
plantas y animales transgénicos de utilidad en alimentación
y se ofrecen varios ejemplos de interés. Se destina especial
atención a la evaluación sanitaria y medioambiental de dichos productos. Por otra parte, se abordan los aspectos legales relacionados con la producción, la comercialización, el
etiquetado y la trazabilidad de los OMG, así como su protección jurídica.
n CONCEPTO Y CLASIFICACIÓN
Los alimentos transgénicos, también llamados alimentos
modificados genéticamente, son los diseñados para cubrir
cualquier necesidad de mejora en los que se ha incorporado
material genético distinto del original mediante técnicas de
ingeniería genética. Según el derecho alimentario, se considera que se ha creado un nuevo alimento cuando: a) se trata
de una materia prima nueva, b) es el resultado del uso de una
nueva tecnología de fabricación o de tratamiento, o c) se establece un nuevo uso a un producto ya existente. Al respecto,
los alimentos obtenidos por modificación genética se consideran nuevos alimentos por pertenecer a una nueva tecnología de fabricación. De hecho, el Reglamento (CE) n.º 258/97
del Parlamento Europeo y del Consejo clasifica los nuevos alimentos en seis categorías, quedando los alimentos transgénicos incluidos en dos de ellas. Por un lado, la categoría que
considera nuevo alimento o nuevo ingrediente alimentario al
que contenga OMG o que consista en dichos organismos, por
ejemplo, un yogur producido con bacterias de ácido láctico
modificadas genéticamente o una lechuga transgénica. Por
otro, la categoría que comprende a los alimentos que contengan ingredientes alimentarios producidos a partir de OMG,
por ejemplo, una galleta que contenga harina de maíz proveniente de una variedad de maíz transgénico.
Históricamente, en la normativa jurídica de la Unión Europea, la definición de OMG ha tenido un tratamiento especial. Así, la Recomendación de la Comisión de 29 de julio de
1997 realizaba una clasificación científica de los nuevos alimentos con miras a la evaluación de su salubridad, en la
cual aparecían seis clases de nuevos alimentos, quedando
los alimentos modificados genéticamente encuadrados en
tres de ellas, denominadas clases 3, 4 y 5, correspondientes
respectivamente a vegetales, animales y microorganismos
modificados genéticamente y sus productos. En las tres
clases se incluían dos subclases relativas a organismos receptores con historial de uso como alimento en la Comunidad en condiciones de preparación e ingesta comparables
o sin dicho historial de uso.
3
TOMO
II
COMPOSICIÓN Y CALIDAD NUTRITIVA DE LOS ALIMENTOS
Posteriormente, la Directiva 2001/18/CE del Parlamento
Europeo y del Consejo de 12 de marzo de 2001 sobre la liberación intencional al medio ambiente de organismos
transgénicos definía el término OMG como «el organismo,
con excepción de los seres humanos, cuyo material genético haya sido modificado de una manera que no se produce
naturalmente en el apareamiento ni en la recombinación
natural». En la Posición Común (CE) n.º 22/2003, aprobada
por el Consejo el 17 de marzo de 2003, se definía al OMG
destinado a la alimentación humana como «aquel que
puede utilizarse como alimento o como material de partida
para la producción de alimentos». En la misma reglamentación se consideraban alimentos modificados genéticamente
a «aquellos que contienen o están compuestos por OMG, o
han sido producidos a partir de ellos». Conviene aclarar que
la expresión «producido a partir de OMG» para los legisladores europeos hace referencia a un derivado total o parcial
de OMG que no contenga OMG o esté compuesto por OMG.
Además, en esta definición, las técnicas de modificación genética incluyen: a) técnicas de recombinación del DNA que
consideren la formación de combinaciones nuevas de material genético mediante la inserción de moléculas de ácido
nucleico, obtenidas por cualquier medio fuera de un organismo, ya sea en un virus, plásmido bacteriano u otro vector,
y su incorporación a un organismo hospedador en el que no
se encuentren de forma natural pero puedan seguir reproduciéndose; b) técnicas que supongan la incorporación directa en el genoma de un organismo de material hereditario
preparado fuera del organismo, incluidas la microinyección,
la macroinyección y la microencapsulación, y c) técnicas de
fusión de células (incluida la fusión de protoplastos) o de hibridación, en las que se formen células vivas con combinaciones nuevas de material genético hereditario mediante la
fusión de dos o más células utilizando métodos que no se
producen naturalmente.
