MANUAL DE LABORATORIO DE BIOQUÍMICA MÉDICA I
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA Departamento de Formación Básica Disciplinaria Academia de Bioquímica Médica I MANUAL DE LABORATORIO DE BIOQUÍMICA MÉDICA I Primer Semestre 2016-2017 Julio 2016 Alumno: Profesor: Grupo: Grado: Equipo: Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA Departamento de Formación Básica Disciplinaria Academia de Bioquímica Médica I Reglamento Interno de Bioquímica Médica I CAPITULO I. DE LA INSCRIPCIÓN Y ORGANIZACIÓN DE LOS ALUMNOS Artículo 1. La materia de Bioquímica Médica I es impartida por los profesores de la Academia de Bioquímica Médica I del Departamento de Formación Básica Disciplinaria. Artículo 2. Para quedar inscritos y tener derecho a asistir al curso, los alumnos deberán: a) Aparecer en las listas oficiales del Sistema de Administración Escolar del IPN. b) Llenar y entregar una forma de registro y control interno que les proporcionarán los profesores de grupo el primer día de clases. c) Entregar una fotografía reciente, de tamaño infantil. Artículo 3. Los incisos b y c mencionados en el artículo anterior, deben cumplirse a más tardar una semana después de iniciado el curso. Artículo 4. Cada grupo deberá elegir en la primera semana de clases un representante, que será su vocero oficial, quien tratará los asuntos académicos relacionados con el curso ante sus profesores o la Academia. CAPÍTULO II. DE LA ORGANIZACIÓN DEL CURSO Artículo 5. El curso de Bioquímica Médica I es TeóricoPráctico y se desarrolla mediante tres tipos de actividades: a) Clases de Teoría. Se imparten en las aulas de la Escuela Superior de Medicina, asignadas a cada grupo al inicio del curso. b) Prácticas de Laboratorio. Que se realizan en los Laboratorios de enseñanza de la Academia de Bioquímica Médica I. c) Actividades complementarias. Las que sean asignadas por los profesores, y que complementen las actividades académicas. Artículo 6. En las clases de Teoría se desarrollan los temas del programa con la participación activa de los alumnos. Artículo 7. En las prácticas de Laboratorio los alumnos realizan experimentos sobre temas que complementan la teoría, y resuelven problemas aplicativos. Artículo 8. Las actividades complementarias, versarán sobre tópicos de interés para la formación de los alumnos. CAPITULO III. DE LA ASISTENCIA Artículo 9. Como se indica en los incisos IV y VI del artículo 107 del Reglamento Interno del I.P.N., es obligación de los alumnos asistir con puntualidad y regularidad a las clases de teoría y prácticas de laboratorio en los horarios que les serán notificados al inicio del curso. Artículo 10. Los profesores controlarán la asistencia a clases de teoría y laboratorio, llamando lista de presentes al inicio de las sesiones, con un periodo de tolerancia de 15 minutos. No hay retardos. En las sesiones de laboratorio, los alumnos que lleguen después del periodo de tolerancia no podrán permanecer en la sesión. Artículo 11. Los alumnos asistirán a las clases de teoría, prácticas de laboratorio y exámenes con uniforme blanco, que incluye bata, pantalón, zapatos blancos cerrados, NO TENIS, y sin ningún tipo de accesorio o prenda así como portando en la solapa izquierda del uniforme su credencial de alumno vigente, como lo marca el inciso VII del artículo 107 del Reglamento Interno del I.P.N. Quien no cumpla con estos requisitos no podrá permanecer en la sesión, y se hará acreedor a la falta correspondiente. Artículo 12. Durante las sesiones tanto de Teoría como Laboratorio, los alumnos deberán activar el modo silencioso de sus teléfonos celulares, para no interrumpir el trabajo. Artículo 13. Las inasistencias a teoría y laboratorio se podrán justificar dentro de los tres días hábiles siguientes, con la documentación oficial pertinente (es particular interés la participación como ponentes en Congresos). Debido a la falta de recursos, en caso de no asistir al laboratorio, el alumno podrá justificar la falta pero no reponer la práctica. Artículo 14. Las actividades de otras materias, realizadas en el horario correspondiente a Bioquímica Médica I, no se consideran justificantes de falta. CAPÍTULO IV. DEL TRABAJO EN EL LABORATORIO Artículo 15. Por razones de disciplina y seguridad, ninguna persona podrá trabajar en el laboratorio sin bata larga de laboratorio blanca y el equipo de seguridad apropiado. Además, deberá llevar manual de laboratorio vigente completo impreso y encuadernado como se le indicó (no se aceptan prácticas individuales o medios electrónicos) El alumno que no cumpla este requisito deberá abandonar el recinto y se hará acreedor a la falta respectiva. Artículo 16. Queda estrictamente prohibido fumar e ingerir alimentos o bebidas en el laboratorio, así como portar gorras, sombreros, bufandas o cualquier otro accesorio ajeno al uniforme. En la misma forma, los alumnos deberán abstenerse de recibir visitas, así como sentarse en las mesas de trabajo, o realizar cualquier tipo de acciones indisciplinadas. Artículo 17. Para trabajar en el laboratorio los alumnos formarán equipos, con base en las instrucciones que reciban del profesor al inicio del curso. mlvm / maov / i Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Artículo 18. Cada equipo de trabajo será responsable del material de vidrio, utensilios, reactivos, aparatos, etc. que utilice durante el desarrollo de la práctica. Antes de iniciar la práctica deberán revisar cuidadosamente dicho material y anotar en el vale cualquier anomalía que observe, ya que de no hacerlo se harán responsables de los daños que presente el material y deberán reponerlo en un plazo máximo de quince días, con nota de compra. Artículo 19. Al terminar la práctica, el equipo deberá dejar la mesa de trabajo limpia y en orden, como la recibió. Artículo 20. Los alumnos no podrán abandonar el laboratorio hasta que la práctica termine, o cuando sean autorizados por el maestro. Sí un alumno abandona el laboratorio sin autorización, se hará acreedor a la falta de ese día. Artículo 21. El alumno deberá entregar un reporte escrito de la práctica, que formará parte de su evaluación de laboratorio. CAPITULO V. DE LA EVALUACIÓN Artículo 22. La evaluación final de la materia, se hará con base en tres Evaluaciones Parciales Ordinarias, y los Exámenes Extraordinario y a Título de Suficiencia. Artículo 23. Las calificaciones quedarán registradas en el acta de examen correspondiente con un número entero de cero a diez. En calificaciones superiores a 6 con fracciones de cinco décimas o más, la calificación se aumentará al entero inmediato superior. En calificaciones inferiores a 6, las fracciones decimales serán consideradas nulas. Artículo 24. La evaluación parcial ordinaria de la materia se hará tomando en cuenta los resultados obtenidos en: a) El examen parcial departamental de los temas revisados en el aula. b) La calidad de su trabajo en el laboratorio y de sus informes de las prácticas. c) Las actividades académicas complementarias. Artículo 25. Los exámenes departamentales ordinarios, extraordinario y a título de suficiencia, se realizarán en el lugar, fecha y hora que se dará a conocer al inicio del curso. Artículo 26. Todos los grupos deberán iniciar los exámenes departamentales a la hora programada. Los sinodales de examen controlarán la asistencia, llamando lista de presentes al inicio del examen, con un periodo de tolerancia de 15 minutos, los alumnos que lleguen después del periodo de tolerancia no podrán presentar examen ni permanecer en el salón. Laboratorio de Bioquímica Médica I Artículo 27. Durante los exámenes, los alumnos no podrán llevar consigo teléfonos celulares. Artículo 28. Para tener derecho a presentar cada uno de los exámenes departamentales ordinarios, los alumnos deberán tener un mínimo del 80% de asistencia global (en teoría y laboratorio) en el periodo examinado, siempre y cuando no hayan acumulado más del 20% de faltas en el laboratorio (del total de prácticas del curso). Artículo 29. Cuando por causa justificada (ver artículos 13 y 14 del presente Reglamento) un alumno no pueda asistir a presentar un examen ordinario, deberá proceder según el artículo 46 del Reglamento General de Estudios del IPN. Artículo 30. Cada evaluación departamental ordinaria se integrará por el 50% de la calificación del examen de teoría, más 30% de la calificación de laboratorio, más 20% de la calificación de actividades complementarias del periodo correspondiente. Artículo 31. La calificación final de la materia de Bioquímica Medica I se obtendrá promediando las tres evaluaciones parciales ordinarias. La calificación mínima aprobatoria es de 6 (seis). Artículo 32. Cuando un alumno no apruebe o intente mejorar su calificación ordinaria, deberá presentar el Examen Extraordinario, presentando el total de los contenidos de la materia. Artículo 33. Para tener derecho a presentar el Examen Extraordinario de la materia, los alumnos deberán contar con un mínimo de 80% de asistencia a las clases de teoría y también 80% de asistencia a las prácticas de laboratorio, del total de clases del curso. Artículo 34. La calificación mínima aprobatoria del Examen Extraordinario será de 6 (seis). Cuando un alumno presente este examen para mejorar la calificación ordinaria obtenida, su calificación final será la más alta. Artículo 35. Los alumnos que al término del curso tengan calificación reprobatoria y como mínimo 50% de asistencia a las sesiones de teoría y prácticas de laboratorio, tendrán derecho a presentar el Examen a Título de Suficiencia. CAPITULO VI. OTROS Artículo 36. Cualquier caso no contemplado en este Reglamento deberá someterse por escrito, a la Academia de Bioquímica Médica I, para su discusión y resolución inapelable. LA ACADEMIA DE BIOQUÍMICA MÉDICA I Agosto 2016 mlvm / maov / ii Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA Departamento de Formación Básica Disciplinaria Academia de Bioquímica Médica I Reglamento de Laboratorio de Bioquímica Médica I CAPÍTULO I. DEL MATERIAL DE TRABAJO. Artículo 1. Durante las sesiones de práctica cada equipo de trabajo deberá contar con el material siguiente: Franela, cerillos, masking tape, marcador indeleble, rollo de toallas de papel absorbente, 1 litro de agua destilada y un tubo de tiras reactivas para medir pH, con escala de 1 a 14. Artículo 2. Para su protección, durante su permanencia en el laboratorio cada alumno debe contar con el equipo de protección siguiente: bata de laboratorio blanca larga y abotonada, gorro de cirujano, mascarilla de protección, NO GOGLES y guantes de cirujano. CAPÍTULO II. DE LA ASISTENCIA. Artículo 3. Los(as) alumnos(as) que lleguen después del periodo de tolerancia, TENDRÁN FALTA Y NO PODRÁN PERMANECER EN EL LABORATORIO. NO HAY RETARDOS. Artículo 4. Los(as) alumnos(as) que abandonen el laboratorio sin autorización del profesor, TENDRÁN FALTA Y NO PODRÁN PERMANECER EN EL LABORATORIO. Artículo 5. Los(as) alumnos(as) que no cumplan con los requisitos de seguridad señalados en el Artículo 2 del presente reglamento, NO PODRÁN PERMANECER EN EL LABORATORIO Y SE HARÁN ACREEDORES A LA FALTA CORRESPONDIENTE. Artículo 6. Cuando sea necesario tomar muestra, y no haya sido previamente designado algún o algunos donadores con un fin específico, el donador de cada equipo será el último(a) alumno(a) que llegue a esa sesión. CAPÍTULO III. DEL TRABAJO EN EL LABORATORIO. Artículo 7. Al asistir a las sesiones de práctica, los alumnos deberán entrar al laboratorio con su equipo de seguridad completo y llevar consigo su manual de laboratorio engargolado con gusano de plástico y cubiertas de plástico transparente, quienes no cuenten con el manual impreso completo NO PODRÁN PERMANECER EN EL LABORATORIO Y SE HARÁN ACREEDORES A LA FALTA CORRESPONDIENTE. El manual debe estar debidamente rotulado con los siguientes datos en la primera hoja: a)Nombre del laboratorio. b)Nombre del alumno. c)Nombre del profesor. d)Número de equipo. e)Grupo y grado. Semestre Julio-Diciembre 2014 Artículo 8. La segunda hoja será el Reglamento Interno de la materia, seguido del presente reglamento, las Reglas de Seguridad del Laboratorio y los Símbolos de Seguridad aplicables al Laboratorio. Artículo 9. El día martes anterior a la práctica, en el momento que se le solicite, cada equipo de laboratorio entregará un Formato de Reporte de Práctica, escrito a mano, rotulado con los siguientes datos en la primera hoja: a)Nombre del laboratorio. b)Título de la práctica. c)Grupo. d)Número de equipo. e)Nombre de los integrantes del equipo que participaron en la elaboración. f)Nombre del profesor. g)Fecha de entrega. h)Fecha de la práctica. Artículo 10. El resto del formato debe incluir: a)Objetivo y fundamento específicos de cada experimento. b)Evidencia de Aprendizajes resueltas, incluyendo reacciones y cálculos. c)Espacios apropiados para: i.registro de resultados (Tablas, Cuadros, Gráficos, etc.) ii.elaboración de datos experimentales (cálculos, transformaciones, etc.) iii.discusión y conclusiones de cada experimento. d)Bibliografía consultada. Artículo 11. Los equipos que no entreguen el Formato de Reporte de Práctica, en la forma y momento que se solicite, se harán acreedores a una calificación de cero en esta parte de su evaluación. Artículo 12. Los equipos que hayan entregado en tiempo y forma su Formato de Reporte de Práctica, lo recibirán calificado, el miércoles siguiente para que efectúen, en el mismo documento, a mano las correcciones que se indiquen. Artículo 13. Al inicio de cada práctica, los profesores asignarán a cada alumno(a) el experimento(s) que realizarán en la sesión. Artículo 14. Al final de la sesión de laboratorio y antes de retirarse, cada equipo entregará el Formato de Reporte de Práctica completo, incluyendo para cada experimento: a)Nombre del alumno(a) que lo efectuó. b)Registro de resultados. c)Elaboración de datos experimentales. d)Discusión de resultados. e)Conclusión. mlvm / maov / iii Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I Artículo 15. Al terminar su trabajo y después de haber en- Artículo 18. Trabajo Individual en el Laboratorio. Repretregado el material de la práctica y su reporte, los integran- senta hasta el 50% de la calificación. Incluye tes de cada equipo abandonarán el laboratorio, para no disa)Puntualidad en la asistencia. traer a sus compañeros, dejando su lugar de trabajo limpio b)Resultados prácticos, obtenidos en los problemas asigy ordenado. nados en el laboratorio. Artículo 16. El día hábil anterior a cada sesión de práctic)La velocidad, orden, limpieza y disciplina con que caca, en el salón de clase se realizará el seminario de prepada alumno realice su trabajo en el laboratorio. ración de la práctica, para que los alumnos reafirmen el Artículo 19. Reporte de práctica. Representa hasta el 20% conocimiento del desarrollo de los experimentos. En esta de la calificación. Se evalúa básicamente: sesión los alumnos deberán presentarse con el manual de a)Puntualidad en la entrega laboratorio. b)Discusión. CAPÍTULO IV. DE LA EVALUACIÓN. c)Conclusiones. d)Respuestas de los cuestionarios de Evidencia de Artículo 17. Formato Reporte de Práctica y muestras por Aprendizajes. Equipo. Es hasta el 20% de la calificación. Se evalúan: e)Elaboración e interpretación de cálculos y gráficas. a)Puntualidad en la entrega. Artículo 20. Participación en la sesión de discusión de reb)La calidad de los objetivos y fundamentos de cada exsultados. Representa hasta el 10% de la calificación. Se perimento. c)Respuesta de los cuestionarios de Evidencia de Apren- toma en cuenta: dizajes. a)Participación en la discusión. d)Elaboración de cálculos. b)Calidad de la participación. e)Que la(s) muestra(s) sea(n) adecuada(s). Artículo 21. La calificación parcial ordinaria de Laboratorio será el promedio aritmético de las calificaciones obtenidas en las prácticas realizadas durante el periodo evaluado, ajustadas a valores enteros, como se indica en el Reglamento Interno de la materia. PROFESORES DE TEORÍA Y LABORATORIO GRUPOS 2CM4 Y 2CM10 Julio 2016 Semestre Julio-Diciembre 2014 mlvm / maov / iv Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA Departamento de Formación Básica Disciplinaria Academia de Bioquímica Médica I Reglas de Seguridad en el Laboratorio de Bioquímica Médica I El manejo inapropiado de sustancias, materiales y equipo que se encuentran en el laboratorio, representa peligro tanto a la salud de las personas, como a la integridad de las instalaciones y equipo de trabajo. Es por ello que se deben obedecer las Reglas de seguridad que se enlistan a continuación, clasificadas en los siguientes grupos: 1. Sustancias químicas 2. Material biológico y animales de laboratorio 3. Material de vidrio 4. Equipo eléctrico e instalaciones de gas 5. Orden y limpieza 1. Sustancias químicas. o Cada sustancia debe tener etiqueta de identificación, si no es así no los utilice. o Antes de utilizar una sustancia, verifique que se trata del reactivo correcto y que tiene la concentración requerida. o Identifique la naturaleza de la sustancia y el tipo de peligro que implica su manejo; ¿es veneno?, ¿qué tan tóxico es?, ¿es inflamable?, ¿es corrosivo? o Evite el contacto o exposición innecesaria con sustancias químicas, utilice el equipo de protección adecuado y disponible: bata larga, lentes, guantes, campana extractora, etc. o No pipeteé sustancias químicas directamente. Siempre utilice la pre pipeta. o Evite inhalar productos químicos y sus vapores. o Trabaje y mantenga bajo la campana los reactivos corrosivos o volátiles. o Los hidrocarburos ligeros y solventes deben manejarse lejos del fuego u otras fuentes de calor. Empleé baño maría para calentarlos. o Para diluir los ácidos, estos deben verterse lentamente en el agua, agitando cuidadosamente. o No vierta agua directamente sobre el ácido porque provocará salpicaduras o No deje sobre la mesa tapones de frascos de ácidos u otras sustancias corrosivas, porque se pueden contaminar o dejar residuos corrosivos que podrían causar quemaduras. 