validación y control de calidad de los métodos de reacción en

CAPÍTULO 1.1.3
VALIDACIÓN Y CONTROL DE CALIDAD
DE LOS MÉTODOS DE REACCIÓN EN CADENA
DE LA POLIMERASA UTILIZADOS PARA EL
DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS
RESUMEN
El diagnóstico de las enfermedades infecciosas se realiza mediante la detección directa o indirecta de los
agentes infecciosos. Mediante los métodos directos, se detectan los agentes y/o sus componentes, tales como
los ácidos nucleicos, las proteínas estructurales y no estructurales, los enzimas, etc. Mediante los métodos
indirectos, se detectan los anticuerpos inducidos por las infecciones.
Los métodos más frecuentes de detección directa son el aislamiento del virus, el cultivo de bacterias (las dos
pruebas de referencia), la microscopía electrónica, la inmunofluorescencia, la inmunohistoquímica, el
enzimoinmunoensayo de detección de antígeno, la hibridación del ácido nucleico (NAH), y la amplificación
del ácido nucleico, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Como las técnicas NAH y PCR se
centran en las moléculas, también se las conoce como técnicas o métodos de diagnóstico molecular.
Los métodos indirectos más comúnmente utilizados para la detección de los agentes infecciosos son la
neutralización vírica, la detección de anticuerpos mediante el ELISA y las pruebas de inhibición de la
hemoaglutinación. Por lo general, los laboratorios aplican de forma simultánea lo métodos directos e
indirectos, a fin de asegurar la fiabilidad del diagnóstico.
Se han propuesto directrices de la OIE para la aplicación de los métodos de detección indirecta, i.e. para la
detección de anticuerpos mediante ELISA (véase el capítulo 1.1.2). El propósito del presente capítulo es
extender la aplicación de las reglas a un método directo de detección del agente infeccioso; más
concretamente, se trata de adaptar las directrices o principios de validación a los ensayos PCR.
Las experiencias de la última década indican que la técnica PCR terminará por imponerse a muchos de los
clásicos métodos directos de detección del agente infeccioso. Es un hecho cierto que en muchos laboratorios de
diagnóstico las técnicas PCR están reemplazando al aislamiento vírico o al cultivo de bacterias en los casos
de detección de agentes que resultan difíciles o imposibles de cultivar. Son varias las razones que explican
esa tendencia; una de ellas es que el aislamiento vírico requiere: i) la presencia de virus replicantes; ii)
cultivos celulares y medios de mantenimiento que resultan caros; iii): un tiempo de no menos de varias
semanas para completar el diagnóstico; y iv) conocimiento de experto innecesario en muchos laboratorios.
Aunque inicialmente la utilización de los ensayos PCR era cara y compleja, en la actualidad son
relativamente baratos, seguros y fáciles de utilizar en los laboratorios de diagnóstico (2,7).
A. MÉTODOS DE PCR UTILIZADOS EN DIAGNÓSTICOS MOLECULARES
RUTINARIOS
1. PRINCIPIOS DE LA TÉCNICA DE LA PCR
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) implica una reacción de amplificación durante el ensayo.
El término “reacción en cadena” se refiere a los varios ciclos de copiado de un fragmento específico de
ADN a partir de un ácido nucleico diana, en este caso, del genoma del agente infeccioso. La región
amplificada se caracteriza por dos (o más) oligonucleótidos cortos y dos cebadores que son
complementarios con las regiones de ADN que flanquean la secuencia diana. Utilizando una ADN-
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Chapter 1.1.3. - Validación y control de calidad de los PCR utilizado para el diagnóstico de enfermedades infecciosas
polimerasa termoestable, que no resulte desnaturalizada durante el ciclo de calentamiento, es posible
copiar la secuencia de ADN entre los dos cebadores. Repitiendo de 20 a 40 veces el régimen de ciclos
de calentamiento, se obtendrá una cantidad de ADN diana copiado que será suficiente para
operaciones ulteriores, tales como la detección, el clonado y la secuenciación. La sensibilidad de
diagnóstico de la PCR es muy alta, ya que se producen varios millones de copias de la diana
seleccionada. También puede ser muy alta la especificidad de la reacción, debida a las secuencias
nucleotídicas específicas formadas por los oligonucleótidos (cebadores). Los cebadores están diseñados
para detectar secuencias nucleotídicas específicas en los genomas de los agentes infecciosos diana
seleccionados.