Por todo lo expuesto en los párrafos anteriores, resulta
evidente que antes de entrar a tratar en profundidad los alimentos modificados genéticamente conviene plantear las
técnicas destinadas a su diseño.
n DNA RECOMBINANTE E INGENIERÍA
GENÉTICA
4
La esencia de la tecnología del DNA recombinante es el
aislamiento y la manipulación del DNA, incluyendo la unión
de secuencias de nucleótidos de orígenes diversos (virus,
microorganismos, plantas y animales) para generar nuevas
moléculas quiméricas o nuevas secuencias independientes.
Esta tecnología implica la utilización de muchas metodologías distintas, que se tratarán en este apartado, cuya base
es la existencia de varios métodos que implican cortar las
cadenas de DNA por lugares específicos mediante el uso de
las denominadas enzimas de restricción, para posteriormente usar la enzima DNA ligasa para unir segmentos de
DNA de orígenes diferentes, generando así nuevas moléculas de DNA quiméricas. Por otra parte, existen técnicas
de clonado que permiten amplificar el nuevo DNA heteró-
logo. Su cuantificación, tanto del DNA clonado como del
RNA que transcriba, es abordable gracias, entre otras técnicas, al uso de sondas de DNA. Por otro lado, existen métodos químicos y enzimáticos automatizados que posibilitan
la secuenciación de largos fragmentos de DNA. También es
posible la síntesis química de oligonucleótidos con una secuencia precisa. Finalmente, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) permite la amplificación de una secuencia
determinada de DNA de forma muy sensible y selectiva.
Toda esta batería de métodos es la base del trabajo en ingeniería genética y con ellos se consiguen generar e identificar las moléculas quiméricas con las que generar los OMG.
Para conseguir introducir esas moléculas híbridas en un
organismo receptor, en otras palabras, para generar un
OMG, existen varios métodos, entre los que se incluyen la
transformación por plásmidos y la transfección por fagos
para el caso de los microorganismos y la transformación,
para animales y plantas. En todos ellos las células hospedadoras deben prepararse para poder recibir el DNA foráneo.
En la transformación microbiana, al generar un DNA recombinante se inserta en él un marcador seleccionable que
permite la identificación de las moléculas recombinantes, por
ejemplo, un gen de resistencia a un antibiótico o un gen que
codifica una enzima clave en la síntesis de un aminoácido
(marcador auxotrófico). Cuando se utiliza un gen marcador de
resistencia a un antibiótico, la célula portadora del DNA recombinante crece en un medio de cultivo que contiene el antibiótico. Cuando se utiliza un marcador auxotrófico, por
ejemplo, un aminoácido, la célula hospedadora es capaz de
crecer en un medio de cultivo pobre en nutrientes que no contiene dicho aminoácido. La transfección con fagos supone generar fagos recombinantes en los que parte de su material hereditario se sustituye por el gen transgénico que se quiere
expresar o, simplemente, se suplementa con dicho gen. La introducción del gen transgénico se realiza siguiendo el proceso
natural de infección vírica. En el caso de la transformación no
bacteriana, se transforman células de origen vegetal o animal
mediante diferentes procesos, como la microinyección del
DNA directamente en el núcleo o el bombardeo de la célula
con microproyectiles en forma de partículas de oro o tungsteno recubiertas con el DNA recombinante. En el caso de los
vegetales, también se puede utilizar una estrategia natural de
transformación basada en el empleo del plásmido Ti de la bacteria Agrobacterium tumefaciens, que en la naturaleza transforma células vegetales generando tumores. Para ello, se eliminan de dicho plásmido las secuencias que codifican las
proteínas implicadas en el desarrollo tumoral y se sustituyen
por un marcador de resistencia y por el gen transgénico que
se quiere expresar. Como en el caso de la transfección, a continuación se sigue el proceso de transformación que se da en
la naturaleza.
El DNA recombinante funciona cuando la célula transformada expresa la proteína o las proteínas correspondientes a los genes presentes en él. Las proteínas recombinantes sólo se expresan en cantidades apreciables si,
además de los genes, se incluye toda una serie de señales
adicionales que permiten la transcripción y la traducción de
dicha información genética. Estas secuencias son los pro-
Alimentos transgénicos
motores, las secuencias génicas que permiten la unión de
los mRNA a los ribosomas y las señales de terminación (cap.