2. Material biológico y animales de laboratorio o Para el manejo de estos materiales protéjase adecuadamente según sea el caso. Usando guantes, cubre boca, etc. o Para la manipulación y el sacrificio de los animales de experimentación siga las indicaciones del Profesor. o Maneje cuidadosamente las muestras biológicas (sangre, orina, saliva, etc.) para evitar contaminaciones de personas y materiales. Semestre Julio-Diciembre 2014 o Todo el material biológico, equipos y de desecho (cadáveres, muestras biológicas, algodón, gasas, guantes, jeringas, etc.) deberán ser incinerados adecuadamente, para lo cual, deberá usted seguir las instrucciones del Profesor para dejarlos convenientemente preparados. 3. Material de vidrio o Debe examinar todo el material de vidrio antes de utilizarlo, para detectar la existencia de grietas o roturas. En el caso de que encuentre material defectuoso, repórtelo de inmediato al encargado del laboratorio para que se lo cambie. o No use el material de vidrio con orillas cortantes, con cuarteadoras, o en general en mal estado. o Debe transportar, mover o manipular sólo la cantidad de material de vidrio que pueda manejar con seguridad. o Use pinzas, franela o guantes de asbesto para transportar o mover recipientes de vidrio calientes. o Nunca deje material roto para ser lavado, repórtelo y tírelo a la basura. o No deje vidrios rotos sobre la mesa o en cualquier otro lugar en donde pueda causar accidentes. o Al calentar recipientes de vidrio, use llama suave al principio del calentamiento. o Limpie inmediatamente los materiales que goteen o se derramen, mediante uso de la franela u otros materiales para embeber el líquido y evitar que se disperse. o En caso de líquidos tóxicos derramados, protéjase adecuadamente y ventile el área. 4. Equipo eléctrico e instalaciones de gas. o No use equipo eléctrico defectuoso. o Verifique que los enchufes y conexiones estén en buenas condiciones; en caso de que existan cables desnudos o en mal estado, repórtelos inmediatamente. o Maneje el equipo eléctrico y sus conexiones con las manos secas y cerciórese que el piso se encuentra seco. Mantenga seco el espacio alrededor del equipo eléctrico. o Antes de encender el mechero, revise que tanto éste como la manguera se encuentren en buen estado, verifique que esté adecuadamente conectado a la tubería de gas (tubos de color amarillo) y retire todo material inflamable cercano. o En caso de accidente, retírese inmediatamente y cierre la llave de paso que se encuentra bajo la tarja de cada mesa. 5. Orden y limpieza o Una vez verificado el buen estado del material de vidrio, lávelo para asegurar su limpieza. o Mantenga siempre limpia y en orden su área de trabajo. mlvm / maov / v Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I o No intercambie el contenido de los frascos de reactivo. o Cuando requiera volver a llenar sus frascos reactivos, Use sólo los tapones de los recipientes correspondientransfiera del frasco de almacenamiento, la cantidad netes. cesaria a través de un vaso de precipitados, no devuelva el sobrante al envase original, busque otro frasco reactivo y vierta el sobrante. Nunca emplee pipetas para efectuar este procedimiento. ACADEMIA DE BIOQUÍMICA MÉDICA I Enero 2007 Semestre Julio-Diciembre 2014 mlvm / maov / vi Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA Departamento de Formación Básica Disciplinaria Academia de Bioquímica Médica I Calendario de Prácticas de Laboratorio Grupos 2CM4 y 2CM10 Práctica Introducción al Laboratorio de Bioquímica Médica I Fecha 18 de Agosto Propiedades de las Soluciones 25 de Agosto Soluciones Electrolíticas y pH 1 de Septiembre Soluciones Reguladoras 8 de Septiembre Propiedades de Proteínas 29 de Septiembre Cinética Química y Catálisis 6 de Septiembre Cinética Enzimática 13 de Octubre Propiedades de Glúcidos 20 de Octubre Oxidaciones Biológicas 10 de Noviembre Propiedades de Lípidos 17 de Noviembre Propiedades de Ácidos Nucléicos 1 de Diciembre mlvm / maov / vii Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I Contenido REGLAMENTO INTERNO DE BIOQUÍMICA MÉDICA I I REGLAMENTO DE LABORATORIO DE BIOQUÍMICA MÉDICA I III REGLAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA MÉDICA I CALENDARIO DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO V VII CONTENIDO VIII INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO 1 DISTRIBUCIÓN DE ALUMNOS 1 EL VALE DE MATERIAL DE LABORATORIO 1 MANEJO DEL MECHERO 2 COMO CALENTAR UN LÍQUIDO EN UN TUBO DE ENSAYO 2 PREPARACIÓN DE UN BAÑO MARÍA 3 MANEJO DE REACTIVOS LÍQUIDOS 3 MANEJO DE REACTIVOS SÓLIDOS. 5 COMO TARAR TUBOS PARA CENTRIFUGACIÓN. 5 PROPIEDADES DE LAS SOLUCIONES 7 MEDIDA DE LA PRESIÓN OSMÓTICA. MÉTODO DIRECTO 7 PREPARACIÓN DE UNA SOLUCIÓN DE NACL 2% P/V 8 DIÁLISIS 8 PREPARACIÓN DE UNA SOLUCIÓN DE CH3COOH 0.1M 9 DETERMINACIÓN DE CONCENTRACIÓN POR TITULACIÓN 10 DIFUSIÓN EN LÍQUIDOS 11 SOLUCIONES ELECTROLÍTICAS Y PH 12 DISOCIACIÓN DE UNA SAL Y ELECTROLISIS DEL AGUA 12 CONDUCCIÓN DE CORRIENTE EN ELECTROLITOS FUERTES Y DÉBILES 12 DIFERENCIA DE CONDUCTIVIDAD ENTRE ELECTROLITOS DÉBILES Y FUERTES 13 PREPARACIÓN DE SOLUCIONES DE PH CONOCIDO CON ELECTROLITOS FUERTES Y DÉBILES. 14 ACIDEZ VERDADERA Y ACIDEZ DE TITULACIÓN 14 SOLUCIONES REGULADORAS 16 PODER REGULADOR 16 COMPORTAMIENTO ÁCIDO-BASE DE GLICINA 16 PROPIEDADES DE PROTEÍNAS 19 DETERMINACIÓN DEL PUNTO ISOELÉCTRICO DE LA CASEÍNA 19 REACCIÓN DE NINHIDRINA. 20 REACCIÓN DEL BIURET 20 REACCIÓN XANTOPROTÉICA 21 mlvm / maov / viii Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I REACCIÓN DE MILLON 21 REACCIÓN DE AMINOÁCIDOS AZUFRADOS. 22 PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS POR METALES PESADOS 23 PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS POR ÁCIDOS FUERTES. 24 PRECIPITACIÓN POR ALCOHOL 24 CINÉTICA QUÍMICA Y CATÁLISIS 26 COMPROBACIÓN DE LA LEY DE ACCIÓN DE MASAS 26 EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN SOBRE LA VELOCIDAD DE UNA REACCIÓN QUÍMICA 26 INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA SOBRE LA VELOCIDAD DE UNA REACCIÓN QUÍMICA 27 EFECTO DEL PH SOBRE LA VELOCIDAD DE UNA REACCIÓN QUÍMICA. 28 EFECTO DE UN CATALIZADOR INORGÁNICO SOBRE LA VELOCIDAD DE HIDRÓLISIS DE SACAROSA 29 EFECTO DE UN CATALIZADOR BIOLÓGICO SOBRE LA VELOCIDAD DE HIDRÓLISIS DE SACAROSA 29 CINÉTICA ENZIMÁTICA 31 PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN DE AMILASA 31 EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA 31 EFECTO DEL PH SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA. 32 EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA. 33 EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE ENZIMA SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA. 34 PROPIEDADES DE GLÚCIDOS 36 DETERMINACIÓN DE LA ESTRUCTURA CRISTALINA DE GLÚCIDOS. 36 FORMACIÓN DE OSAZONAS 36 REACCIÓN DE MOLISCH-UDRANSKY 37 REACCIÓN DE FEHLING 38 REACCIÓN DE BARFOED 38 REACCIÓN DE BIAL 39 REACCIÓN DE SELIWANOFF 39 REACCIÓN DE LUGOL 40 OXIDACIONES BIOLÓGICAS 42 OXIDACIÓN POR PÉRDIDA DE ELECTRONES 42 OXIDACIÓN POR DESHIDROGENACIÓN 43 OBTENCIÓN DE LA FRACCIÓN MITOCONDRIAL DEL TEJIDO 43 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE DESHIDROGENASA SUCCÍNICA 44 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE CITOCROMO-OXIDASA. 45 PROPIEDADES DE LÍPIDOS 47 REACCIÓN DE HANUS O ÍNDICE DE YODO 47 EXTRACCIÓN DE LÍPIDOS DE CEREBRO. 48 mlvm / maov / ix Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I IDENTIFICACIÓN DE FOSFOLÍPIDOS DE CEREBRO POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA. 48 IDENTIFICACIÓN DE CEREBRÓSIDOS. 49 REACCIÓN DE LA ACROLEÍNA. IDENTIFICACIÓN DE ACILGLICÉRIDOS. 49 REACCIÓN DE LIEBERMANN-BURCHARDS 50 GRADO DE PERMEABILIDAD DE UNA CAPA LIPÍDICA 50 PROPIEDADES DE ÁCIDOS NUCLEICOS 52 OBTENCIÓN DE DNA DEL BAZO 52 IDENTIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE DNA. 53 IDENTIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE RNA 54 IDENTIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE FOSFATO TOTAL 55 APÉNDICE I. CURVA TIPO DE AZUCARES REDUCTORES 56 APÉNDICE II. AUXILIAR DE MACROPIPETEADO BRAND – PREPIPETA 57 APÉNDICE III. PUENTE DE WHEATSTONE 59 APÉNDICE IV. SIMBOLOGÍA DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO 61 mlvm / maov / x Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO Distribución de alumnos Desarrollo a) Antes de entrar al laboratorio, todos los alumnos deberán tener puesta y abotonada su bata de laboratorio y portar correctamente el equipo de protección. También deben tener listo su material de trabajo. b) Cuando el profesor lo indique, los alumnos colocarán su mochila en el lugar que les sea designado. c) Siguiendo las instrucciones de su profesor, localice la mesa de trabajo de su equipo de laboratorio e inmediatamente diríjase a ella. d) En su mesa, localice tomas de corriente, desagües, tuberías y sitios donde puede trabajar. e) Ubique la posición de su mesa de trabajo, respecto de la mesa de la campana, instalaciones de seguridad, extintores, zonas de seguridad y rutas de evacuación. f) Con base en la explicación recibida, identifique el uso de cada una de las tuberías que encuentre en su mesa de trabajo y márquelas con masking tape. Espere a que su profesor confirme que su etiquetado es correcto. g) Localice la posición de las válvulas de seguridad de cada tubería. Evidencia de Aprendizaje 1. Elabore un esquema de su mesa señalando la posición de las tomas de corriente, desagües y válvulas de flujo. 2. En el esquema de la mesa de trabajo que elaboró en el inciso anterior, marque la posición de las válvulas de seguridad. 3. Elabore un esquema del laboratorio e indique en él, las zonas de seguridad, la posición del equipo de seguridad y marque la ruta de evacuación desde su mesa. El vale de material de laboratorio Desarrollo a) Localice el vale de material de laboratorio en la charola que se encuentra en su mesa de trabajo. Este es un documento en el que se enlista el material que se le confía para la realización de cada práctica. Tomando en cuenta la lista, identifique y revise cuidadosamente, cada una de las piezas que se le proporcionaron, indicando en el vale, cualquier defecto que encuentre. Por ningún motivo se deberá remover la charola de la mesa de trabajo. b) Rotule cada pieza identificada con una etiqueta de masking tape. Reúna en la charola el material de nombre y/o empleo desconocidos, o de cuyo estado tenga duda, y pregúntelo a su profesor. Espere a que su profesor compruebe que ha marcado correctamente todo el material. c) Una vez revisado todo el material, complete la información que se solicita en el vale (fecha, grupo, equipo, responsables, etc.) y entréguelo al personal técnico de laboratorio. En las prácticas siguientes, el vale se debe entregar al inicio de cada sesión, antes de empezar a trabajar, con una tolerancia de 10 minutos. d) Al término de cada práctica, los miembros de equipo ordenarán el material, como lo recibieron, limpiarán la mesa y solicitarán al personal técnico que revise el material en su mesa de trabajo y les devuelva el vale correspondiente. mlvm / maov / 1 Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I Evidencia de Aprendizaje 1. Escribe para qué se emplea cada una de las siguientes piezas de material de laboratorio: Tubo de ensayo, Pipeta, Bureta, Probeta, Mortero, Válvula de Bunsen, Vaso de precipitados, Matraz aforado, Matraz Erlenmeyer, Reóforos, Cristalizador, Tubos de centrífuga clínica, Tubos Falcon y Pipeta volumétrica Manejo del mechero Desarrollo a) Nunca use guantes de látex o polietileno cuando trabaje con el mechero. No encienda el mechero hasta que su profesor se lo indique. b) Si es necesario, conecte el tubo de hule del mechero a la llave de gas, la llave debe estar completamente cerrada, con la manija en posición transversal respecto de la salida del gas. Recuerde que la tubería de gas es de color amarillo. c) Asegúrese que el tornillo de control de flujo de gas esté abierto aproximadamente a la mitad de su capacidad total. El flujo de gas se disminuye girando el tornillo en el sentido de las manecillas del reloj y se aumenta en sentido contrario. d) Abra la llave de gas, colocando la manija en un ángulo aproximado de 45 grados respecto de la salida del gas. Escuchará un ligero zumbido provocado por el flujo del gas. e) Encienda el mechero, aproximando la flama de un cerillo al borde de la parte superior del mechero, no coloque la flama del cerillo en el centro del mechero porque el flujo de gas la apagaría. Tenga cuidado de no acercar su rostro ni objetos inflamables al mechero al momento de encenderlo, ni mientras esté encendido. f) Ajuste la cantidad de aire que entra, usando el anillo de control de flujo de aire, para cambiar el tamaño de las aberturas de la parte inferior, hasta que la flama tenga una zona central de color azul claro, rodeada de otra de color azul oscuro o violeta, la parte más caliente de la flama se encuentra en la punta de la zona azul claro interna. Cuando la combustión es incompleta, por falta de oxígeno, la flama tiene color amarillo. Evidencia de Aprendizaje 1. Elabore un esquema del mechero que tiene en su mesa de trabajo y marque la posición del tornillo de control de flujo de gas, el anillo de control de flujo de aire y la entrada del gas. 2. Elabore un esquema que ilustre la forma correcta de encender el mechero. Como calentar un líquido en un tubo de ensayo Desarrollo a) En este ejercicio todos los miembros del equipo debe usar mascarilla de protección. b) Llene su tubo de ensayo, aproximadamente hasta el 20% de su capacidad, con agua de la llave y sujételo con las pinzas para tubo de ensayo. Si es necesario, quítese los guantes de látex antes de iniciar el calentamiento. c) Coloque el tubo sobre la flama del mechero, en posición inclinada, aproximadamente 70 grados, cuidando que la flama caliente la parte superior del líquido. Nunca caliente un tubo de ensayo en el fondo, o en posición vertical, porque se puede proyectar su contenido. d) Mueva el tubo cuidadosamente, sin sacarlo de la flama, para que todo el líquido se caliente de la manera más uniforme posible. e) Durante el calentamiento, dirija la boca del tubo hacia un lugar en que no se encuentre ninguna persona o material que se pueda dañar. Introducción al Laboratorio de Bioquímica Médica I mlvm / maov / 2 Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I f) Jamás mire directamente la boca de un tubo de ensayo que se está calentando, aunque esté fuera de la flama del mechero. g) Continúe el calentamiento hasta lograr que el agua hierva, sin proyectarse. h) Nunca caliente solventes orgánicos en tubo de ensayo directamente en la flama del mechero. Hágalo siempre en baño maría. i) Siempre que termine de usar el mechero apáguelo. Evidencia de Aprendizaje 1. Elabore un esquema que ilustre la forma correcta de calentar un líquido en un tubo de ensayo. 