a)
Amplificación del ADN
Si el genoma del agente infeccioso es ADN, se realiza la ampliación de forma directa, con o sin
purificación previa del ADN diana.
b)
Amplificación del ARN (PCR de transcripción inversa)
Los genomas de muchos agentes infecciosos contienen ácido ribonucleico (ARN) que no se
puede amplificar directamente mediante PCR. Para la amplificación por PCR, se necesita un ADN
diana de doble cadena, pero ésta no está disponible en los virus de ARN. Ese problema puede
resolverse mediante la introducción de un estadio previo antes de comenzar la PCR. Mediante la
utilización de transcriptasa inversa, es posible transcribir el ARN a ADN complementario
(ADNc), que es ADN de doble cadena, y por ello puede utilizarse en ensayos PCR (el
procedimiento se denomina PCR de transcriptasa inversa (RT-PCR)). Tradicionalmente, la
reacción de la transcripción inversa se realiza en un tubo aparte, y el ADNc producido se
transfiere después a un tubo nuevo para la reacción de la PCR. Sin embargo, ya se dispone de
ADN- polimerasas termoestables y con actividad de transcriptasa inversa. La utilización de estas
enzimas en tampones específicos posibilita que la reacción propia de la RT-PCR tenga lugar en el
mismo tubo en secuencia directa, sin manipulación adicional.
A continuación se ofrecen algunos ejemplos de técnicas PCR utilizadas en la actualidad.
2. PCR SIMPLE
En la PCR simple (o PCR, a secas) se utiliza un par de cebadores oligonucletídicos para amplificar una
pequeña parte del genoma del agente infeccioso. La sensibilidad analítica es relativamente alta, con un
mínimo de entre 100 y 1.000 copias del genoma detectable. La especificidad analítica también es
bastante alta. Tanto la sensibilidad como la especificidad pueden mejorarse mediante la aplicación de
PCR anidada (véase más adelante el punto 3). Mediante la utilización del análisis tipo Southern blot y la
comprobación de los productos de la PCR con sondas marcadas, se puede conseguir una mejora
adicional de la especificidad, pero eso lleva demasiado tiempo y por ese motivo no se suele emplear
hoy en día en los laboratorios de diagnóstico.
3. PCR ANIDADA
En los ensayos de la PCR anidada se utilizan dos ciclos de amplificación con cuatro cebadores,
denominados cebadores externos e internos. En general, si se comparan las pruebas de PCR anidada
con las pruebas de PCR simple, las primeras proporcionan una sensibilidad y especificidad analíticas
superiores. La sensibilidad analítica típica es <10 copias de genoma del agente infeccioso, y la
especificidad analítica también aumenta porque, en la PCR anidada, cuatro oligonucleótidos tienen que
unirse específicamente a las dianas seleccionadas para producir una reacción positiva (2).
4. PCR EN TIEMPO REAL
La PCR en tiempo real es una amplificación en la que los productos de la PCR se detectan de forma
directa durante los ciclos de amplificación utilizando sondas marcadas con fluorescencia. Diversos
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Capítulo 1.1.3. — Validación y control de calidad de los PCR utilizado para el diagnóstico de enfermedades infecciosas
métodos en tiempo real, tales como los que se realizan con las sondas fluorescentes TaqMan o Molecular
Beacon, se han convertido en herramientas populares para la detección de agentes infecciosos. La PCR
en tiempo real se ha utilizado para la detección de bacterias, virus o parásitos de una amplia variedad de
especies animales (2, 6, 8). Estos nuevos ensayos tienen varias ventajas sobre los métodos “clásicos” de
la PCR simple o anidada. Sólo se utiliza un par de cebadores, aportando una sensibilidad que a menudo
está próxima o es igual a la PCR anidada tradicional, pero con un riesgo de contaminación mucho más
bajo. La fluorescencia, que indica la presencia del producto amplificado, se mide a través de la tapa o
del lado del recipiente de reacción, de forma que no es necesario el manejo posterior de los productos
de la PCR. Estos procedimientos llevan un tiempo considerablemente menor si se compara con la
detección tradicional de los productos de la PCR en geles de agarosa, seguidos de la tinción con
bromuro de etidio, con lo que, de nuevo, se reduce el riesgo de contaminación. El empleo de la
modalidad de placa de microtitulación de 96 pocillos, sin la necesidad de la PCR anidada, permite que
el procedimiento sea automático (5). El diagnóstico se puede automatizar posteriormente utilizando
robots para las extracciones de ADN/ARN y el pipeteo. En comparación con los métodos clásicos de
amplificación, una ventaja adicional de la técnica de la PCR en tiempo real es que es posible realizar
ensayos cuantitativos (6).