5, Síntesis, degradación y recambio de las proteínas, tomo
I, y cap. 6, Regulación de la expresión génica en organismos
eucariotas, tomo I). A veces, se generan problemas si el gen
recombinante contiene intrones o ciertas señales que actúan de terminadores en el hospedador bacteriano. De esta
forma, la proteína recombinante puede ser procesada o plegada incorrectamente o incluso ser degradada.
Mención aparte merece la producción de proteínas recombinantes de uso en agroalimentación en sistemas microbianos eucarióticos, fundamentalmente levaduras y
hongos filamentosos. El uso de células animales es difícil,
debido al hecho de que muchas de ellas necesitan una superficie para crecer y tienen necesidades nutritivas complejas. Sin embargo, algunas proteínas son demasiado complejas para poderse producir en bacterias. Sufren procesos
de modificación química (acetilaciones, glucosilaciones) y
obligatoriamente tienen que utilizarse células eucarióticas
para producirlas correctamente.
n Clonado molecular
Un clon es una población de moléculas, bacterias, células o individuos idénticos que derivan de un ancestro
común. El clonado molecular permite la producción de gran
número de moléculas idénticas de DNA. Esta técnica se
basa en la posibilidad de construir moléculas de DNA híbrido
o moléculas quiméricas utilizando vectores de clonado,
como plásmidos, fagos, cósmidos o cromosomas artificiales,
que se pueden replicar de forma autónoma en una célula
hospedadora utilizando sus propios sistemas de control. De
esta manera se puede amplificar el DNA quimérico.
Cualquier procedimiento de clonación tiene cuatro partes
esenciales: a) un método de obtención de fragmentos de
DNA; b) la unión del DNA a un vector, con la consiguiente obtención del DNA recombinante; c) la introducción del DNA recombinante en un hospedador, y d) la disponibilidad de un
método de selección del clon que ha adquirido el DNA recombinante. La figura 19-1 ilustra el procedimiento general
de obtención de DNA recombinante y la figura 19-2, el de
clonado de DNA.
Para la obtención de fragmentos de DNA se utiliza preferentemente la digestión con enzimas de restricción (v. Enzimas de restricción, más adelante), pero también se pueden
obtener por rotura mecánica, síntesis de cDNA y síntesis química directa de oligonucleótidos. La unión al vector (v. Vectores de clonación, más adelante) se lleva a cabo mediante la
ligación de extremos cohesivos, la ligación de extremos
romos, el encolado mediante homopolímeros o el empleo de
moléculas espaciadoras, utilizando varias enzimas (v. Ligado
de fragmentos de DNA y Otras enzimas de interés en la tecnología del DNA recombinante, más adelante).
La introducción del DNA recombinante se lleva cabo mediante procedimientos de transformación bacteriana con
DNA plasmídico, transducción con fagos o cósmidos y, en
el caso de células eucariotas, mediante transformación o
CAPÍTULO
19
transfección con vectores diversos (v. Vectores de clonación, más adelante). La selección de los clones se realiza
mediante métodos microbiológicos, inmunoquímicos y de
hibridación con ácidos nucleicos
n Enzimas de restricción
Las endonucleasas son enzimas que cortan el DNA en secuencias específicas dentro de la molécula, en oposición a
las exonucleasas, que digieren los extremos terminales de
las moléculas de DNA. Un tipo de endonucleasas, denominadas genéricamente enzimas de restricción porque su presencia en una bacteria determinada restringe el crecimiento
de bacteriófagos, representa una herramienta clave en la tecnología del DNA recombinante. Estas enzimas cortan el DNA
de cualquier origen en secuencias muy específicas, al contrario que otras enzimas o métodos químicos o físicos que lo
hacen al azar. En la naturaleza protegen a la bacteria hospedadora de la infección por fagos, impidiendo la replicación del
DNA foráneo. Actualmente se conocen miles de estas enzimas, así como la secuencia específica de corte. Las enzimas
de restricción están acompañadas en las células de otras enzimas que metilan el DNA del hospedador, lo que impide la digestión por la propia enzima de restricción. Así, las metilasas
específicas de sitio y las enzimas de restricción siempre están
en las bacterias de forma apareada.