2. Elabore un esquema que ilustre la forma correcta de emplear las pinzas para tubo de ensayo. Preparación de un baño maría Material Reactivos Soporte universal Agua de la llave Anillo de hierro Rejilla de asbesto Mechero Vaso de precipitados de 600 mL Desarrollo a) Fije el anillo de hierro en el soporte universal para que quede a la altura de la parte más caliente de la llama del mechero. Coloque la rejilla de asbesto sobre el anillo. b) Llene el vaso de precipitados a la mitad, con agua de la llave y colóquelo sobre la rejilla de asbesto. c) Si es necesario, quítese los guantes de látex antes de encender el mechero. d) Coloque el mechero bajo la rejilla de asbesto y enciéndalo. Compruebe que la parte más caliente de la llama del mechero calienta la base de la rejilla de asbesto. De no ser así, apague el mechero y ajuste la altura del anillo de hierro. Tenga cuidado porque el anillo podría estar caliente. e) Cuando se usa el baño maría, conviene añadir al agua del baño trozos de papel blanco y limpio como “cuerpos de ebullición” para que los recipientes que se colocan en él no se maltraten. f) Ajusta el agua del baño a la temperatura que te indique tu profesor y mantenla así durante 5 minutos. Evidencia de Aprendizaje 1. Elabore un esquema que ilustre la forma correcta de montar el baño maría. 2. ¿Por qué se debe ajustar la altura del anillo de hierro? 3. ¿Por qué no se debe llenar el vaso completamente? 4. ¿Para qué se emplean los cuerpos de ebullición? Manejo de reactivos líquidos Desarrollo a) Cuando se miden cantidades pequeñas de reactivos líquidos, se usan pipetas graduadas o volumétricas. Para manejar con seguridad reactivos líquidos con pipeta, se usa siempre la prepipeta. b) Al abrir un frasco de reactivo, coloque el tapón sobre la mesa en posición invertida, para evitar contaminación. Introducción al Laboratorio de Bioquímica Médica I mlvm / maov / 3 Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I c) Vierta la cantidad necesaria de reactivo en un vaso e precipitados limpio y de ahí tome el reactivo. d) Para extraer el líquido utilice una pipeta o un gotero limpios. Nunca vierta reactivos directamente del frasco para evitar escurrimientos. e) Usando la pipeta de 10 mL, transfiera 5 mL de agua de un vaso de precipitados a un tubo de ensayo. Repita la maniobra hasta que pueda realizarla con seguridad. Evidencia de Aprendizaje 1. Empleando la técnica descrita mida el volumen de agua que pueden contener los utensilios que le indique su profesor. 2. Explique por escrito y claramente el uso correcto de la pre-pipeta. Desarrollo (continuación) f) Para manejar cantidades mayores de líquidos se usa la bureta. Para este ejercicio se necesita: Material Reactivos Soporte universal Agua de la llave Bureta Pinza para bureta Matraz erlenmeyer de 250 mL Vaso de precipitados de 150 mL g) Fije la pinza de bureta en el soporte universal a la altura apropiada para que sujete la bureta en la parte media. Tome en cuenta que el espacio debajo de la bureta debe ser suficiente para manejar con seguridad el matraz erlenmeyer de 250 mL. h) Sujete la bureta firmemente con la pinza. La graduación debe quedar hacia adelante, con la llave de la bureta del lado derecho. La llave de la bureta debe estar cerrada. i) Usando un vaso de precipitados, llene completamente la bureta con agua de la llave. No importa que rebase la graduación, pero tenga cuidado de que el agua no se derrame. Como precaución, por si hay derrames, coloque otro vaso de precipitados debajo de la bureta. j) Coloque el vaso de precipitados debajo de la bureta y usando la mano izquierda abra completamente la llave para que el agua salga con velocidad y arrastre todo el aire del cuerpo de la bureta y de la llave. Cuando salga todo el aire, cierre la llave, antes de que se vacíe completamente la bureta. k) Vuelva a llenar la bureta y ajuste el nivel superior a la graduación. l) El uso más frecuente de la bureta es la titulación, en la cual se añade el reactivo gota a gota. Usando el matraz erlenmeyer de 250 mL para recibir el agua, practique a abrir la llave de la bureta, siempre con la mano izquierda, hasta obtener velocidades de goteo constantes y a cerrarla cuando sea necesario. Es conveniente que al realizar esta maniobra utilice guantes de cirugía porque los reactivos que se usarán en las prácticas de laboratorio pueden causar daño al entrar en contacto con la piel. m) El otro uso de la bureta es para añadir cantidades medidas de reactivo. Coloque un vaso de precipitados debajo de la bureta y practique a vaciar la bureta, 5 mL cada vez. Recuerde que la llave se maneja únicamente con la mano izquierda. Nunca debe dejar que la bureta se vacíe completamente, pero si esto llegara a suceder, debe reiniciar el trabajo, en la forma como se indicó en los incisos i, j y k de este ejercicio. Introducción al Laboratorio de Bioquímica Médica I mlvm / maov / 4 Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I Evidencia de Aprendizaje 1. Elabore un esquema que ilustre la forma correcta de montar la bureta. 2. Identifique el tipo de aforo de la bureta utilizada. 3. Explique la forma correcta de leer el volumen en la bureta. 4. Explique por qué se maneja la llave de la bureta con la mano izquierda. Manejo de reactivos sólidos. Desarrollo a) Prepare una “charola de papel”, usando una hoja de papel limpio, si es posible encerado. La charola se prepara doblando el papel, aproximadamente a un centímetro de cada borde, y colocándolos en ángulo recto para formar una pared alrededor del papel. El tamaño de la charola depende de la cantidad de reactivo a pesar. b) Encienda la balanza y espere a que se estabilice la lectura, si no está en cero, ajústela usando el botón de tarar (el que está marcado con T) c) Coloque la charola de papel en el plato de la balanza. Cuando se estabilice la lectura, tare a cero la balanza. d) Abra el recipiente de reactivo y coloque la tapa sobre la mesa, boca arriba para evitar contaminación. e) Usando una espátula, saque el reactivo del recipiente y colóquelo sobre la charola de papel. Si se rebasa la cantidad deseada, regrese el exceso de reactivo a su recipiente, usando la espátula. Nunca regrese al recipiente original un reactivo que se derrame fuera de la charola de papel o sobre la mesa. f) Al terminar de pesar, cierre inmediatamente el frasco de reactivo para evitar que se hidrate y contamine. Evidencia de Aprendizaje 1. Usando la técnica descrita, pese la cantidad de Cloruro de Sodio (NaCl, sal de mesa) que le indique su profesor y colóquela en el sobre de papel que se le proporcione. Escriba en el sobre, el nombre y la cantidad de reactivo que contiene, número de equipo y grupo. Conserve la muestra para utilizarla en la siguiente práctica. 2. Pese las cantidades y sustancias que le indique su profesor. 3. Elabore un diagrama de la balanza, señalando la posición del botón de encendido y apagado, del botón de tara y el de registro (el marcado con R). 4. ¿Cuál es la función del botón de registro? Como tarar tubos para centrifugación. Desarrollo a) En este ejercicio se usará la balanza de dos platillos. b) Coloque las pesas de medición en la posición de cero. Asegúrese que la aguja o fiel de la balanza esté en posición cero. Si no lo está gire cuidadosamente las pesas de ajuste en el sentido que sea necesario, hasta lograr el equilibrio. c) Coloque un vaso de precipitados en cada platillo, cuidando que el más pesado quede en el platillo del lado izquierdo. d) Deslice las pesas de medición de la balanza, hasta lograr que el fiel vuelva a la posición de equilibrio. Introducción al Laboratorio de Bioquímica Médica I mlvm / maov / 5 Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I e) Coloque en cada frasco, una camisa de la centrífuga con un tubo de centrifuga que contenga 5 mL de agua de la llave. f) Si el fiel de la balanza sale de equilibrio, usando una pipeta, añada agua de la llave, entre la camisa y el tubo de ensayo más ligero, hasta lograr que el fiel de la balanza regrese al equilibrio. g) Coloque los tubos tarados en la centrifuga, en posiciones simétricas y póngala a funcionar a 2000 rpm durante 3 minuto. h) Al terminar la centrifugación limpie y seque perfectamente las camisas de la centrífuga y devuélvalas a su lugar. Evidencia de Aprendizaje 1. Elabore un esquema de la balanza de platillo, señalando la posición de las pesas de ajuste y las de medición. 2. Escriba la razón por la que es necesario tarar los tubos antes de centrifugar. Introducción al Laboratorio de Bioquímica Médica I mlvm / maov / 6 Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I PROPIEDADES DE LAS SOLUCIONES Medida de la presión osmótica. Método directo Material Reactivos Saco de colodión grande Sacarosa 6 M con rojo de Fenol Tubo capilar con tapón (ρ = 1.325 g / cm3) Vaso de precipitados de 500 mL Agua Soporte Universal Pinza para bureta Desarrollo a) El osmómetro que se encuentra en la mesa al frente del laboratorio, consiste en el cuerpo de una jeringa, cerrada con una membrana de colodión grande previamente preparado, conteniendo Sacarosa 6 M, teñida con rojo neutro. En la jeringa se fija un tubo capilar. El dispositivo se sumerge en un vaso de precipitados con agua. b) Marque el nivel inicial de la Sacarosa en el tubo capilar. c) Observe el nivel de la solución cada 10 minutos, durante 120 minutos, anotando la altura ascendida en cada intervalo en la tabla siguiente. Tiempo min 10 20 30 40 Altura cm Tiempo min 50 60 70 80 Altura cm Tiempo min 90 100 110 120 Altura cm Evidencia de Aprendizaje 1. ¿Cuándo debe detenerse la ósmosis? 2. ¿La presión en el osmómetro depende de la altura o del radio de la columna de solución? 3. Con los datos obtenidos, calcule la presión osmótica () a cada tiempo sabiendo que la densidad de la solución de Sacarosa es 1.088 g/mL y la aceleración de la gravedad es 9.81 m s -2. Anote los resultados en la tabla siguiente. Tiempo min 10 20 30 Pa Tiempo min 40 50 60 Pa Tiempo min 70 80 90 Pa Tiempo min 100 110 120 Pa 4. Dibuje la gráfica de presión osmótica en función del tiempo. Propiedades de las Soluciones mlvm / maov / 7 Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I Preparación de una solución de NaCl 2% p/v Material Matraz aforado de 50 o 25 mL Pipetas de 10, 5 y 1 mL Reactivos NaCl (cloruro de sodio) sólido pesado en la práctica anterior agua destilada Desarrollo a) Calcule el volumen de una solución de NaCl de concentración 2%, que se puede preparar con la cantidad de cloruro de sodio sólido que pesó en la sesión anterior, considerando que el reactivo tiene 100% de pureza. b) Anote a continuación los mL de solución de NaCl que preparará. gramos de NaCl ______________ g Volumen de solución __________ mL c) En un vaso de precipitados de volumen apropiado, disuelva el cloruro de sodio en una cantidad de agua destilada menor que el volumen final de solución y viértalo en un matraz aforado del volumen adecuado. d) Con el mismo vaso de precipitados llene el cuerpo del matraz aforado con agua destilada, sin llegar al cuello. Para llenar el matraz hasta la marca de aforo, utilice una pipeta de 5 ó 10 mL e) Guarde esta solución porque la utilizará en el experimento de Diálisis. Evidencia de Aprendizaje 1. Describa detalladamente los cálculos realizados para determinar el volumen de solución que preparó. 2. Suponiendo que la solución es exactamente 2%, calcule su concentración en: Molaridad Normalidad Osmolaridad mEq/mL mg/mL moles % Describa sus cálculos con todo detalle Diálisis Material Saco de colodión pequeño Pipeta 10 o 5 mL Vaso de precipitados de 500 mL hilo de algodón 12 tubos de ensayo Reactivos NaCl 2% preparado por su equipo Almidón 1% Solución de Lugol Solución de AgNO3 (nitrato de plata) agua destilada Desarrollo a) En este experimento se utilizará la solución de NaCl 2% que preparó su equipo. Propiedades de las Soluciones mlvm / maov / 8 Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I b) Humedezca un saco pequeño de colodión en agua destilada (mínimo 5 minutos) y ate un extremo con el hilo de algodón que se le proporcionará. c) Con las pipetas apropiadas, coloque 1 mL de NaCl 2% y 10 mL de Almidón 1% y ate cuidadosamente el otro extremo del saco d) Llene un vaso de precipitados de 500 mL con H2O destilada hasta 2/3 partes de su capacidad e) En un tubo de ensayo coloque 2 mL de NaCl al 2% y agréguele 2 gotas de AgNO3 (nitrato de plata) observe la reacción y rotule el tubo como testigo (+) de cloruros. f) En otro tubo coloque 2 mL de solución de almidón al 1% y 2 gotas de solución de Lugol, observe la reacción y rotule el tubo como testigo (+) de almidón respectivamente. g) En un tercer tubo de ensayo coloque 2 mL del agua contenida en el vaso de precipitados de 500 mL y añada 2 gotas de Lugol. En ausencia de almidón la solución se torna de color amarillo. Rotule el tubo como testigo (-) de almidón. h) En otro tubo coloque 2 mL del agua contenida en el vaso de precipitados de 500 mL y añada 2 gotas de AgNO3. Sin cloruros, la solución permanece translúcida. Rotule este tubo como testigo (-) de cloruros. i) Coloque el saco con la soluciones de Almidón y NaCl en el vaso de precipitados. j) Después de introducir el saco, determine la presencia de Almidón y/o Clˉ en el agua destilada cada 20 minutos, como hizo en los incisos e y f, hasta completar 2 horas. k) Los testigos (-) para Almidón y Cloruros, serán las muestras tomadas a tiempo cero, antes de introducir el saco. l) No deseche los tubos, para comparar los resultados a los diferentes tiempos. Evidencia de Aprendizaje 1. Anote los resultados en la tabla siguiente. Tiempo/min 0 Testigo (-) 30 Clˉ 60 90 120 Testigo (+) Almidón 2. Escriba si al final dializaron el Almidón y los Cloruros a través de la membrana. 3. Anote las reacciones químicas que usaron para detectar Almidón y Cloruros. Preparación de una solución de CH3COOH 0.1M Material Matraz aforado de 100 mL Pipetas de 10,5 y 1 mL Reactivos CH3COOH (ácido acético) grado reactivo Agua destilada Desarrollo a) Calcule el volumen de una solución de CH3COOH comercial, con PM = 60, pureza = 99.7% y densidad a 20° C de 1.06 g/mL, que necesita para preparar 50 mL de solución 0.1M de CH3COOH Propiedades de las Soluciones mlvm / maov / 9 Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I b) Anote el volumen de CH3COOH comercial, que usará para preparar la solución. mL de CH3COOH = __________ mL c) Usando una pipeta, mida el volumen calculado de ácido acético y colóquelo en un matraz aforado de 50 mL limpio y seco. Mida la cantidad con la mayor precisión y cuidado posibles. d) Con un vaso de precipitados de 100 mL llene el cuerpo del matraz aforado con agua destilada, sin llegar al cuello. Para llenar el matraz hasta la marca de aforo de 50 mL, utilice una pipeta de 5 ó 10 mL. e) Rotule y guarde esta solución porque la utilizará en el experimento de Titulación. Evidencia de Aprendizaje 1. Describa detalladamente los cálculos que realizó para conocer el volumen de CH 3COOH comercial que utilizó para preparar los 50 mL de solución 0.1M del ácido. 