5. PCR MÚLTIPLE
Las sondas para el PCR en tiempo real pueden marcarse con un gran número de fluoróforos
diferentes, que funcionan como colorantes indicadores. El uso de sondas fluorescentes que emiten
diferentes colores permite el “multiplexado” de los ensayos. En la PCR múltiple se pueden detectar y
diferenciar de forma simultánea varios agentes infecciosos en un único recipiente de reacción
individual. Se ha descrito que la técnica de la PCR “clásica” también es útil para el desarrollo de
sistemas múltiples. Sin embargo el empleo de los métodos de la PCR anidada “clásica” para la
construcción de un ensayo múltiple resulta complicado debido al gran número de cebadores que
pueden “competir” entre sí en la misma mezcla reactiva. En contraste con lo anterior, el concepto de la
PCR en tiempo real (pares de cebadores únicos) proporciona excelentes posibilidades para la
construcción de sistemas múltiples muy sensibles (2, 4).
B. VALIDACIÓN DE LOS ENSAYOS DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR
Cuando se realizan análisis diagnósticos de material clínico es importante producir datos de buena calidad.
Para esto, hay que cumplir algunos criterios clave. Es necesario establecer los sistemas de garantía de
calidad (GC) y de control de calidad (CC), es decir, un juego de protocolos de calidad, incluyendo el
empleo de muestras de control, que aseguren que el sistema está funcionando adecuadamente y que
confirme la calidad de los datos. En muchos laboratorios de todo el mundo ya se han establecido los
sistemas GC y CC y se dispone de personal adiestrado y competente. La validación de los ensayos es otro
factor fundamental para garantizar que los resultados de las pruebas reflejan el estado real de las muestras
(3).
Para predecir la realización de un ensayo diagnóstico es necesario utilizar una metodología de validación
para validar el ensayo en cuestión. La validación es la evaluación de una prueba de diagnóstico con el fin
de determinar su idoneidad para una utilización concreta. Los principios generales de validación de
ensayos se pueden encontrar en el capítulo 1.1.2. Principios de validación de las pruebas de diagnóstico para las
enfermedades infecciosas. Este capítulo extiende estos principios de validación a los ensayos de diagnóstico
molecular. Consúltese el capítulo 1.1.2 para la explicación de los términos y las definiciones.
C. MEDIDAS DE LA VALIDEZ
Las características operativas (o parámetros del ensayo) proporcionan información sobre la eficacia de un
método bajo condiciones específicas. En el capítulo 1.1.2 se presentan algunas características operativas
típicas, y en el presente capítulo se ofrecen algunas otras que son importantes para los métodos de la PCR.
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Chapter 1.1.3. - Validación y control de calidad de los PCR utilizado para el diagnóstico de enfermedades infecciosas
D. ETAPAS DE LA VALIDACIÓN DE ENSAYOS
En el capítulo 1.1.2 se describen con detalle las etapas de la validación de ensayos. En el presente capítulo,
se exponen brevemente estas etapas, con especial énfasis en los ensayos de diagnóstico molecular.
1ª ETAPA. ESTUDIOS DE VIABILIDAD
El estudio de viabilidad constituye la etapa preliminar en la validación de un nuevo ensayo. El objetivo es
determinar si en un ensayo se puede detectar o no una gama de concentraciones diana sin actividad de
fondo. Se eligen, al menos, diez muestras (por ejemplo, agentes infecciosos producidos en cultivo celular o
bacteriano dentro el laboratorio), que comprendan desde niveles bajos hasta niveles altos del agente
infeccioso. También hay que incluir, al menos, diez muestras que no contengan la muestra diana.
Normalmente, es difícil separar esta etapa de la segunda, ya que es necesaria una optimización preliminar
antes de que se puedan realizar estudios posteriores. Los ensayos que parecen prometedores se someten a
un desarrollo posterior en la 2ª etapa. Obsérvese que, a veces, se puede mejorar considerablemente un
ensayo mediante esquemas de optimización adecuados, y, por tanto, la exclusión de ensayos no óptimos se
deberá hacer con cautela.