Las enzimas de restricción se denominan mediante varias letras que hacen mención a la bacteria de la que proceden. Las tres primeras letras sirven para nombrar el género
(primera letra) y la especie (segunda y tercera letras). Estas
pueden ir seguidas de una letra que designa la cepa y de un
número romano que indica el orden del descubrimiento. Por
ejemplo, EcoRI se ha obtenido de la cepa R de la bacteria Escherichia coli, y BamHI, de la cepa H de Bacillus amyloliquefaciens. La enzima EcoRII se obtuvo después de la EcoRI
(tabla 19-1).
Cada enzima de restricción corta una secuencia específica de DNA de doble cadena de 4 a 7 pares de bases (pb),
dando lugar a la aparición de extremos romos, como es el
caso de EcoRII o HpaI o de extremos solapantes o cohesivos,
por ejemplo BamHI. La figura 19-3 muestra el mecanismo de
acción de la enzima de restricción EcoRI. Teniendo en cuenta
que el DNA está constituido por cuatro bases diferentes (A, C,
G y T), una enzima de restricción que reconoce una secuencia
de 4 pb corta una media de cada 4 4 pb (256 pb) y una que reconoce una secuencia de 6 pb corta cada 46 pb (4.096 pb). Por
lo tanto, se puede elaborar en una determinada secuencia o
fragmento de DNA un mapa de restricción utilizando varias
enzimas. Los fragmentos producidos pueden separarse y, posteriormente, aislarse por electroforesis en gel de agarosa o
poliacrilamida, siendo éste un paso esencial para la clonación.
n Ligado de fragmentos de DNA
El ligado de fragmentos con extremos cohesivos es teóricamente muy sencillo, ya que después del apareamiento, la
5
TOMO
II
COMPOSICIÓN Y CALIDAD NUTRITIVA DE LOS ALIMENTOS
DNA complejo portador
del fragmento de interés
DNA vector
DNA enteros
DNA digeridos
Ligación
Productos
de la mezcla
de ambos DNA
con T4 DNA ligasa
Molécula
recombinante
Figura 19-1. Obtención de DNA recombinante. T4 DNA ligasa: DNA ligasa procedente del bacteriófago T4.
enzima DNA ligasa une los fragmentos complementarios de
los DNA heterólogos, dando lugar a la formación de una molécula de DNA recombinante (fig. 19-4). Sin embargo, los extremos de un vector pueden reconectarse por sí mismos des-
pués del tratamiento con una enzima de restricción. Asimismo, también pueden aparearse formando concatémeros
heterogéneos. Para solventar estos problemas se usan diluciones extremas de los fragmentos. En el caso de moléculas
In vitro
Escherichia coli K12
portadora del vector
Célula que contiene
el DNA de interés
In vivo
Escherichia coli K12
para transformar
Células
competentes
1
Purificación
rificaci
del DNA
4
sformac
Transformación
2
Digestión
gestión
5
3
igación
Ligación
6
Figura 19-2. Procedimiento general de clonado de DNA.
ción de clones
Selección
transformantes
6
ón de cl
Detección
clones
recombinantes
Alimentos transgénicos
BamHI
Secuencia
de corte
↓
AGATCT
TCTAGA
19
Sitio de reconocimiento
Tabla 19-1 Enzimas de restricción y secuencias
de corte del DNA
Endonucleasa
CAPÍTULO
Fuente bacteriana
5’
G-A-A-T-T-C
3’
3’
C-T-T-A-A-G
5’
Bacillus
amyloliquefaciens H
Tratamiento con EcoRI
↑
BgIII
↓
5’
G
3’
C-T-T-A-A
Bacillus globigii
AGATCT
TCTAGA
↑
EcoRI
G
3’
5’
EcoRI
↓
Escherichia coli RY13
GAATTC
CTTAAG
↑
EcoRII
A-A-T-T-C
Colas complementarias
↓
Escherichia coli R245
G A A T T C
G A A T T C
C T T A A G
C T T A A G
CCTGG
GGACC
↑
HindIII
↓
Haemophilus influenzae Rd
Generación de
extremos cohesivos
AAGCTT
TTCGAA
↑
↓
HhaI
Haemophilus haemoliticus
GCGC
CGCG
A A T T C
G
C T T A A
↑
Extremo cohesivo
↓
HpaI
G
GTTAAC
CAATTG
Haemophilus
parainfluenzae
↑
MstII
↓
Microcoleus strain
CCTNAGG
GGANTCC
G A A T T C
↑
↓
PstI
C T T A A G
Providentia stuartii 164
CTGCAG
GACGTC
↑
TaqI
↓
Thermus aquaticus YTI
TCGA
AGTC
↑
A: adenina; C: citosina; G: guanina; T: timina. Las flechas muestran el
sitio de corte. Según el sitio de corte se forman extremos romos (p.