2. Suponiendo que la solución es exactamente 0.1M calcule su concentración en: % (p/v) Normalidad Osmolaridad mmoles/L mg/L mEq% Describa sus cálculos con todo detalle. Determinación de Concentración por Titulación Material Matraz Erlenmeyer de 250 mL Pipeta volumétrica de 10 ó 5 mL Bureta Pinza para bureta Soporte universal Vasos de precipitados 150 mL Reactivos CH3COOH 0.1M preparado por su equipo indicador de Fenolftaleína NaOH (hidróxido de sodio) 0.2N agua destilada Desarrollo a) En este experimento se utilizará como problema la solución de CH3COOH 0.1 M que preparó su equipo. b) En un matraz Erlenmeyer de 250 mL coloque 10 mL de la solución de CH3COOH 0.1 M, usando una pipeta volumétrica. c) Añada 3 gotas de Fenolftaleína. d) Monte la Bureta en el soporte universal, usando la pinza para bureta. e) Usando un vaso de precipitados de 150 mL, llene la bureta con NaOH (hidróxido de sodio) 0.2 N. Recuerde que no debe dejar burbujas de aire dentro de la bureta. f) Titule dejando caer gota a gota el hidróxido dentro del matraz ErlenmePropiedades de las Soluciones mlvm / maov / 10 Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I yer, hasta que la solución adquiera un ligero color rosa, que persista por 30 segundos. Anote el volumen hasta ese momento y añada una gota más, la solución debe tomar un color rosa intenso. g) Anote los mL de NaOH 0.2N que gastó para neutralizar los 10 mL de CH3COOH. Resultado = _______________ mL de NaOH 0.2N Evidencia de Aprendizaje 1. Si la solución que preparó es exactamente 0.1M ¿Qué volumen de NaOH 0.2N debería gastar? 2. Suponiendo que la solución de NaOH es exactamente 0.2N, calcule la verdadera Molaridad del CH3COOH problema. 3. Escriba la reacción que se efectuó durante la titulación. Difusión en líquidos Material Probeta de 100 mL Mechero Bunsen Reactivos Azul de Metileno en polvo agua Desarrollo a) Llene casi completamente una probeta de 100 mL con agua de la llave. b) Espolvoree una pequeña cantidad de azul de metileno sobre la superficie y observe. Anote sus observaciones. c) Caliente ligeramente un punto de la probeta y observe lo que sucede. Anote sus observaciones. d) Observe el descenso del colorante a través de la columna de agua, anote si es uniforme o no antes y después de calentar. Evidencia de Aprendizaje 1. Escriba los conceptos de disolución, difusión y convección. 2. Elabore una tabla donde resuma 3 características que permitan diferenciar los tres fenómenos anteriores Propiedades de las Soluciones mlvm / maov / 11 Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I SOLUCIONES ELECTROLÍTICAS y pH Disociación de una sal y Electrolisis del agua Material Cristalizador Puente de Wheatstone Electrodos de carbón matraz de 500 mL Probeta de 50 mL Reactivos NaCl 10% (50 mL) Azul de Bromofenol agua destilada Desarrollo a) Coloque el cristalizador sobre un fondo blanco y agregue 50 mL de solución de NaCl 10%. b) Introduzca en la solución los electrodos de carbón conectados a una fuente de energía como el Puente de Wheatstone (ver esquema) o una pila de 6 o 9 V. c) Observe si se desprende o no, gas en los electrodos y anote en cual. d) En el espacio entre los electrodos, agregue 5 gotas de Azul de Bromofenol como indicador. Este indicador es amarillo a pH por debajo de 3 y azul o púrpura a pH mayor e) Observe los cambios de coloración cerca de los electrodos y anótelos. Evidencia de Aprendizaje 1. Elabore un esquema que ilustre este experimento. 2. Anote a que se deben los cambios de color del indicador, usando la fórmula del mismo. 3. Escriba las reacciones químicas que se llevan a cabo en cada electrodo. Conducción de corriente en electrolitos fuertes y débiles Material Vaso de precipitados de 100 mL Caimanes con alambre (Reóforos) Puente de Wheatstone Electrodos de carbón Soluciones Electrolíticas y pH Reactivos Solución de HCl (ácido clorhídrico) 0.5 M Solución de CH3COOH (ácido acético) 0.5 M mlvm / maov / 12 Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I Desarrollo a) Coloque la solución de CH3COOH 0.5 M que se encuentra en su mesa, en un vaso de precipitados, en cantidad suficiente para cubrir la tercera parte de los electrodos. b) Introduzca los electrodos conectados a una fuente de energía (ver esquema). c) Registre la intensidad de la luz emitida por el foco d) Aproxime los electrodos, sin que se toquen y observe la intensidad de la luz emitida. e) Devuelva la solución de CH3COOH 0.5 M al frasco correspondiente. Evidencia de Aprendizaje 1. Escriba qué relación existe entre la intensidad luminosa y la distancia que separa los electrodos, y explique por qué. 2. Escriba la reacción de disociación del CH3COOH. Desarrollo (continuación) f) Lave bien el material y repita el experimento, incisos a, b, c y d, usando HCl 0.5 M. g) Compare la intensidad de la luz emitida al usar esta solución respecto del CH3COOH. Anote sus observaciones. h) Devuelva la solución de HCl 0.5 M al frasco correspondiente. Evidencia de Aprendizaje (continuación) 3. Anote a que se deben las diferencias en la intensidad de la luz emitida. 4. Escriba la reacción de disociación del HCl. Diferencia de conductividad entre electrolitos débiles y fuertes Material Pipetas de 10 mL Medidor de Conductividad Soluciones Electrolíticas y pH Reactivos Solución de HCl 0.5 M Solución de CH3COOH 0.5M mlvm / maov / 13 Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I Desarrollo a) Siguiendo las instrucciones del Apéndice III, determine la resistencia de las soluciones de HCl 0.5 M y CH3COOH 0.5 M. usando el puente de Wheatstone b) Cuando termine de usar cada solución devuélvala al frasco correspondiente. Evidencia de Aprendizaje 1. Calcule la conductividad de cada solución. 2. Compare los valores de conductividad y concluya respecto de la fuerza de cada electrolito. 3. Explique si los resultados de este experimento son congruentes con los del experimento anterior. Preparación de soluciones de pH conocido con electrolitos fuertes y débiles. Material Matraz aforado de 50 y 100 mL vaso de precipitados de 100 mL Pipetas de 1 y 10 mL Reactivos CH3COOH grado reactivo HCl grado reactivo H2O destilada Desarrollo a) Empleando la fórmula para ácidos fuertes, calcule la concentración de soluciones de HCl de pH 1, 1.3, 1.6 y 2.1 b) Calcule los volúmenes de HCl con 37% de pureza, densidad = 1.18 g/mL y peso molecular de 36.5, necesarios para preparar 50 mL de cada una de las soluciones de pH conocido calculadas en el inciso anterior (a). c) Empleando la fórmula para ácidos débiles, calcule la concentración de soluciones de CH 3COOH de pH 2.87, 3.02, 3.17 y 3.42. d) Calcule los volúmenes de CH3COOH con 99.7% de pureza, densidad = 1.06 g/mL, pseo molecular 60 y pKa = 4.74, necesarios para preparar 100 mL de cada una de las cinco soluciones de pH conocido calculadas en el inciso anterior (c). e) Prepare las soluciones de HCl y CH3COOH que le indique su profesor. f) Prepare 50 mL de una dilución 1:10 de cada ácido preparado. g) Guarde todas las soluciones preparadas para usarlas en el experimento siguiente. Evidencia de Aprendizaje 1. Describa con todo detalle los cálculos realizados para preparar cada solución. 2. Explique porqué se le asignaron ese par de soluciones para preparar. Acidez Verdadera y Acidez de Titulación Material Matraz Erlenmeyer de 250 mL Bureta Soluciones Electrolíticas y pH Reactivos Solución de NaOH 0.1N Soluciones de HCl preparadas por su equipo Soluciones de CH3COOH preparadas por su equipo Fenolftaleína mlvm / maov / 14 Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I Desarrollo a) Mida el pH de cada una de las solución preparadas, por el método potenciométrico y colorimétrico b) Mida exactamente 10 mL de la primera solución de CH3COOH, preparada en el experimento anterior y colóquelos en un matraz Erlenmeyer de 250 mL. c) Añada 3 gotas de Fenolftaleína y titule la muestra con NaOH 0.1N. d) Mida exactamente 10 mL de la primera solución de HCl, preparada en el experimento anterior y colóquelos en un matraz Erlenmeyer de 250 mL. e) Añada 3 gotas de Fenolftaleína y titule la muestra con NaOH 0.1N. f) Repita las titulaciones con las soluciones diluidas de HCl y CH3COOH. g) Anote sus resultados en el cuadro siguiente. Evidencia de Aprendizaje 1. Escriba sus resultados en la tabla siguiente. pH Solución Teórico Potenciómetro CH3COOH M Gasto de Colorimétrico NaOH 0.1N Teórica Real CH3COOH 1:10 HCl HCl 1:10 2. Describa los conceptos de acidez de titulación o total y acidez verdadera. 3. Explique sus resultados experimentales, tomando como base los conceptos anteriores. Soluciones Electrolíticas y pH mlvm / maov / 15 Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I SOLUCIONES REGULADORAS Poder Regulador Material Pipeta de 10 ó 5 mL Pipeta de 1 mL Matraz aforado de 50 mL Matraz Erlenmeyer de 250 mL Bureta Pinza para bureta Soporte universal Reactivos KH2PO4 (fosfato de potasio monobásico) 0.01 M y 0.1M Na2HPO4 (fosfato de sodio dibásico) 0.01 M y 0.1M HCl 0.1N NaOH 0.1N Verde de Bromocresol Azul de Timol Desarrollo a) Calcule los volúmenes de KH2PO4 0.01M y Na2HPO4 0.01M necesarios para preparar 50 mL de soluciones amortiguadoras con pH de: 6.6, 7.2 y 7.8. El pKa del par conjugado es de 7.2. b) Calcule los volúmenes de KH2PO4 0.1M y Na2HPO4 0.1M necesarios para preparar 50 mL de soluciones amortiguadoras con pH de: 6.6, 7.2 y 7.8. El pKa del par conjugado es de 7.2. c) Tomando como base el resultado de sus cálculos, prepare la solución que le indique su profesor y compruebe el valor de pH con el potenciómetro y colorimétricamente. d) En un matraz Erlenmeyer de 250 ml coloque 10 mL de la Solución que preparó y añada 3 gotas de Azul de Timol. e) Titule la solución del matraz utilizando NaOH 0.1N, hasta que el indicador vire a Azul. f) En un matraz Erlenmeyer de 250 ml coloque 10 mL de la Solución que preparó y añada 3 gotas de Azul de Timol. g) Titule la solución del matraz utilizando HCl 0.1N, hasta que el indicador vire a Rojo. Evidencia de Aprendizaje 1. Describa con todo detalle los cálculos que realizó para prepara la solución. 2. Describa el procedimiento de preparación de la solución. 3. En la tabla siguiente anote el gasto de titulante. Titulante Gasto / mL NaOH 0.1N HCl 0.1N 4. Compare sus resultados con los del resto del grupo y explíquelos con base en el poder regulador de su solución. Comportamiento ácido-base de Glicina Material 2 vasos de precipitados de 100 mL Pipeta de 10 mL Probeta de 50 mL Agitador magnético Potenciómetro Bureta Soluciones Reguladoras Reactivos Glicina 0.1N NaOH 0.1N HCl 0.1N mlvm / maov / 16 Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I Desarrollo a) En un vaso de precipitados de 100 mL, coloque 30 mL de Glicina 0.1N. b) Introduzca en la solución una barra magnética y colóquela sobre el agitador. c) Determine el pH de la muestra con el potenciómetro. (ver esquema ) d) Titule añadiendo los volúmenes de HCl 0.1N que se indican en la tabla siguiente. e) Registre sus resultados en la tabla siguiente. mL agregados de HCl 0.1N Añadido Acumulado 0 0 0.5 0.5 0.5 1 1 2 2 4 3 7 4 11 pH de la solución de Glicina mL agregados de HCl 0.1N Añadido Acumulado 4 15 5 20 5 25 2 27 1 28 1 29 1 30 pH de la solución de Glicina f) En un vaso de precipitados limpio de 100 mL, coloque 30 mL de Glicina 0.1N. g) Introduzca en la solución una barra magnética y colóquela sobre el agitador. h) Determine el pH de la muestra con el potenciómetro. i) Titule añadiendo los volúmenes de NaOH 0.1N que se indican en la tabla siguiente. j) Registre sus resultados en la tabla siguiente. mL agregados de NaOH 0.1N Añadido Acumulado 0 0.5 0.5 1 2 3 4 0 0.5 1 2 4 7 11 pH de la solución de Glicina mL agregados de NaOH 0.1N Añadido Acumulado 4 5 5 2 1 1 1 pH de la solución de Glicina 15 20 25 27 28 29 30 Evidencia de Aprendizaje 1. Elabore la gráfica de pH en función del volumen acumulado de HCl y NaOH. 2. En la curva de titulación, calcule los pKa de los grupos amino y carboxilo. Soluciones Reguladoras mlvm / maov / 17 Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I 3. Compare los pKa obtenidos en la curva, con los valores teóricos para Glicina y calcule el punto isoeléctrico real y experimental. Soluciones Reguladoras mlvm / maov / 18 Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I PROPIEDADES DE PROTEÍNAS Determinación del punto isoeléctrico de la Caseína Material 10 tubos de ensayo Pipetas de 10 mL Pipetas de 5 mL Pipetas de 1 mL Reactivos Caseína 5% en CH3COONa 0.1N CH3COOH 1N CH3COOH 0.1N CH3COOH 0.01N H2O Destilada Desarrollo a) Preparar una serie de 10 tubos de ensayo, con las soluciones que se indican en la tabla de la página siguiente. Tubo Solución 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 mL de Caseína 5% en CH3COONa 0.1N 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 mL de H2O Destilada 8.4 7.8 8.8 8.6 7.6 6.2 3.4 1.0 7.0 9.0 mL de CH3COOH 1N 2 mL de CH3COOH 0.1N mL de CH3COOH 0.01N 0.2 0.6 0.4 1.4 2.8 5.6 8.0 1.2 pH Teórico Observación a 15 min. Observación a 30 min. b) Mezcle completamente el contenido de cada tubo. c) Observe el grado de turbidez o la precipitación que se produce en cada tubo inmediatamente después de prepararlo y transcurridos 15' y 30', anotando en la tabla con cruces. d) Si no se observa diferencia en el grado de turbidez de los tubos, coloque las soluciones en tubos de centrífuga y centrifugue 10 minutos a 1000 r.p.m. y anote las diferencias de tamaño del precipitado de cada uno de los tubos. Evidencia de Aprendizaje 1. Calcule el pH teórico de cada tubo y anótelo en la tabla, marcando el punto Isoeléctrico de la Caseína. Propiedades de Proteínas mlvm / maov / 19 Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I Reacción de Ninhidrina. Material Papel Whatman #1 Reactivos Ninhidrina en Butanol al 0.1% Glicina 2% Peptona 2% Gelatina 2% Caseína 2% Albúmina 2% agua destilada Desarrollo a) ¡PRECAUCIÓN! Use guantes o pinzas para manipular el papel. b) Numere 7 rectángulos de papel filtro Whatman # 1 y coloque 3 gotas de: (1) H2O, como testigo negativo, (2) Prolina, (3) Peptona, (4) Gelatina, (5) Caseína, (6) Albúmina y (7) la sustancia problema. Todos al 2%. c) Con lápiz, anote debajo de cada muestra el nombre del compuesto y añádale una gota de solución de Ninhidrina en Butanol al 0.1%. d) Coloque las muestras en el horno a 110 °C durante 5 min, cuidando que no disminuya la temperatura. Evidencia de Aprendizaje 1. Anote la intensidad de la coloración obtenida, en la tabla resumen que se encuentra al final del capítulo. 2. Escriba la reacción química efectuada. 3. Escriba los nombres de otras sustancias que dan positiva la reacción de Ninhidrina, además de proteínas, péptidos y aminoácidos. Reacción del Biuret Material 6 tubos de ensayo Pipetas de 5 mL Reactivos CuSO4 (sulfato de cobre)1% NaOH 10% Peptona 2% Gelatina 2% Caseína 2% Albúmina 2% agua destilada Desarrollo a) Numere 6 tubos de ensaye y agregue 2 mL de: (1) H2O como testigo negativo, (2) Peptona, (3) Gelatina, (4) Caseína, (5) Albúmina y (6) la sustancia problema. Todos al 2%. b) Añada a cada tubo, 2 mL de solución NaOH al 10%. ¡¡¡PRECAUCIÓN!!! Propiedades de Proteínas mlvm / maov / 20 Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I c) Añada 3 gotas de solución de CuSO4 al 1%, a cada tubo. d) Mezcle completamente el contenido de los tubos y déjelos reaccionar en reposo. La aparición de una coloración violeta o rosa, máximo en 20 minutos, se considera prueba positiva. La intensidad del color es proporcional al número de enlaces petídicos. Evidencia de Aprendizaje 1. Anote la intensidad de la coloración obtenida, en la tabla resumen que se encuentra al final del capítulo. 2. Escriba la reacción química efectuada. Reacción Xantoprotéica Material 6 tubos de ensayo Pipetas de 5 mL Reactivos HNO3 concentrado NH4OH (hidróxido de amonio) concentrado Peptona 2% Gelatina 2% Caseína 2% Albúmina 2% agua destilada Desarrollo a) Numere 6 tubos de ensaye y agregue 2 mL de: (1) H2O como testigo negativo, (2) Peptona, (3) Gelatina, (4) Caseína, (5) Albúmina y (6) la sustancia problema. Todos al 2%. b) ¡Con cuidado!, añada al tubo uno, 1 mL de HNO3 concentrado, mezcle completamente. c) Caliente ligeramente con precaución y observe si aparece una coloración amarilla. d) Deje enfriar la solución y añada, resbalando por la pared del tubo, lenta y cuidadosamente para estratificar, 15 gotas de NH4OH concentrado, para obtener alcalinidad, observe si en la interfase aparece un anillo de color naranja. e) Repita el experimento (incisos b, c y d) con el resto de los tubos. Evidencia de Aprendizaje 1. Anote sus resultados en la tabla resumen que se encuentra al final del capítulo. 2. ¿Se puede considerar esta reacción general para todas las proteínas? 3. Explique por qué se tiñe de amarillo la piel al contacto con el HNO 3. Reacción de Millon Material 6 tubos de ensayo Pipetas de 5 mL Propiedades de Proteínas Reactivos Reactivo de Millon Peptona 2% Gelatina 2% Caseína 2% Albúmina 2% agua destilada mlvm / maov / 21 Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I Desarrollo a) Numere 6 tubos de ensaye y agregue 2 mL de: (1) H2O como testigo negativo, (2) Peptona, (3) Gelatina, (4) Caseína, (5) Albúmina y (6) la sustancia problema. Todos al 2%. b) Añada 5 gotas del reactivo de Millon a cada tubo y mezcle completamente. c) Con sumo cuidado, caliente cada tubo hasta que empiece a hervir ¡¡¡PRECAUCIÓN!!!! d) La presencia de Tirosina se pone de manifiesto por la aparición de un precipitado blanco que por acción del calor se vuelve rojo. La presencia de sales, así como soluciones muy alcalinas puede interferir en esta reacción. Evidencia de Aprendizaje 1. Anote en que soluciones apareció el precipitado y su coloración, en la tabla resumen que se encuentra al final del capítulo. 2. Escriba la composición del reactivo de Millón. 3. Anote la reacción química que se llevó a cabo en este experimento. Reacción de aminoácidos azufrados. Material 6 tubos de ensayo Pipetas de 5 mL Vaso de Precipitados de 500 mL Reactivos NaOH 10% Pb(CH3COO)2 (acetato de plomo) Peptona 2% Gelatina 2% Caseína 2% Albúmina 2% agua destilada Desarrollo a) Numere 6 tubos de ensaye y agregue 2 mL de: (1) H2O como testigo negativo, (2) Peptona, (3) Gelatina, (4) Caseína, (5) Albúmina y (6) la sustancia problema. Todos al 2%. b) Añada a cada tubo 2 mL de solución de NaOH al 10% y caliéntelo ligeramente. ¡PRECAUCIÓN! c) Añada a todos los tubos, 0.5 mL de solución de Pb(CH3COO)2. d) Coloque los tubos en baño María a ebullición por 5 min. El oscurecimiento de la solución o la formación de un precipitado negro, indica la presencia de aminoácidos azufrados. Propiedades de Proteínas mlvm / maov / 22 Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I Evidencia de Aprendizaje 1. Anote sus resultados en la tabla resumen que se encuentra a continuación. 2. Escriba la reacción química que se ha efectuado. 3. Escriba algunas sustancias que pueden interferir en esta reacción Resumen de propiedades químicas de aminoácidos Solución Ninhidrina Biuret Xantoprotéica Millon Aa azufrados Glicina Peptona Gelatina Caseína Albúmina Problema Precipitación de proteínas por metales pesados Material 6 tubos de ensayo Pipetas de 5 mL Reactivos FeCl3 (cloruro férrico) 3% AgNO3 2% HgCl2 (cloruro mercúrico) 2% Pb(CH3COO)2 2% Peptona 2% Gelatina 2% Caseína 2% Albúmina 2% Desarrollo a) Prepare una serie de 6 tubos de ensaye numerados y agregue 2 mL de: (1) H2O como testigo negativo, (2) Peptona, (3) Gelatina, (4) Caseína, (5) Albúmina y (6) la sustancia problema. Todos al 2%. Esta será su serie testigo en este y los experimentos siguientes. b) Prepare otra serie de tubos igual a la del inciso anterior (a). A cada tubo de esta serie añádale 2 gotas de solución de FeCl3 al 3%. c) Observe y anote. A continuación añada a cada tubo exceso de FeCl 3 (5 gotas más) si no ocurre precipitación compruebe el pH. d) Repita los incisos b y c utilizando AgNO3, HgCl2 y Pb(CH3COO)2, todos al 2%. Evidencia de Aprendizaje 1. Anote sus resultados en la tabla resumen que se encuentra al final del capítulo. 2. ¿Qué efecto tiene el pH en la precipitación de las proteínas con metales pesados? 3. ¿Todos los metales pesados tienen el mismo efecto precipitante?, ¿Por qué? Propiedades de Proteínas mlvm / maov / 23 Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I Precipitación de proteínas por ácidos fuertes. Material 6 tubos de ensayo Pipetas de 5 mL Reactivos Cl3CCOOH (ácido tricloroacético) 5% Peptona 2% Gelatina 2% Caseína 2% Albúmina 2% Desarrollo a) Numere 6 tubos de ensaye y agregue 2 mL de: (1) H2O como testigo negativo, (2) Peptona, (3) Gelatina, (4) Caseína, (5) Albúmina y (6) la sustancia problema. Todos al 2%. Su testigo negativo será la serie preparada en el inciso a del experimento anterior. b) Añada 2 mL de Cl3CCOOH al 5%, a cada tubo. Evidencia de Aprendizaje 1. Anote sus resultados en la tabla resumen que se encuentra al final del capítulo. 2. Anote el mecanismo del efecto desnaturalizante del Cl 3CCOOH y, en general, de cualquier ácido. Precipitación por alcohol Material 6 tubos de ensayo Pipetas de 5 mL Reactivos Alcohol de 96° Peptona 2% Gelatina 2% Caseína 2% Albúmina 2% Desarrollo a) Numere 6 tubos de ensaye y agregue 2 mL de: (1) H2O como testigo negativo, (2) Peptona, (3) Gelatina, (4) Caseína, (5) Albúmina y (6) la sustancia problema. Todos al 2%. Su testigo negativo será la serie preparada en el inciso a del experimento de precipitación por metales pesados. b) A cada tubo, agregue resbalando cuidadosamente por la pared, 3 mL de alcohol de 96° para estratificar, y observe lo que ocurre en la interfase. Evidencia de Aprendizaje 1. Anote sus resultados en la tabla resumen que se encuentra a continuación. 2. Explique el efecto desnaturalizante del alcohol. Propiedades de Proteínas mlvm / maov / 24 Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I Resumen de Propiedades Fisicoquímicas de Proteínas Agente Solución Fe Hg Pb Ag CCl3COOH Alcohol Peptona Albúmina Gelatina Caseína Problema Propiedades de Proteínas mlvm / maov / 25 Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I CINÉTICA QUÍMICA Y CATÁLISIS Comprobación de la ley de acción de masas Material 1 vaso de precipitados de 500 mL 4 vasos de pp. de 100 mL Probeta de 100 mL Pipetas de 1 mL Reactivos NH4SCN (sulfocianuro de amonio) 0.2M FeCl3 0.2M en HCl 0.1N NH4Cl (cloruro de amonio) 3M H2O Destilada Desarrollo a) En un vaso de precipitados de 500 mL, coloque 100 mL de H2O destilada, más 1 mL de solución de NH4SCN 0.2M y 1 mL de solución de FeCl3 0.2M en HCl 0.1N, y agite vigorosamente hasta mezclar completamente. Se observará la aparición de un color rojo, debido a la formación de Sulfocianuro férrico (Fe(SCN)3). Esta será la mezcla reaccionante (M.R.) b) Numere cuatro vasos de pp. de 100 mL, y coloque en cada uno, 25 mL de la M.R. c) Agregue a cada vaso el volumen de la sustancia indicada en la tabla siguiente: vaso mL de FeCl3 0.2M 1 mL de NH4SCN 0.2M mL de NH4Cl 3M Color Solución M.R. (testigo) 2 0.5 0.5 3 1.0 1.0 4 5.0 Evidencia de Aprendizaje 1. Observe la intensidad de la coloración en cada vaso y anótela en la tabla. 2. Explique sus resultados, con base en la ley de Acción de Masas. 3. Para cada uno de los vasos, escriba la reacción química que se ha efectuado, y su dirección. Efecto de la concentración sobre la velocidad de una reacción química Material Matraz Erlenmeyer de 250 mL Pipetas de 10 mL 5 Vasos de precipitados de 150 mL Probeta de 100 mL Reactivos 0.25g de KI (yoduro de potasio) sólido H2SO4 1:6 solución de Almidón Na2S2O3 (tiosulfato de sodio) 0.02N H202 (peróxido de hidrógeno) 0.2 % H2O Destilada Desarrollo a) En un matraz Erlenmeyer de 250 mL, coloque 0.25 g de KI y añada 25 mL de solución de H 2SO4 1:6 (DE UNA BURETA DE 50 mL QUE USARA TODO EL GRUPO) Agite hasta disolución completa y agregue 25 mL de H2O destilada para completar 50 mL. Esta solución se denominará "solución de HI (ácido yodhídrico)" y se utilizará en este experimento y los dos siguientes. b) Prepare una serie de vasos de precipitados de 100mL que contengan las cantidades de reactivo que se indican en la tabla siguiente y mezcle completamente. Cinética Química y Catálisis mlvm / maov / 26 Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I Reactivo Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Solución HI (mL) 5 5 5 5 5 Na2S2O3 0.02N (mL) 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 Almidón (gotas) 5 5 5 5 5 Agua destilado (mL) 3 2.5 2 1.5 1 c) Midiendo con la mayor precisión posible, agregue a cada vaso la cantidad de peróxido de hidrógeno que se indican en la tabla siguiente y mezcle completamente. H2O2 0.2% (mL) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 0.5 1 1.5 2 2.5 d) Utilizando un cronómetro, mida el tiempo transcurrido desde que se inicia la adición del peróxido, hasta que en la solución aparezca un color azul. Después de que aparezca el color en cada vaso, mida la temperatura de la mezcla. Evidencia de Aprendizaje 1. Escriba sus resultados en la tabla siguiente Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Tiempo / segundos Temperatura/°C 2. Escriba las reacciones químicas que se han efectuado. 3. Con los datos del experimento calcule la concentración mM y la velocidad de descomposición del peróxido en mM/s, en cada vaso. 4. Elabore la gráfica de velocidad de reacción en función de la concentración y determine el orden de reacción y la constante de velocidad específica. Influencia de la temperatura sobre la velocidad de una reacción química Material Pipetas de 10 mL Pipetas de 5 mL 5 vasos de precipitados de 150 mL Reactivos Solución "HI" del experimento anterior solución de Almidón Na2S2O3 (tiosulfato de sodio) 0.02N H202 0.2 % H2O Destilada Desarrollo a) Prepare una serie de cinco vasos de precipitados como se indica en la tabla del inciso (b) del experimento anterior. b) Pre-incube la mezcla de reacción durante 10 minutos en baño maría a la temperatura que le indique su profesor (baño de hielo, 40 ó 60 ºC). c) Midiendo con la mayor precisión posible, agregue a cada vaso, la cantidad de H2O2 que se indica la tabla del inciso (c) del experimento de Efecto de la concentración, sin sacar el vaso del baño maría. d) Utilizando un cronómetro, mida el tiempo transcurrido desde que se inicia la adición del peróxido, hasta que en la solución aparezca un color azul. Después de que aparezca el color en cada vaso, mida la temperatura del contenido del mismo. Cinética Química y Catálisis mlvm / maov / 27 Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I Evidencia de Aprendizaje 1. Escriba sus resultados en la tabla siguiente Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Tiempo / segundos Temperatura/°C 2. Con los datos del experimento calcule la concentración mM y la velocidad de descomposición del peróxido en mM/s, en cada vaso. 3. Elabore la gráfica de velocidad de reacción en función de la concentración y determine el orden de reacción y la constante de velocidad específica a la temperatura asignada. 4. Con los valores de velocidad específica de todo el grupo, elabore la grafica de velocidad específica en función de la Temperatura y determine la energía de activación. Efecto del pH sobre la velocidad de una reacción química. Material Pipetas de 10 mL Pipetas de 5 mL 5 vasos de precipitados de 150 mL Reactivos Solución "HI" del experimento anterior solución de Almidón Na2S2O3 0.02N H202 0.2 % H2O Destilada Desarrollo a) Prepare una serie de cinco vasos de precipitados como se indica en la tabla del inciso (b) del experimento de Efecto de la concentración. b) Añada a los vasos 5 mL de la solución de HCl que le indique su profesor (HCl 0.01N, HCl 0.1N ó HCl 1N). c) Midiendo con la mayor precisión posible, agregue a cada vaso la cantidad de H 2O2 que se indica la tabla del inciso (c) del experimento de descomposición del H2O2. d) Utilizando un cronómetro, mida el tiempo transcurrido desde que se inicia la adición del peróxido, hasta que en la solución aparezca un color azul. Después de que aparezca el color en cada vaso, mida el pH del contenido del mismo. Evidencia de Aprendizaje 1. Escriba sus resultados en la tabla siguiente. Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Tiempo / segundos 2. 3. 4. 5. pH Con los datos del experimento calcule la concentración mM y la velocidad de descomposición del peróxido en mM/s, en cada vaso. Elabore la gráfica de velocidad de reacción en función de la concentración y determine el orden de reacción y la constante de velocidad específica al pH asignado. Con los valores de velocidad específica de todo el grupo elabore la grafica de velocidad específica en función del pH. A partir de las reacciones químicas, explique el efecto del pH sobre la velocidad de esta reacción. Cinética Química y Catálisis mlvm / maov / 28 Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I Efecto de un catalizador inorgánico sobre la velocidad de hidrólisis de Sacarosa Material Pipetas de 10 mL Pipetas de 5 mL 5 tubos de ensayo Baño María a Ebullición Reactivos Sacarosa 0.05M H2SO4 1:6 NaOH 10% Solución de Fehling “A" Solución de Fehling "B" H2O Destilada Desarrollo a) Prepare cuatro tubos de ensayo, siguiendo las instrucciones de la tabla siguiente. Recuerde mezclar completamente el contenido de los tubos después de añadir cada reactivo. Tubo Sacarosa 0.05 M / mL 1 5 H2O destilada / mL 2 5 3 4 5 5 H2SO4 1:6 / gotas 6 6 b) Coloque todos los tubos en un Baño María a ebullición, durante 15 minutos. c) Neutralice el ácido de los tubos 1 y 3, añadiendo 12 gotas de NaOH 10%. (la normalidad aproximada de las soluciones es de 5.9 para el H2SO4 1:6 y 2.5 para el NaOH 10%). Compruebe que se ha neutralizado el ácido, usando papel indicador de pH. Sí es necesario, añada más gota de NaOH 10%. d) Añada a cada tubo 2 mL de Reactivo de Fehling “A” y 2 mL de Reactivo de Fehling “B” y mezcle completamente. e) Coloque todos los tubos en un Baño María a ebullición, durante 5 minutos. f) Esta prueba se considera positiva con la presencia de precipitado rojo de Cu2O (óxido cuproso). Evidencia de Aprendizaje 1. Anote sus resultados en la tabla siguiente. Tubo 1 2 3 4 Resultado 2. Anote la reacción de Fehling, sus resultados y conclusiones. 3. ¿Actúa el ácido sulfúrico como catalizador? ¿Por qué? Efecto de un catalizador biológico sobre la velocidad de hidrólisis de Sacarosa Material Pipetas de 10 mL Pipetas de 5 mL 5 tubos de ensayo Baño María a 40 °C Baño María a Ebullición Cinética Química y Catálisis Reactivos Sacarosa 0.1N Regulador de CH3COONa pH = 4.7 Solución de Invertasa Solución de Fehling “A" Solución de Fehling "B" H2O Destilada mlvm / maov / 29 Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I Desarrollo a) Prepare cuatro tubos de ensayo, siguiendo las instrucciones de la tabla siguiente. Recuerde mezclar completamente el contenido de los tubos después de añadir cada reactivo. Tubo Solución Sacarosa 0.1N / mL 1 2 5 5 H2O destilada / mL 3 4 5 5 Sol. reguladora, pH = 4.7 1 1 b) Preincubar todos los tubos en Baño María a 40° durante el tiempo que sea necesario para que la solución alcance la temperatura de 40°. c) Añadir a todos los tubos 0.2 mL de solución de Invertasa, mezclar completamente y volver a colocar los tubos en el Baño María. d) Incubar todos los tubos a 40° durante 15 minutos. e) Añada a todos los tubos 2 mL de Reactivo de Fehling “A” y 2 mL de Reactivo de Fehling “B” y mezcle completamente. f) Coloque todos los tubos en Baño María a ebullición, durante 5 minutos. g) Esta prueba se considera positiva con la presencia de precipitado rojo de óxido cuproso. Evidencia de Aprendizaje 1. Anote sus resultados en la siguiente tabla: Tubo 1 2 3 4 Resultado 2. Compare los resultados con los del experimento anterior, anote sus observaciones. Cinética Química y Catálisis mlvm / maov / 30 Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I CINÉTICA ENZIMÁTICA Preparación de la solución de Amilasa Material Matraz aforado de 100 mL Una Pipeta de 10 mL Vaso de precipitados de 100 mL Baño de hielo Reactivos Regulador de fosfatos pH 7 Amilasa en polvo Desarrollo a) En un vaso de precipitados, disuelva la enzima que le proporcionen, en la mínima cantidad posible de regulador de fosfatos de pH 7. Vacíe la solución a un matraz aforado de 100 mL y afore con solución reguladora. b) Conserve esta solución en baño de hielo. Esta es la solución de Enzima que se usará en todos los experimentos. Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática Material 7 tubos de ensaye 2 pipetas de 1 mL 2 pipetas de 5 mL 1 vaso de precipitados de 600 mL 2 tubos Klett Reactivos Solución de enzima Sustrato de almidón Regulador de fosfatos de pH 7 Ácido 3,5-dinitrosalicílico Agua destilada Desarrollo a) Prepare una serie de 7 tubos siguiendo las instrucciones de la tabla siguiente. Recuerde mezclar perfectamente los tubos al añadir cada reactivo. Tubo 4 0.5 1.5 Solución 1 t(-) 2 3 5 6 7 Sustrato de Almidón (8 mg/mL) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Solución reguladora de fosfatos 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 0.02M pH = 7 Agua destilada 3 3 3 3 3 3 3 Preincubar 5 minutos a: 20°C 0°C 20°C 40°C 50°C 60°C 92°C Ácido 3,5-dinitrosalicílico 1 b) El tubo 1 será el testigo negativo t(-) por lo que antes de colocarle la enzima, se le agrega 1 mL de ácido 3,5-dinitrosalicílico que actúa como inhibidor y como revelador de color. c) Añada a cada tubo 0.5 mL de la solución de Amilasa e incúbelo como se indica en la tabla siguiente. Solución Enzima Incubar 15 minutos a: Ácido 3,5-dinitrosalicílico Cinética Enzimática Tubo 1 t(-) 2 3 4 0.5 (b) 0.5 0.5 0.5 20°C 0°C 20°C 40°C 1 1 1 Baño María ebullición por 10 minutos 5 0.5 50°C 1 6 0.5 60°C 1 7 0.5 92°C 1 mlvm / maov / 31 Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I d) Después de los 10 minutos en baño María a ebullición, los tubos se enfrían al chorro de agua y se leen en el espectrofotómetro a 540 nm, empleando el tubo 1 como blanco para ajustar a cero. e) En caso de que las lecturas salgan de la escala, es necesario diluir la mezcla reaccionante 1 a 6 con agua destilada (1 mL de solución más 5 de agua), antes de leer. Evidencia de Aprendizaje 1. Convierta la Densidad óptica en concentración molar de azucares reductores [AR], usando la curva tipo que se le proporcionará. Sí es necesario, multiplique la concentración calculada por la dilución (por 6) 2. Escriba sus resultados en la tabla siguiente. Tubo 1 2 3 4 5 6 7 Densidad óptica 0 [AR] 0 3. Elabore la gráfica de [AR] en función de la Temperatura 4. En la gráfica obtenida, ubique la temperatura óptima de la enzima. Efecto del pH sobre la actividad enzimática. Material Reactivos 6 tubos de ensaye Solución de enzima 2 pipetas de 1 mL Sustrato de almidón 2 pipetas de 5 mL Regulador de fosfatos de pH 5, 6, 7, 8, 9 1 vaso de precipitados de 600 mL Ácido 3,5-dinitrosalicílico 2 tubos Klett Agua destilada Desarrollo a) Prepare una serie de 6 tubos, siguiendo las instrucciones de la tabla siguiente. Recuerde mezclar perfectamente los tubos al añadir cada reactivo. Tubo Solución 1 t(-) 2 3 4 5 6 Sustrato de Almidón (8 mg/mL) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 4 mL de Sol. Reg. de Fosfato 7 5 6 7 8 9 0.2M y NaCl 0.05M a pH de Preincubar 5 minutos a 40°C b) El tubo 1 será el testigo negativo t(-) por lo que antes de colocarle la enzima, se le agrega 1 mL de ácido 3,5 dinitrosalicílico que actúa como inhibidor y como revelador de color. c) Añada a cada tubo 0.5 mL de la solución de Amilasa e incúbelo como se indica en la tabla siguiente. Tubo Solución Ácido 3,5-dinitrosalicílico Enzima Ácido 3,5-dinitrosalicílico Cinética Enzimática 1 t(-) 2 3 1 0.5 (b) 0.5 0.5 Incubar 15 minutos a 40° C 1 1 Baño María ebullición por 10 minutos 4 5 6 0.5 0.5 0.5 1 1 1 mlvm / maov / 32 Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I d) Después de los 10 minutos en baño María a ebullición, los tubos se enfrían al chorro de agua y se leen en el espectrofotómetro a 540 nm, empleando el tubo 1 como blanco para ajustar a cero. e) En caso de que las lecturas salgan de la escala, es necesario diluir la mezcla reaccionante 1 a 6 con agua destilada (1 mL de solución más 5 de agua), antes de leer. Evidencia de Aprendizaje 1. Convierta la Densidad óptica en [AR], usando la curva tipo que se le proporcionará. Sí es necesario, multiplique la concentración calculada por la dilución (por 6) 2. Escriba sus resultados en la tabla siguiente. Tubo 1 2 3 4 5 6 Densidad óptica 0 [AR] 0 3. Elabore la gráfica de [AR] en función del pH 4. En la gráfica obtenida, ubique el pH óptimo de la enzima. Efecto de la concentración de sustrato sobre la actividad enzimática. Material Reactivos 9 tubos de ensaye Solución de enzima 2 pipetas de 1 mL Sustrato de almidón 2 pipetas de 10 mL Regulador de fosfatos de pH 7 1 vaso de precipitados de 600 mL Ácido 3,5-dinitrosalicílico 2 tubos Klett Agua destilada Desarrollo a) Prepare una serie de 9 tubos, siguiendo las instrucciones de la tabla siguiente. Recuerde mezclar perfectamente los tubos al añadir cada reactivo. Tubo Solución 1 t(-) 2 3 4 5 6 7 8 9 Sustrato de Almidón (8 mg/mL) 7.0 0.5 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 Sol. Reg. de Fosfato 0.02M. pH = 7 0.5 7.0 6.5 5.5 4.5 3.5 2.5 1.5 0.5 Preincubar 5 minutos a 40°C b) El tubo 1 será el testigo negativo t(-) por lo que antes de colocarle la enzima, se le agrega 1 mL de ácido 3,5 dinitrosalicílico que actúa como inhibidor y como revelador de color. c) Añada a cada tubo 0.5 mL de la solución de Amilasa e incúbelo como se indica en la tabla siguiente. Solución Ácido 3,5-dinitrosalicílico Enzima Tubo 4 5 1 t(-) 2 3 6 7 8 9 1 0.5 (b) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Incubar 15 minutos a 40°C Ácido 3,5-dinitrosalicílico 1 1 1 1 1 1 1 1 Baño María a ebullición por 10 minutos d) Después de los 10 minutos en baño María a ebullición, los tubos se enfrían al chorro de agua y se leen en el espectrofotómetro a 540 nm, empleando el tubo 1 como blanco para ajustar a ceCinética Enzimática mlvm / maov / 33 Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I ro. e) En caso de que las lecturas salgan de la escala, es necesario diluir la mezcla reaccionante 1 a 6 con agua destilada (1 mL de solución más 5 de agua), antes de leer. Evidencia de Aprendizaje 1. Convierta la Densidad óptica en [AR], usando la curva tipo que se le proporcionará. Sí es necesario, multiplique la concentración calculada por la dilución (por 6) 2. Escriba sus resultados en la tabla siguiente. Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Lectura Densidad óptica 0 [AR] 0 3. Elabore la gráfica de [AR] en función de [S] en mg/mL. 4. Determine los valores de KM y VMAX para el sistema, en estas condiciones. KM = ____________mg de Almidón/L VMAX = ______________[AR]/min Efecto de la concentración de enzima sobre la actividad enzimática. Material 6 tubos de ensaye 1 pipetas de 1 mL 2 pipetas de 5 mL 1 vaso de precipitados de 600 mL 2 tubos Klett Reactivos Solución de enzima Sustrato de almidón Regulador de fosfatos de pH 6.9 Ácido 3,5-dinitrosalicílico Agua destilada Desarrollo a) Prepare una serie de 6 tubos, siguiendo las instrucciones de la tabla siguiente. Recuerde mezclar perfectamente los tubos al añadir cada reactivo. Tubo Solución 1 t(-) 2 3 4 5 6 Sustrato de Almidón (8 mg/mL) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Sol.Reg. de Fosfato 0.02M pH=7 1 1 1 1 1 1 H2O destilada 3.4 4.9 4.8 4.6 4.2 3.4 Preincubar 5 minutos a 40°C b) El tubo 1 será el testigo negativo t(-) por lo que antes de colocarle la enzima, se le agrega 1 mL de ácido 3,5 dinitrosalicílico que actúa como inhibidor y como revelador de color. c) Añada a cada tubo 0.5 mL de la solución de Amilasa e incúbelo como se indica en la tabla siguiente. Tubo Solución Ácido 3,5-dinitrosalicílico Enzima 1 t(-) 2 3 4 5 6 1 1.6 (b) 0.1 0.2 0.4 0.8 1.6 Incubar 15 minutos a 40°C Ácido 3,5-dinitrosalicílico 1 1 1 1 1 Baño María a Ebullición por 10 minutos d) Después de los 10 minutos en baño María a ebullición, los tubos se enfrían al chorro de agua y Cinética Enzimática mlvm / maov / 34 Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I se leen en el espectrofotómetro a 540 nm, empleando el tubo 1 como blanco para ajustar a cero. e) En caso de que las lecturas salgan de la escala, es necesario diluir la mezcla reaccionante 1 a 6 con agua destilada (1 mL de solución más 5 de agua), antes de leer. Evidencia de Aprendizaje 1. Convierta la Densidad óptica en [AR], usando la curva tipo que se le proporcionará. Sí es necesario, multiplique la concentración calculada por la dilución (por 6) 2. Escriba sus resultados en la tabla siguiente. Tubo 1 2 3 4 5 6 Densidad óptica 0 [AR] 0 3. Trace la gráfica de [AR] en función de [E] en mg/mL 4. Calcule el Número de Recambio de la enzima, en el experimento. Cinética Enzimática mlvm / maov / 35 Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I PROPIEDADES DE GLÚCIDOS Determinación de la estructura cristalina de glúcidos. Material Microscopio Portaobjetos Reactivos Glucosa sólida Sacarosa sólida Almidón Celulosa Desarrollo a) Examine al microscopio muestras sólidas de los siguientes glúcidos: Glucosa, Sacarosa, Almidón, Celulosa y el resto que le sean proporcionados. Evidencia de Aprendizaje 1. Dibuje los esquemas correspondientes. Glucosa Sacarosa Almidón 2. Anote los glúcidos que presenten estructura cristalina. 3. ¿Qué relación existe entre la estructura de un glúcido y su peso molecular? Celulosa Formación de Osazonas Material 3 tubos de ensaye Pipetas de 5 mL Vaso de precipitados de 600 mL Reactivos Glúcido en sólido Clorhidrato de Fenilhidrazina Acetato de Sodio Agua destilada Desarrollo a) Coloque en un tubo de ensayo: 0.1 g de un carbohidrato, más 0.2 g. de clorhidrato de Fenilhidrazina, más 0.3 g de acetato de sodio cristalizado y 4 mL de agua. Agitar enérgicamente y tapar el tubo, con un tapón de papel, que permita la salida de vapor. b) Coloque el tubo en baño María a ebullición, agitando ocasionalmente. Observe el tiempo que tardan en aparecer los cristales. Sí en 20 minutos de calentamiento, no se han formado cristales, retire el tubo del Baño María y déjelo reposar en frío c) Anote el tiempo de cristalización y si fue en frío o en caliente. d) Observe al microscopio, los cristales de osazona preparados por TODOS los equipos del grupo. Propiedades de Glúcidos mlvm / maov / 36 Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I Evidencia de Aprendizaje 1. Dibuje esquemas de cada uno de los cristales. 2. Escriba la reacción que se efectúa. 3. Escriba la razón por la que Glucosa, Manosa y Fructosa forman la misma osazona. Reacción de Molisch-Udransky Material 8 tubos de ensaye Pipetas de 5 mL Reactivos Solución de Formaldehido Solución de Glucosa Solución de Fructosa Solución de Arabinosa Solución de Sacarosa Suspensión de Almidón Agua destilada Reactivo de Molisch-Udransky H2SO4 concentrado Desarrollo a) Numere 8 tubos de ensaye, y coloque, 3 mL de las soluciones siguientes: (1) H2O destilada, (2) Formaldehido, (3) Glucosa, (4) Fructuosa, (5), Arabinosa (6) Sacarosa, (7) Almidón y (8) la muestra problema. b) Añada a todos los tubos, 6 gotas de reactivo de Molisch-Udransky (solución de alfa-naftol al 5% en alcohol) Mezcle completamente. c) Posteriormente añada a todos los tubos, 1 mL de H2SO4 concentrado, inclinando el tubo y dejando resbalar cuidadosamente el ácido por las paredes para estratificar. La reacción es positiva si aparece en la interfase un anillo de color violeta (NO café) Evidencia de Aprendizaje 1. Anote las soluciones que den positiva la reacción, en la tabla al final del capítulo. 2. Escriba si esta reacción se puede usar para diferenciar un glúcido de otro y porqué. 3. Escriba la reacción química que se efectúa. Propiedades de Glúcidos mlvm / maov / 37 Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I Reacción de Fehling Material 8 tubos de ensaye Pipetas de 5 mL Vaso de precipitados de 600 mL Reactivos Solución de Formaldehido Solución de Glucosa Solución de Fructosa Solución de Arabinosa Solución de Sacarosa Suspensión de Almidón Solución A de Fehling Solución B de Fehling Agua destilada Desarrollo a) Numere 8 tubos de ensaye, y coloque en cada uno, 2 mL de solución A y 2 mL de la solución B del reactivo de Fehling. Mezcle completamente. b) Coloque en el tubo respectivo, 3 gotas de las soluciones de: (1) H2O destilada, (2) Formaldehido, (3) Glucosa, (4) Fructuosa, (5), Arabinosa (6) Sacarosa, (7) Almidón y (8) la muestra problema. c) Coloque los tubos en baño María a ebullición durante 3 minutos. d) Deje enfriar los tubos a temperatura ambiente (no enfriar con agua). la reacción es positiva si se forma un precipitado rojo ladrillo de Óxido cuproso (Cu2O) Evidencia de Aprendizaje 1. Anote sus resultados en la tabla al final del capítulo. 2. Anote porque algunos azúcares dan negativa la reacción. 3. Mencione 3 sustancias que usted considere puedan dar positiva la reacción de Fehling y no sean azúcares. 4. Escriba la reacción química que se efectúa. Reacción de Barfoed Material 6 tubos de ensaye Pipetas de 5 mL Vaso de precipitados de 600 mL Propiedades de Glúcidos Reactivos Solución de Glucosa Solución de Arabinosa Solución de Lactosa Solución de Maltosa Reactivo de Barfoed Agua destilada mlvm / maov / 38 Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I Desarrollo a) Numere 6 tubos de ensaye y agregue a cada uno 3 mL de reactivo de Barfoed. b) Coloque en los tubos, 1 mL de la solución correspondiente: (1) H2O destilada, (2) Glucosa, (3) Arabinosa, (4), Lactosa (5) Maltosa y (6) la muestra problema. c) Coloque los tubos en baño María a ebullición. Evidencia de Aprendizaje 1. En la tabla al final del capítulo, anote el tiempo que tarda en aparecer un precipitado color, rojo de óxido cuproso. 2. ¿Qué diferencia hay en el tiempo de reacción de Monosacáridos y Disacáridos? 3. Escriba la reacción química que se efectúa. Reacción de Bial Material 4 tubos de ensayo Pipetas de 5 mL Vaso de precipitados de 600 mL Reactivos Solución de Glucosa Solución de Arabinosa Reactivo de Bial Butanol Agua destilada Desarrollo a) Numere 4 tubos de ensayo, en cada uno coloque, 3 mL del reactivo de Bial. ¡¡¡ PRECAUCIÓN !!! b) Añada a los tubos, 0.2 mL de la solución correspondiente: (1) H2O destilada, (2) Glucosa, (3) Arabinosa y (4) la muestra problema. c) Caliente los tubos ligeramente sobre la flama del mechero; cuando se inicie la ebullición, inmediatamente retire el tubo de la flama. d) Diluya cada tubo con 10 mL de H2O destilada y agregue 2 mL de butanol. Agite enérgicamente los tubos y deje reposar. Mida el tiempo que tarda en aparecer el color. Evidencia de Aprendizaje 1. Anote sus resultados en la tabla al final del capítulo. 2. Escriba la reacción química que se efectúa. 3. ¿Cuál es la diferencia entre pentosas y hexosas? Reacción de Seliwanoff Material 4 tubos de ensaye Pipetas de 5 mL Vaso de precipitados de 600 mL Propiedades de Glúcidos Reactivos Solución de Glucosa Solución de Fructosa Reactivo de Seliwanoff Agua destilada mlvm / maov / 39 Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I Desarrollo a) Numere 4 tubos de ensaye. b) Coloque en los tubos 1 mL de la solución correspondiente: (1) H2O destilada, (2) Glucosa, (3) Fructosa y (4) la muestra problema. c) Agregue a cada tubo, 0.5 mL del reactivo de Seliwanoff. d) Caliente todos los tubos en baño María a ebullición, exactamente 60 segundos. Anote cual glúcido cambió de color en la tabla al final del capítulo. e) Continúe calentando durante 5 minutos y anote el tiempo al que se observa el cambio de color. Evidencia de Aprendizaje 1. Escriba sus resultados en la tabla al final del capítulo. 2. Escriba la reacción que se efectúa. 3. ¿Cuál es la diferencia entre cetosas y aldosas? Reacción de Lugol Material 4 tubos de ensaye Pipetas de 5 mL Vaso de precipitados de 600 mL Reactivos Solución de Almidón Solución de Glucógeno Lugol Agua destilada Desarrollo a) Numere 4 tubos de ensaye. b) Coloque en los tubos 2 mL de: (1) H2O destilada, (2) Almidón, (3) Glucógeno y (4) la muestra problema. c) Añada a cada tubo una gota de Lugol y mezcle, anote el color que se produce, en la tabla al final del capítulo. d) Caliente los tubos en Baño María a ebullición, y déjelos enfriar nuevamente observando lo que ocurre con la coloración durante el calentamiento y después de este. e) Escriba sus resultados en la tabla al final del capítulo. Evidencia de Aprendizaje 1. Escriba porqué el complejo almidón-yodo es termolábil. 