ej., HpaI) o extremos cohesivos (p. ej., BamHI).
con extremos romos se añaden nuevas colas de polinucleótidos a los extremos 3’. Esta enzima se denomina transferasa
terminal. Por ejemplo, si se añade poli-dG al extremo 3’ de un
vector y poli-dC al extremo 3’ del DNA, se aparearán entre sí.
Este procedimiento se denomina encolado homopolimérico.
También se pueden unir segmentos sintéticos de DNA de
doble cadena con extremos romos, que contienen uno o más
sitios específicos para enzimas de restricción, denominados
DNA recombinante
Figura 19-3. Mecanismo de acción de la enzima de restricción EcoRI y su aplicación en la generación de moléculas de DNA recombinante.
espaciadores o polilinkers, a los extremos del DNA de cualquier
fragmento utilizando la DNA ligasa procedente del bacteriófago T4. Esta técnica permite unir cualquier par de extremos,
aunque no existe control de la orientación de la inserción o del
número de moléculas apareadas consigo mismas.
n Otras enzimas de interés en la tecnología
del DNA recombinante
En la tecnología del DNA recombinante se utiliza otra serie
de enzimas cuyas funciones se detallan a continuación.
La fosfatasa alcalina desfosforila los extremos 5’ del
RNA y del DNA. Se utiliza para eliminar los grupos 5’-fos-
7
TOMO
II
COMPOSICIÓN Y CALIDAD NUTRITIVA DE LOS ALIMENTOS
G-A-A-T-T-C
G-A-A-T-T-C
C-T-T-A-A-G
C-T-T-A-A-G
Digestión con EcoRI
G
Digestión con EcoRI
C-T-T-A-A
A-A-T-T-C
Hibridación de fragmentos
complementarios
G
Hueco
G A-A-T-T-C
C-T-T-A-A G
Hueco
DNA ligasa
G- A - A - T - T - C
C - T - T - A - A -G
Figura 19-4. Ligado de DNA heterólogo y formación de DNA recombinante.
fato y prevenir así la autoligación de fragmentos de DNA.
La nucleasa BAL-31 degrada tanto el extremo 5’ como el 3’
de moléculas de DNA, provocando el acortamiento progresivo de los fragmentos. Se utiliza para generar subfragmentos de secuenciación y también para localizar genes
concretos. La DNA polimerasa I sintetiza la formación de
DNA de doble cadena a partir de una hebra simple de DNA
que sirve como modelo. Se utiliza para la síntesis de cDNA,
la eliminación de mellas y la generación de extremos
romos a partir de extremos cohesivos. La enzima DNasa I
bajo condiciones apropiadas produce mellas en el DNA y
se utiliza en el mapeado de sitios hipersensibles del DNA
y en el mapeado de lugares de interacción del DNA con
proteínas. La exonucleasa l elimina nucleótidos del extremo 5’ y la exonucleasa II elimina nucleótidos del extremo 3’. Ambas se usan en la secuenciación del DNA. La
polinucleótido quinasa transfiere fosfatos terminales en
posición l desde el adenosintrifosfato (ATP) hasta los
grupos hidroxilo en 5’ del DNA o del RNA y se utiliza en el
marcado con el isótopo 32P del DNA o del RNA. La transcriptasa inversa sintetiza DNA a partir de RNA y se usa
para sintetizar cDNA a partir de RNA y para el mapeado de
regiones 5’ del RNA. Finalmente, la nucleasa S1 degrada
el DNA de cadena simple y se utiliza en la eliminación de
bucles en la síntesis de cDNA y en el mapeado de las regiones 5’ y 3’ del RNA.