2. Anote si la reacción del Lugol, es característica para cualquier polisacárido. Propiedades de Glúcidos mlvm / maov / 40 Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I Resumen de propiedades químicas de Glúcidos GLÚCIDO MolischUdransky Fehling Barfoed Bial Seliwanoff 1a 2a Lugol Formaldehido Glucosa Fructosa Arabinosa Sacarosa Lactosa Maltosa Almidón Glucógeno Problema Propiedades de Glúcidos mlvm / maov / 41 Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I OXIDACIONES BIOLÓGICAS Oxidación por pérdida de electrones Material 2 Matraces Erlenmeyer de 250 mL Tapón con válvula de Bunsen Pipeta 10 ó 5 mL Pipeta 1 mL 2 Cápsulas de porcelana 1 Probeta de 50 mL Reactivos 0.5 g de fibra de Fe H2SO4 al 10% agua destilada K3[Fe(CN)6] (ferricianuro de potasio) 0.5% KSCN (sulfocianuro de potasio) 0.5% KMnO4 0.1M Desarrollo a) Coloque en un matraz provisto de tapón con válvula de Bunsen abierta, 0.5 g de fibra de Fe y 15 mL de H2SO4 al 10%; mezcle enérgicamente para tratar de disolver el hierro (lo más posible), antes de calentar. b) Caliente a ebullición hasta la disolución del Fe, evitando que se evapore completamente la mezcla. Si es necesario añada más ácido. c) Enfríe al chorro del agua en la tarja; disuelva el residuo de FeSO 4 (sulfato ferroso), en 50 mL de agua destilada. d) Prueba para sales ferrosas. Se coloca en una cápsula de porcelana 1 mL de solución de FeSO4 y unas gotas de K3[Fe(CN)6] 0.5%. La obtención de una coloración ó precipitado azul indicará la presencia de sales ferrosas. e) Prueba para sales férricas. En otra cápsula de porcelana, coloque 1 mL de la solución de FeSO4 y unas gotas de solución de KSCN 0.5%, un color rojo es indicio de la presencia de sales férricas. f) Oxidación de la sal ferrosa a sal férrica. Coloque en un matraz Erlenmeyer 10 mL de la solución de FeSO4 y 3 mL de H2SO4 1 N, caliente a ebullición (evitando que se evapore) y en caliente, agregue gota a gota KMnO4 0.1M hasta que persista un color rosa muy pálido. g) Para comprobar el paso de sal ferrosa a sal férrica, repita las reacciones de los incisos (d) con K3[Fe(CN)6] 0.5% y (e) con KSCN 0.5%. Evidencia de Aprendizaje 1. Anote sus resultados en la siguiente tabla. Soluciones de: FeSO4 Fe2(SO4)3 Sales ferrosas Sales férricas 2. 3. 4. 5. ¿Qué gas es el que escapa durante la disolución del Hierro? Escriba las reacciones químicas, en cada caso. Si el KMnO4 es capaz de oxidar al FeSO4 ¿Qué compuesto se reduce? Escriba la reacción de oxido-reducción efectuada. Oxidaciones Biológicas mlvm / maov / 42 Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I Oxidación por deshidrogenación Material 7 tubos de ensaye 3 pipetas de 5 mL Reactivos azul de metileno diluido Na2S2O4 (hidrosulfito de sodio) vaselina H2O2 0.4% FeCl3 1% Desarrollo a) Prepare una serie de 7 tubos de ensaye y numérelos. b) Añada a cada uno, 5 mL de la solución de azul de metileno diluido. c) Agregue a cada uno de los tubos, gota a gota una solución recién preparada de Na2S2O4, no debe estar turbia; cuente el número de gotas necesario para decolorar completamente la solución de azul de metileno. d) El tubo 1 es el testigo en reposo; a temperatura ambiente mida el tiempo que tarda en recuperar el color azul e) Los tubos 2, 3, 4 y 5 se someten a los tratamientos indicados en la tabla siguiente. Mida el tiempo que tarda cada tubo en recuperar el color azul. Tubo 1 2 3 Tratamiento Reposo 0.5 mL vaselina estratificando 4 5 Baño de hielo Baño María a ebullición Agitación f) A los tubos 6 y 7, sin agitarlos y a temperatura ambiente, agregue los reactivos indicados en la tabla siguiente, contando el número de gotas necesario para que recuperen el color azul. TUBO 6 7 TRATAMIENTO H2O2 0.4% FeCl3 1%, Evidencia de Aprendizaje 1. Anote en la tabla, el tiempo necesario para que cada tubo recupere el color azul. Tubo 1 2 3 4 5 Tiempo/segundos 2. Anote en la tabla, el número de gotas necesario para recuperar el color de cada tubo TUBO 6 7 No de Gotas 3. Escriba la reacción química que se ha efectuado. Obtención de la fracción mitocondrial del tejido Material Estuche de disección Mortero Tubos de centrifuga Centrífuga pipetas de 5 y 10 mL Oxidaciones Biológicas Reactivos KCl (cloruro de potasio) 0.15 M Hielo mlvm / maov / 43 Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I Desarrollo a) Mate una rata, diseque el hígado y el corazón y manténgalos en baño de hielo hasta el momento de utilizarlo. b) Pese los órganos extraídos y manténgalo en baño de hielo. c) Trabajando en baño de hielo, fraccione la muestra finamente con tijeras y prepare un homogeneizado en un mortero FRIÓ, añadiendo 9 mL de KCl 0.15M FRIÓ por cada gramo de tejido. d) Centrifugue el homogeneizado en frío, a 500 rpm por 15 minutos. e) Decante el sobrenadante en un recipiente limpio y FRÍO, y deseche el residuo. f) Vuelva a centrifugar el sobrenadante, pero ahora a 3000 rpm por 15 minutos. g) De los tubos de centrífuga, decante el sobrenadante en un recipiente limpio y guarde el precipitado para usarlo más adelante. (inciso i) h) Etiquete el recipiente con sobrenadante como "SOBRENADANTE DE HÍGADO" o “SOBRENADANTE DE CORAZÓN” según corresponda y consérvelo en frío. i) El precipitado de la última centrifugación (inciso g) se suspende en un volumen de KCl 0.15M igual al del sobrenadante, y también se conserva en frío, etiquetado como "SUSPENSIÓN DE HÍGADO" o “SUSPENSIÓN DE CORAZÓN”, según corresponda. Determinación de la actividad de Deshidrogenasa Succínica Material 8 tubos de ensaye 5 pipetas de 5 mL Reactivos Azul de metileno 0.002 M Succinato de sodio 0.1 M Malonato de sodio 0.1 M Agua destilada Suspensión de Hígado o Corazón Sobrenadante de Hígado o Corazón a) Prepare una serie de 6 tubos de ensayo, como se indica en la tabla siguiente. TUBO Reactivos en mL 1 2 3 4 5 6 Azul de metileno 0.002M 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 Succinato de sodio 0.1M 0.0 0.5 0.5 0.0 0.5 0.5 Malonato de sodio 0.1M 0.0 0.0 0.5 0.0 0.0 0.5 H2O destilada 1.5 1.0 0.5 1.5 1.0 0.5 Mezclar bien y preincubar a 37° por 10 minutos Suspensión de Hígado o Corazón 0.5 0.5 0.5 0.0 0.0 0.0 Sobrenadante de Hígado o Corazón 0.0 0.0 0.0 0.5 0.5 0.5 b) Mezcle enérgicamente el contenido de cada tubo y añada, resbalando por la pared, 1 mL de vaselina para formar una capa sobre la solución. NO AGITE LOS TUBOS DESPUÉS DE AÑADIR LA VASELINA. c) Mantenga los tubos en incubación en Baño María a 37C, observe el color de los tubos al inicio del experimento y cada quince minutos, hasta completar una hora. Evidencia de Aprendizaje Oxidaciones Biológicas mlvm / maov / 44 Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I 1. Anote sus lecturas respecto a los cambios de coloración, en el cuadro siguiente. Tubo No Tiempo / minutos 1 2 3 4 5 6 0 15 30 60 2. Escriba en cuál de las preparaciones de hígado o corazón considera usted que se encuentran las mitocondrias y por qué. 3. Describa como actúa el Malonato de sodio. Determinación de la actividad de Citocromo-Oxidasa. MATERIAL 6 tubos de ensaye 4 pipetas 5 mL REACTIVOS alfa-Naftol 0.15 % en etanol al 10% dimetil-para-fenilendiamina 0.15 % KCN (cianuro de potasio) 0.01% Agua destilada Suspensión de Hígado o Corazón Sobrenadante de Hígado o Corazón Desarrollo a) Prepare una serie de 6 tubos de ensaye como se indica en la tabla siguiente: TUBO No Reactivos en mL 1 2 3 4 5 6 alfa-Naftol 0.15 % en Etanol 10% 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Dimetil-para-Fenilendiamina 0.15% 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 H2O destilada 1.0 2.0 0.5 1.0 2.0 0.5 Mezclar bien y preincubar a 37° por 10 minutos KCN 0.01% ((0.5 mL = 16 GOTAS) 0.5 ¡¡¡PELIGRO, VENENO NO PIPETEAR!!! Sobrenadante de Hígado o Corazón Suspensión de Hígado o Corazón 0.5 1 1 1 1 b) Mantenga los tubos en incubación en Baño María a 37C, agitándolos con frecuencia. c) Observe cualquier cambio de color, en el inicio, a los 15, 30 y 60 minutos. Evidencia de Aprendizaje 1. Anote sus observaciones en la tabla siguiente. Oxidaciones Biológicas mlvm / maov / 45 Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I Tubo No Tiempo / minutos 1 2 3 4 5 6 0 15 30 60 2. 3. 4. 5. Describa la reacción química que se ha efectuado. Escriba la razón por la que no se usó vaselina en este experimento. Escriba el nombre del inhibidor para cada enzima. Anote la fracción en que se encontraron las enzimas y cuál es la razón. Oxidaciones Biológicas mlvm / maov / 46 Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I PROPIEDADES DE LÍPIDOS Reacción de Hanus o Índice de yodo Material 5 Tubos de ensaye Pipetas de 5 mL Reactivos Cloroformo Aceite de algodón 10% en Cloroformo Aceite de cártamo10% en Cloroformo Monoestearil glicerol10% en Cloroformo Reactivo de Hanus Desarrollo a) Numere 5 tubos de ensaye, limpios y secos, prepare las mezclas que se describe en la tabla siguiente. Tubo No REACTIVO (mL) 1 (t-) Cloroformo 2 3 6 5 6 Aceite de algodón en cloroformo 6 Aceite de cártamo en cloroformo 6 Monoestearil-glicerol en cloroformo 6 Lípido problema en cloroformo 5 gotas de reactivo de Hanus 6 SI SI SI SI SI MEZCLAR ENÉRGICAMENTE Cubrir completamente con aluminio SI SI SI SI SI Evidencia de Aprendizaje 1. Anote en la tabla siguiente, cada 30 min (durante 2 horas) el grado de decoloración de cada tubo, con respecto al testigo negativo de cloroformo. TIEMPO / minutos Lípido 30 60 90 120 Lípido problema Aceite de Algodón Aceite de Cártamo Monoestearilglicerol 2. Escriba la razón por la que se utiliza como índice, el grado de decoloración de la solución. 3. Escriba la reacción química que se lleva a cabo. Propiedades de Lípidos mlvm / maov / 47 Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I Extracción de lípidos de Cerebro. Material 5 g de cerebro Mortero con mano 2 Tubos de centrífuga Pipeta Pasteur Pipetas de 5 mL Reactivos mezcla cloroformo-metanol-HCl (200:100:1) HCl 1N Desarrollo a) Triture perfectamente 5 g de cerebro, en un mortero con 15 mL de una mezcla de cloroformometanol-ácido clorhídrico (200:100:1) por 10 minutos. b) Agregue 3 mL de HCl 1N, mezcle completamente y centrifugue a 2000 r.p.m. durante 10 minutos. c) Separe la fase metanólica (transparente), decantándola con cuidado a un tubo de ensayo, rotule para uso posterior. d) La fase clorofórmica (café claro), la obtendrá, perforando con un hisopo de madera la capa intermedia (sedimento) y por el orificio que se forma, introducir cuidadosamente una pipeta Pasteur para tomar el líquido que se encuentra en la parte inferior del tubo y rotule para su uso posterior. Deseche el sedimento. Identificación de fosfolípidos de cerebro por cromatografía en capa fina. Material Placa de cromatografía Pipeta Pasteur Cámara de cromatografía Reactivos Cloroformo Fase clorofórmica Ninhidrina Desarrollo a) En un tubo de ensayo coloque 0.5 mL del líquido de la fase clorofórmica obtenida en la extracción de lípidos del cerebro, y agréguele 0.5 mL de Cloroformo. b) Utilizando una pipeta Pasteur, aplique 1 gota de esta dilución en 3 puntos equidistantes en una cromatoplaca previamente preparada, a 2 cm de altura de la base. c) Permita que el Cloroformo se evapore e introduzca la placa en una cámara de cromatografía que contenga como solvente de elusión, una mezcla de cloroformo–metanol-ácido acéticoagua (65: 25:8:4) d) Deje desarrollar el cromatograma hasta que el solvente alcance el frente del solvente ya marcado; saque la placa de la cubeta y déjela secar. e) En esta forma se tendrán 3 cromatogramas en la misma placa, los cuales se rocían con Ninhidrina, que revela fosfoaminolípidos. Propiedades de Lípidos mlvm / maov / 48 Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I f) Coloque la placa de cromatografía tratada en el horno a 100C, por 10 minutos para efectuar la reacción. Evidencia de Aprendizaje 1. Calcule los valores de Rf de cada una de las manchas, identifíquelas (con respecto a los valores de referencia que se le proporcionen para las diferentes fracciones), anotándolas en una tabla. Identificación de cerebrósidos. Material 1 Tubo de ensayo Pipetas de 5 mL Reactivos Fase metanólica Reactivo de Molisch-Udransky H2SO4 concentrado Desarrollo 1. Utilizando 1 mL del líquido de la fase metanólica, obtenido en la extracción de lípidos de cerebro, trate de demostrar la presencia de cerebrósidos utilizando la reacción de Molisch-Udransky cuya técnica y fundamento fue descrito en la práctica de Glúcidos. Evidencia de Aprendizaje 1. Anote el resultado. 2. ¿Qué porción de los cerebrósidos se identifica con esta reacción? Reacción de la Acroleína. Identificación de acilglicéridos. Material 3 Tubos de ensaye Pipetas de 5 mL Reactivos Glicerina Aceite de algodón KHSO4 (bisulfato de potasio) Desarrollo a) Coloque un poco de KHSO4 en 3 tubos de ensayo limpios, secos y numerados. b) Añada al tubo 1, 5 gotas de glicerina, al tubo 2, 5 gotas de aceite de algodón, cártamo o girasol (sin solvente) y al tubo 3, 5 gotas del lípido problema. c) Caliente cuidadosamente y huela indirectamente los vapores. Anote su resultado. Evidencia de Aprendizaje 1. Se puede considerar esta reacción general para cualquier lípido, ¿Por qué? 2. Escriba la reacción que se ha efectuado. Propiedades de Lípidos mlvm / maov / 49 Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I Reacción de Liebermann-Burchards Material 4 Tubos de ensaye Pipetas de 5 mL Reactivos Cloroformo Colesterol en cloroformo Fase clorofórmica Anhídrido acético H2SO4 concentrado Desarrollo a) Prepare 4 tubos de ensayo, siguiendo las instrucciones de la tabla. Tubo No REACTIVO (mL) 1 (t-) Cloroformo 2 3 4 3 Sol. Clorofórmica de colesterol puro 3 3 Fase clorofórmica Problema 3 Anhídrido acético. Usar en la campana 1 1 1 1 MEZCLAR COMPLETAMENTE H2SO4, ¡Precaución! deslizar por la pared lentamente 1 1 1 1 Resultado Evidencia de Aprendizaje 1. Observe los cambios de coloración que se producen con respecto al testigo negativo de cloroformo y anote sus resultados en la tabla. Tubo No 1 (t-) 2 3 4 Resultado Grado de permeabilidad de una capa lipídica Material 4 Tubos de ensaye Pipetas de 5 mL Reactivos Azul de metileno más monoestearato de glicerilo en Butanol Azul de metileno más colesterol en Butanol Azul de metileno en Butanol extracto clorofórmico Desarrollo a) Evapore a sequedad 2 mL del líquido de la fase clorofórmica obtenida en la extracción de lípidos del cerebro. Evaporar agitando, o en Baño María, sin hervir. b) El residuo obtenido se disuelve con 2 mL de azul de metileno en butanol. Marque la muestra como Fosfolípidos en butanol. c) Prepare 4 tubos de ensaye como se indica en la tabla siguiente. Las soluciones se agregan al agua, resbalando lentamente por las paredes del tubo, para estratificar. Propiedades de Lípidos mlvm / maov / 50 Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I Reactivos / mL Tubo No 2 3 5 5 Agua 1 5 4 5 Azul de metileno más monoestearato de glicerilo en Butanol 2 -- -- -- Azul de metileno más fosfolípidos en Butanol -- 2 -- -- Azul de metileno más colesterol en Butanol -- -- 2 - Azul de metileno en Butanol -- -- -- 2 d) Deje los tubos en reposo, procurando moverlos lo menos posible. e) Observe la difusión del azul de metileno después de que transcurran 1, 2, 4 y 24 horas. Evidencia de Aprendizaje 1. Registre el grado de difusión del azul de metileno con respecto al tiempo, en la siguiente tabla. Reactivos 1 Tiempo (horas) Permeabi2 4 24 lidad Final Azul de metileno más monoestearato de glicerilo en Butanol Azul de metileno más fosfolípidos en Butanol Azul de metileno más colesterol en Butanol Azul de metileno en Butanol 2. Anote a que se debe la diferencia, en cuanto al grado de difusión del azul de metileno, con respecto al tipo de lípido usado. 