n Vectores de clonación
8
Los vectores de clonación son plásmidos o fagos o variaciones de ellos. Los plásmidos son moléculas de DNA de
doble cadena circulares cuya función natural más importante es conferir ventajas adaptativas a las células que los
contienen. Los plásmidos tienen varias propiedades que
hacen que sean muy útiles como vectores de clonado. Por
ejemplo, están presentes en las bacterias como copias únicas o múltiples que se replican independientemente del
DNA bacteriano. Actualmente se conoce la secuencia completa de numerosos plásmidos, así como la localización precisa de los sitios de corte para diferentes enzimas de restricción y, por lo tanto, los lugares en los que es posible insertar
DNA de otros organismos. Además, los plásmidos, al tener
un tamaño muy distinto al del cromosoma bacteriano,
pueden aislarse con facilidad. La figura 19-5 muestra el
mapa de restricción del plásmido pBR322 de E. coli, y la figura 19-6, la inserción de DNA extraño en un plásmido.
Los fagos son virus que atacan bacterias y están constituidos usualmente por moléculas de DNA lineal, con varios
sitios de corte para enzimas de restricción específicas en
los cuales puede insertarse el DNA foráneo, de forma que el
conjunto se empaqueta en la cabeza proteica del virus. El
DNA quimérico formado puede recogerse después de que
se complete el ciclo de lisis celular, de modo que se produzcan numerosas partículas infectivas. La ventaja de los
fagos como vectores en el clonado molecular de DNA es
que pueden aceptar fragmentos de DNA de 10-20 kpb,
mientras que los plásmidos tan sólo pueden aceptar fragmentos de 6-10 kpb.
Los cósmidos son plásmidos que contienen unas secuencias específicas, denominadas cos, necesarias para el empaquetamiento del DNA del fago l dentro de su cabeza. Estos
plásmidos combinan las ventajas de los propios plásmidos y
de los fagos, ya que crecen dentro de la bacteria como plás-
Alimentos transgénicos
midos, pero pueden almacenar una cantidad mucho mayor
de DNA dentro de la cabeza del fago, ya que la mayor parte
del genoma del fago l ha sido eliminada. Usualmente los cósmidos pueden llevar insertos de hasta 50 kpb.
Otro tipo de vector de clonación son los cromosomas
artificiales de levaduras (yeast artificial chromosome, YAC).
Pueden llevar insertos mucho más grandes, ya que se trata
de segmentos cromosómicos de levaduras, por lo tanto lineales, que contienen la región centromérica, siendo segregados de manera muy estable de acuerdo con patrones
mendelianos. Los YAC permiten clonar segmentos de DNA
de más de 40 kpb, incluso hasta cientos de kpb y, por lo
tanto, la amplificación de grandes moléculas de DNA con un
fondo genético simple. En las levaduras, además de los
YAAC, se utiliza para la clonación toda una serie de plásmidos (episómicos, centroméricos, etc.).
Para la inserción y expresión del cDNA en células de
mamíferos se han desarrollado vectores específicos basados en virus animales, por ejemplo adenovirus, que tienen genomas DNA, y retrovirus, que tienen genomas RNA.
Aunque estos vectores tienen limitaciones en cuanto a la
longitud de los insertos, son capaces de infectar numerosos
tipos celulares y permiten la expresión eficiente de genes
complejos.
Un tipo especial de vector es el constituido por los denominados vectores de expresión. Permiten la expresión de
uno o varios genes introducidos con el inserto de DNA.
Estos vectores están construidos de manera que, por un
lado, contienen promotores muy activos fácilmente inducibles y, por otro, codones adecuados que permiten el inicio
de la traducción en fase de los RNA correspondientes. También contienen señales para la terminación de la transcripción y de la traducción y para el procesamiento de las proteínas (cap. 5, Síntesis, degradación y recambio de las
CAPÍTULO
19
proteínas, tomo I, y cap. 6, Regulación de la expresión génica
en organismos eucariotas, tomo I).
n Selección del DNA recombinante
Como anteriormente se indicó, todos los vectores llevan
un marcador o propiedad genética seleccionable. Los plásmidos y los cósmidos llevan marcadores nutricionales o de
resistencia a antibióticos u otros fármacos. En el caso de los
fagos, la formación de placas de lisis representa en sí misma
la propiedad seleccionada. En el caso de los DNA recombinantes que llevan un vector plasmídico con marcadores de
resistencia a antibióticos, la selección de las células clonadas
se realiza utilizando medios de cultivo que llevan añadidos
dichos antibióticos, ya que en estos medios sólo crecen las
bacterias que llevan los plásmidos recombinantes.