3. Escriba la relación que existe, entre la difusión del colorante con respecto al grado de permeabilidad de las capas lipídicas utilizadas. Propiedades de Lípidos mlvm / maov / 51 Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I PROPIEDADES DE ÁCIDOS NUCLEICOS Obtención de DNA del bazo Material 2 Tubos de centrífuga Pipetas de 5 mL Vaso de precipitados de 500 mL Reactivos Bazo Solución reguladora de citrato 0.01 M en NaCl 0.14 N, pH 7.2 NaCl 2.6 M alcohol etílico al 95% Desarrollo a) Coloque en un vaso de licuadora frío, 450 mL de solución reguladora de citratos-NaCl. b) Ponga a funcionar la licuadora y vaya añadiendo los trozos de bazo congelado uno a uno, esperando a que se homogeneíce completamente el primero, antes de añadir el segundo y así sucesivamente SIN QUE SE CALIENTE LA MEZCLA. Una vez terminada la adición, continúe homogeneizando por 60 segundos. c) Coloque el homogeneizado en tubos de centrifuga adecuados y tárelos. d) Centrifugue por 15 minutos a 5000 r.p.m. (si es posible, en la centrifuga refrigerada) Deseche el sobrenadante y conserve el residuo 1. e) En cada tubo, lave el residuo de la centrifugación anterior con 15 mL de solución reguladora de citratos, agitando hasta re suspender con ayuda de una agitador de vidrio. f) Vuelva a tarar los tubos y nuevamente centrifugue por 5 minutos a 5 000 r.p.m. El segundo sobrenadante también se desecha. g) Al residuo de la segunda centrifugación de cada tubo, añádale 15 mL de NaCl 2.6M frío y homogenice por agitación. h) Nuevamente tare los tubos y centrifugue el homogenizado a 8 000 r.p.m. por 30 minutos. El líquido sobrenadante contiene el DNA, SE ROTULA Y SE GUARDA PARA LA OBTENCIÓN DEL DNA. El residuo que contiene restos celulares y proteínas insolubles, se desecha. i) El líquido sobrenadante con DNA, se coloca en un vaso de precipitados de 150 mL y se añaden lentamente por la pared del vaso, 2 volúmenes de alcohol etílico al 95%, procurando que la fase alcohólica quede en la parte superior. Se deberá observar la formación de un precipitado blanco denso en la interfase. j) Introduzca un agitador, con salientes pequeñas hasta el fondo del vaso de precipitados, gírelo y extráigalo lentamente del vaso procurando enrollar sobre él las fibras de DNA precipitado. k) En la forma anterior recolecte todo el DNA que sea posible y transfiéralo a un frasco Gerber que contenga 10 mL de agua. (El DNA debe disolverse) Esta es la solución problema para determinar DNA en el siguiente experimento. Evidencia de Aprendizaje 1. Elabore un esquema de las fibras de DNA obtenidas. 2. Anote la razón de utilizar el bazo como fuente de DNA. 3. Escriba si es conveniente o no, utilizar regulador de fosfatos para la extracción del DNA y ¿por qué? 4. Escriba la razón por la que se lleva a cabo la extracción a baja temperatura. Propiedades de Ácidos Nucleicos mlvm / maov / 52 Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I Identificación y Cuantificación de DNA. Material 6 Tubos de ensaye Pipetas de 5 mL Vaso de precipitados de 500 mL 2 Tubos Klett Reactivos Solución patrón de DNA 1 mg/mL Solución DNA problema Reactivo de Dische Desarrollo a) Prepare una serie de 6 tubos de ensaye, numerándolos. b) Tubo 1, coloque únicamente 2 mL de H2O destilada como testigo negativo. c) Tubo 2, coloque 2 mL de solución patrón de DNA [1 mg/mL] d) Tubo 3, coloque 2 mL de H2O destilada, más 2 mL de solución patrón de DNA [0.5 mg/mL] y mezcle completamente. e) Tubo 4, coloque 2 mL de H2O destilada, más 2 mL de la solución del Tubo 3 [0.25 mg/mL] y mezcle completamente. f) Tubo 5, coloque 2 mL de H2O destilada, más 2 mL de la solución del Tubo 4 [0.125 mg/mL] y mezcle completamente. Deseche 2 mL. g) Tubo 6, coloque 2 mL de solución DNA problema, obtenida en la extracción del DNA del bazo. h) Para desarrollar color, siga las instrucciones de la tabla siguiente. TUBO No Reactivo / mL Reactivo de Dische (en la campana extractora) 1(t-) 4 2 4 3 4 4 4 5 4 6 (p) 4 Agitar vigorosamente Incubar 10 minutos en BAÑO MARÍA. a ebullición Enfriar 5 minutos en baño de hielo, (color azul transparente) i) Mida la intensidad del color en el espectrofotómetro a 600 nm, AJUSTÁNDOLO A 0 CON EL TUBO 1. Evidencia de Aprendizaje 1. Anote sus resultados en la tabla siguiente. TUBO No 1 (t-) DENSIDAD ÓPTICA (D.O.) 0 Concentración (mg/mL) 0 2 3 4 5 1.0 0.5 0.25 0.125 6 (p) 2. Grafique D.O. en función de la concentración de DNA en mg/mL. 3. Interpole el valor de D.O. de la solución problema y obtenga la concentración del DNA en mg/mL de la solución problema. Propiedades de Ácidos Nucleicos mlvm / maov / 53 Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I Identificación y Cuantificación de RNA Material 6 Tubos de ensaye Pipetas de 5 mL Vaso de precipitados de 500 mL 2 Tubos Klett Reactivos Solución patrón de RNA 0.3 mg/mL Solución RNA problema Reactivo de Orcinol ácido Reactivo de Orcinol alcohol Desarrollo a) Prepare una serie de 6 tubos de ensaye, numerándolos. b) Tubo 1, únicamente 3 mL de H2O destilada. (t(-), amarillo) c) Tubo 2, coloque 3 mL de sol. patrón de RNA [0.3 mg/mL] d) Tubo 3, coloque 3 mL de H2O destilada, más 3 mL de solución patrón de RNA [0.15 mg/mL] y mezcle completamente. e) Tubo 4, coloque 3 mL de H2O destilada, más 3 mL de solución del Tubo 3 [0.075] y mezcle completamente. f) Tubo 5, coloque 3 mL de H2O destilada, más 3 mL de solución del Tubo 4 [0.0375] y mezcle completamente. Deseche 3 mL. g) Tubo 6, únicamente 3 mL del RNA problema. h) A continuación, aplique a los tubos el tratamiento de la tabla siguiente. Reactivo / mL Reactivo de Orcinol ácido (en la campana extractora) 1 6 TUBO No 2 3 4 5 6 6 6 6 Reactivo de Orcinol alcohol (en la campana extractora) 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 6 6 0.4 Agitar vigorosamente Incubar 20 minutos en BAÑO MARÍA. a ebullición Incubar 5 minutos en baño de hielo (color verde esmeralda) i) Mida la intensidad del color en el espectrofotómetro a 660 nm, AJUSTANDO A CERO CON EL TUBO 1. Evidencia de Aprendizaje 1. Anote sus resultados en la tabla siguiente. TUBO No 1 (t-) DENSIDAD ÓPTICA (D.O.) 0 Concentración (mg/mL) 0 2 3 4 5 0.3 0.15 0.075 0.0375 6 (p) 2. Grafique D.O. en función de la concentración de RNA en mg/mL. 3. Interpole el valor de D.O. de la solución problema y obtenga la concentración de RNA en mg/mL, de la solución problema. Propiedades de Ácidos Nucleicos mlvm / maov / 54 Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I Identificación y Cuantificación de Fosfato Total Material 6 Tubos de ensaye Pipetas de 5 mL Vaso de precipitados de 500 mL 2 Tubos Klett Reactivos Buffer acetatos 0.1N pH= 4 Reactivo de Molibdato 2.5% Vitamina C 1% (reciente) Sol. tipo de PO4 1M Sol. tipo de PO4 2.5M Sol. tipo de PO4 5M Problema de DNA Problema de RNA Agua destilada Desarrollo a) Prepare una serie de 6 tubos como se indica en la tabla siguiente. TUBO No 3 4 7 7 Reactivo /mL Buffer acetatos 0.1M pH= 4 1 t7 2 7 Reactivo de Molibdato 2.5% 0.5 o.5 0.5 Vitamina C 1% (reciente) 0.5 0.5 0.5 5 7 6 7 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 2 H2O destilada 2 Sol. tipo de PO4 1M/mL 2 Sol. tipo de PO4 2.5M/mL 2 Sol. tipo de PO4 5M/mL 2 Problema de DNA 2 Problema de RNA Reposar 30 minutos a temperatura ambiente (color azul) b) Mida la intensidad del color desarrollado en el espectrofotómetro a 660 nm, usando como blanco el tubo 1. Evidencia de Aprendizaje 1. Anote sus resultados en la tabla siguiente. TUBO No 1 (t-) DENSIDAD ÓPTICA (D.O.) 0 Concentración (M/mL) 0 2 3 4 1.0 2.5 5.0 5 (DNA) 6 (RNA) 2. Grafique D.O. en función de la concentración de Fosfato. 3. Interpole los valores de D.O. de las soluciones problema (DNA y RNA) y obtenga la concentramL. 4. Anote como afecta el medio ácido y el básico los enlaces 3'-5' diéster fosfato. Propiedades de Ácidos Nucleicos mlvm / maov / 55 Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I APÉNDICE I. Curva Tipo de Azucares Reductores Material 1 matraz aforado de 100 mL 3 pipeta de 5 o 10 mL 1 vaso de precipitados de 600 mL 2 celdas para fotocolorímetro 11 tubos de ensayo Reactivos Glucosa (Dextrosa) grado reactivo Regulador de fosfatos de pH 7 Ácido 3,5-dinitrosalicílico Desarrollo a) Solución estándar (0.1 M) Disuelve 1.8 g de Glucosa en 100 mL de agua. b) Solución tipo (0.02 M) Diluye 20 mL de la solución estándar a 100 mL con agua destilada. c) Prepara una serie de 11 tubos de ensaye como se indica en la tabla siguiente. Solución Testigo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 mL de solución tipo 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 mL regulador de fosfato pH = 7 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 Ac. 3,5-dinitrosalicílico 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 d) Coloca todos los tubos en baño maría a ebullición durante 10 minutos. e) Enfría los tubos al chorro del agua y lee la coloración en el fotocolorímetro a 540 nm (filtro verde), empleando el tubo 1 como blanco para ajustar a cero. f) Registra tus resultados en la tabla siguiente: Tubo No Testigo U.K. 0 MA.R. 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Evidencia de Aprendizaje 1.Calcula la concentración molar de azucares reductores (MA.R.) en cada tubo. Anota el resultado en la tabla anterior 2.Dibuja la gráfica de la curva tipo que obtuviste, en unidades Klett en función de la concentración molar de azúcares reductores. 3.Calcula la ecuación de la recta obtenida, para calcular la concentración de azucares reductores de los problemas. Apéndice I. Curva Tipo de Azucares Reductores mlvm / maov / 56 Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I APÉNDICE II. Auxiliar de Macropipeteado Brand – Prepipeta FUNCIÓN Este aparato sirve como ayuda para pipetear con seguridad, líquidos con pipetas aforadas, graduadas y de vaciado por soplado, de vidrio y plástico, en la gama de volúmenes de 0.1 a 200 mL y con tubo de succión de diámetro exterior < 9.2 mm. Con un manejo apropiado, el líquido pipeteado únicamente debe entrar en contacto con la pipeta, nunca con la prepipeta. COMPONENTES Pera de succión Botón de soplado Control de pipeteado Adaptador de pipetas INSTRUCCIONES PARA PIPETEAR a) Evacuación del aire de la pera de succión. Antes de colocar la pipeta oprima la pera de succión. b) Colocación de la pipeta. Sujetando firmemente la pipeta por el extremo superior, introducirla con cuidado en el adaptador de pipetas hasta que quede firmemente sujeta. ¡Atención! Fíjese que la pipeta esté acoplada fuertemente. Nunca emplear la fuerza para acoplar las pipetas. Especialmente con pipetas delgadas, existe el peligro de rotura del vidrio y peligro de heridas. La prepipeta con la pipeta colocada en su sitio, debe mantenerse siempre en posición vertical, con la punta hacia abajo. Apéndice II. Auxiliar de Macropipeteado Brand – Prepipeta mlvm / maov / 57 Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I c) Llenado de la pipeta. Introducir la punta de la pipeta en el líquido. Empujar el control de pipeteado hacia arriba con cuidado. Llenar la pipeta un poco arriba de la marca del volumen deseado ¡Atención! Por favor, tenga cuidado de que el líquido no entre en el aparato. Esto afecta el funcionamiento de la membrana del filtro y disminuye la capacidad de succión. En este caso se debe cambiar el filtro. Nota: Cuando más se desplace hacia arriba el control de pipeteado, tanto mayor será el efecto de succión, o sea, el menisco del líquido asciende más rápidamente. En pipetas grandes (>50 mL) el vacio obtenido en la pera de succión no es suficiente para hacer ascender la cantidad de líquido de una sola vez. En este caso oprímase de nuevo la pera de succión y continúe aspirando. d) Ajuste del menisco. Secar el exterior de la pipeta con un paño de material exento de pelusa. Mover el control de pipeteado con cuidado hacia abajo hasta que el menisco del líquido esté exactamente ajustado. e) Vaciar la pipeta. Mantener inclinado el recipiente en que se recibirá el líquido. Colocar la punta de la pipeta contra la pared interior. Mover hacia abajo el control de pipeteado hasta que el menisco del líquido alcance la marca del volumen deseado. f) Para pipetas con tiempo de espera. (por ejemplo con rótulo “Ex + 15 s”) En cuanto el menisco de la pipeta se encuentre en reposo, mantener el tiempo de espera indicando en la pipeta (en el caso del ejemplo, 15 s) Arrastrar algunos milímetros hacia arriba la punta de la pipeta por la pared del recipiente. g) Para pipetas con vaciado por soplado. (terminales, rotuladas “ausblasen – blow out”)) En cuanto el menisco de la pipeta se encuentre en reposo, oprimir una vez el botón de soplado. Arrastrar algunos milímetros hacia arriba la punta de la pipeta por la pared del recipiente. h) Después de pipetear. Sujetar la pipeta lo más cerca posible del extremo superior y extraerla del adaptador. PRECAUCIONES 1. Utilizar la prepipeta únicamente para pipetear y sólo dentro de los limites de resistencia de los materiales de que está fabricada. 2. No emplear nunca la fuerza. 3. La prepipeta no debe usarse para pipetear líquidos cuyos vapores ataquen los materiales con que está fabricada. 4. Si la prepipeta no funciona correctamente o gotea, deje de usarla inmediatamente y avise al instructor para que se revise. Apéndice II. Auxiliar de Macropipeteado Brand – Prepipeta mlvm / maov / 58 Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I APÉNDICE III. Puente de Wheatstone COMPONENTES A)Escala del Galvanómetro H)Terminales de la Batería B)Botón del Seguro de Galvanómetro I)Perilla de Rango de la Resistencia C)Botón de Ajuste del Galvanómetro J)Perilla de Millares D)Botón de Corriente del Galvanómetro K)Perilla de Centenas E)Terminales para Medir Resistencia L)Perilla de Decenas F)Terminales para Medir Corriente M)Perilla de Unidades G)Interruptor de Encendido INSTRUCCIONES DE OPERACIÓN I. Como fuente de poder 1.Conecte el aparato a la toma de corriente. 2.Conecte los cables conductores a las terminales de batería, (B.A.) 3.El paso de corriente es inmediato, al accionar el interruptor de encendido (G). II. Medición de la Resistencia 1.Conecte el aparato a una toma de corriente. 2.Libere el galvanómetro deslizando el botón de seguro (B), en dirección de la escala (A). Ajuste la aguja a cero girando el botón de ajuste (C). Apéndice III. Puente de Wheatstone mlvm / maov / 59 Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I 3.Conecte la resistencia problema a las terminales para medir resistencia (E). El orden no es importante. 4.Ajuste la perilla de Rango de resistencia (H) a su máximo valor (1000). El resto de las perillas (I a L) ajústelas a 9. 5.Presione el botón de corriente del galvanómetro (D) y observe si la aguja de la escala se mueve a la derecha (+) o a la izquierda (-). 6.Mueva la perilla H al valor de 100, vuelva a presionar el botón D y observe si la aguja se mueve en la misma dirección que antes. Si es así, mueva la perilla H al valor inferior siguiente (10) y vuelva a realizar la observación; continúe disminuyendo el valor, hasta que la aguja del galvanómetro cambie de dirección. 7.Después del cambio de dirección, devuelva la perilla H al último valor en que la aguja se desplazó en la dirección original. 8.A continuación, mueva la perilla de millares (I) de 9 a 8, presione el botón D y observe si el movimiento de la aguja cambia de dirección. Nuevamente, si no hay cambio, disminuya los valores de la perilla I, hasta encontrar una valor en el cual la dirección del movimiento cambie. 9.De la misma manera, ajuste los valores de las perillas de centenas (J) decenas (K) y unidades (L) en ese orden, hasta que la aguja no se mueva. 10.Una vez logrado el equilibrio, el valor de la resistencia, en ohms, se calcula sumando los valores de obtenidos para las perillas millares, centenas, decenas y unidades, y multiplicando el resultado por el valor del RATIO. Resistencia = (Millares + Centenas + Decenas + Unidades) x RATIO Apéndice III. Puente de Wheatstone mlvm / maov / 60 Escuela Superior de Medicina Julio 2016 Laboratorio de Bioquímica Médica I APÉNDICE IV. Simbología de Seguridad en el Laboratorio INFLAMABLE VENENO EXPLOSIVO RADIACTIVO CORROSIVO GAS COMPRIMIDO INFLAMABLE OXIDANTE EXPLOSIVO NIVEL DE RIESGO BAJO CORROSIVO IRRITANTE VENENO DAÑO AMBIENTAL Apéndice IV. Simbología de Seguridad en el Laboratorio mlvm / maov / 61