La inactivación por inserción del DNA foráneo de un
marcador de resistencia a antibióticos o de un gen como
la b-galactosidasa son ejemplos de cómo se puede seleccionar una población de células recombinantes. Por ejemplo, si en el conocido vector plasmídico pBR322, que tiene
como marcadores de resistencia los genes que codifican
para la resistencia a la tetraciclina (tet) y a la ampicilina
(amp), se inserta un segmento de DNA foráneo en el sitio
único de corte para la enzima de restricción PstI (ubicado
en el locus amp), las bacterias que incorporen este DNA
recombinante serán resistentes a la tetraciclina pero sensibles a la ampicilina.
La detección por técnicas inmunoquímicas de clones
que sintetizan una nueva proteína es útil si el gen insertado
se transcribe y traduce a proteína, especialmente cuando
el gen no confiere ninguna propiedad al hospedador fácilmente seleccionable con otros métodos. Para utilizar esta
EcoRI HindIII
• Con sitios únicos
de restricción para
poder clonar en ellos
• Con un marcador
directamente
seleccionable
(selección)
• Con un marcador
que se inactive
por la introducción
del inserto
(detección)
Ampr
Tetr
PstI
SalI
Sal
pBR322
4,4 kb
• Pequeñas moléculas
de DNA autorreplicativas
(plásmidos o genomas
fágicos)
ColE1ori
Figura 19-5. Características de los vectores de clonación. Se representa el plásmido pBR322 de E. coli que contiene un origen
de replicación, varios sitios de restricción únicos (EcoRI, HindIII, SalI) y dos marcadores de resistencia a antibióticos (ampicilina y tetraciclina). Amp: ampicilina; Tet: tetraciclina.
9
TOMO
II
COMPOSICIÓN Y CALIDAD NUTRITIVA DE LOS ALIMENTOS
EcoRI
Plásmido
EcoRI
G
A A T T
C
T T A A
C
G
EcoRI
G A AT T C
DNA para ser
insertado
TTC
G AA
EcoRI
CT T AA G
Extremos
cohesivos
EcoRI
CT T AA G
EcoRI
Recombinación
y ligación de DNA
A
A
C
T T
A
G
G
C
A
C
A
T
T
T
G
T
DNA
recombinante
A
A
A
T
G
T
C
Figura 19-6. Inserción de DNA extraño en un plásmido.
técnica, es necesario disponer del anticuerpo específico
para la proteína codificada en el transgén.
Finalmente, es posible acudir a los métodos de hibridación con ácidos nucleicos para la selección de recombinantes. El procedimiento consiste en detectar secuencias
determinadas de DNA en colonias transformadas por hibridación in situ con sondas radiactivas o marcadas con un fluoróforo de fragmentos de DNA del gen que se quiere detectar.
Este método es capaz de identificar una colonia positiva
entre miles de negativas. Una gran ventaja de los métodos de
hibridación es que no requieren la expresión de los genes
insertados y puede aplicarse a cualquier secuencia.
n Librerías genómicas
10
La combinación de enzimas de restricción y de varios
vectores de clonado permite el empaquetado del genoma
completo de cualquier organismo. La colección de clones
recombinantes que constituyen el genoma global se denomina genoteca o librería genómica. De forma similar, una librería de cDNA comprende todos los cDNA complementarios de la población de mRNA presentes en un organismo o
tejido determinado.
Las librerías genómicas se preparan por digestión parcial del DNA genómico utilizando una enzima de restricción,
con objeto de generar fragmentos suficientemente largos
de DNA de manera que contengan genes completos intactos. Estos fragmentos se reinsertan en vectores que permiten la inserción de fragmentos largos de DNA como los
YAC o los vectores basados en el bacteriófago P1 de E. coli.
Para detectar la función de genes presentes en el cDNA
de las librerías genómicas se utilizan vectores de expresión,
algunos de ellos con genes que codifican para inhibidores
de proteasas, con lo que la producción de la proteína final
aumenta.
Las sondas marcadas con 32P o con una molécula fluorescente se utilizan para reconocer secuencias complemen-