La selección del cebador es crítica y debería tenerse en cuenta la naturaleza del agente infeccioso, su
estructura genómica y la diversidad de secuencias genéticas existentes entre diferentes cepas.
El resultado obtenido por la PCR puede verse influenciado por el funcionamiento del termociclador que,
por ello, se debería supervisar de forma continua. Es crucial la calibración de la temperatura regular y, para
los instrumentos de la PCR en tiempo real, deben calibrarse de forma regular los sistemas ópticos. Los
ensayos desarrollados y validados utilizando una marca específica de termociclador deben revalidarse o
controlarse o, en otro caso, controlarse cuando se utiliza un equipo nuevo.
2ª ETAPA. DESARROLLO Y ESTANDARIZACIÓN DEL ENSAYO
1. SELECCIÓN DE LAS CONCENTRACIONES ÓPTIMAS DE LOS REACTIVOS, LOS PARÁMETROS DE LOS
PROTOCOLOS Y EL EQUIPO
La toma, preparación y transporte de muestras (véase el capítulo I.1) y los métodos de extracción de
ácidos nucleicos (véase el capítulo I.1) son, todos ellos, parámetros esenciales en la realización de un
ensayo y deberían optimizarse para el diagnóstico de enfermedades. Los métodos adecuados varían
dependiendo del tipo de muestra y del organismo. En general, la sangre y el suero son muestras
adecuadas para la extracción de ácidos nucleicos objeto de estudio, mientras que las muestras de heces
y semen son más difíciles de manejar. La extracción del ARN diana difiere de la del ADN diana, y el
ARN es más proclive a degradarse. Tanto los métodos comerciales (robóticos, columnas de giro, etc.)
como los métodos de elaboración propia se utilizan para la extracción del ADN o del ARN. Es
fundamental establecer el método más eficaz antes de llevar a cabo una validación posterior del ensayo.
Si se cambia el método de extracción, debe repetirse el procedimiento completo de validación.
Todo el equipo utilizado en el proceso debe mantenerse correctamente. Los aparatos que requieren
calibración (bloques de calentamiento, refrigeradores, congeladores, termocicladores, pipetas, etc.)
deben calibrarse según los protocolos de calidad del laboratorio.
Cuando se realicen las pruebas de PCR “clásica” o de PCR en tiempo real, es necesario optimizar
todos los parámetros, los protocolos y los reactivos. Un ensayo estandarizado es un método que de
forma consistente produce el mismo resultado para una muestra dada cuando se repite varias veces.
2. REPETIBILIDAD —ESTIMACIONES PRELIMINARES
En esta etapa debe conseguirse una concordancia entre las réplicas durante la realización de un ensayo
y entre las distintas realizaciones del mismo tipo de ensayo. Esto proporciona información importante
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Capítulo 1.1.3. — Validación y control de calidad de los PCR utilizado para el diagnóstico de enfermedades infecciosas
sobre el ensayo antes de que se lleve a cabo una validación posterior. Si se encuentra una excesiva
variabilidad, habrá que corregirla antes de continuar con el proceso de validación.
3. DETERMINACIÓN DE LOS PARÁMETROS ESENCIALES DE CONTROL
Durante la optimización de la prueba PCR, también se puede estimar la resistencia del método a ser
afectado por pequeños cambios en los parámetros principales. La introducción de variables
intencionadas en el proceso de validación caracterizará los parámetros fundamentales de la prueba. Los
ejemplos de tales parámetros son: los tiempos y temperaturas de incubación, las concentración de
tampones, los cebadores, MgCl2, etc., pH, cantidades de otros componentes añadidos (por ejemplo
dNTP, albúmina de suero bovino, etc.). La caracterización de dichos parámetros de control es crucial
para la identificación de los puntos críticos que deben controlarse correctamente en el ensayo.
4. SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD ANALÍTICAS
La sensibilidad analítica (o límite de detección) se define como la cantidad más pequeña de copias de
genomas de agentes infecciosos que puede detectarse y distinguirse a partir de un resultado cero. Para
determinar la sensibilidad analítica se utiliza una dilución de punto final hasta que el ensayo ya no
pueda detectar la diana en cuestión en más del 5% de las réplicas (2 desviaciones estándar). Los
fragmentos clonados de los productos de la PCR en estudio se pueden usar como muestras estándar,
bien como ADN o para dianas de ARN, transcribiéndose el ARN in vitro a ADN.
La especificidad analítica se define como la capacidad de un ensayo para distinguir entre el agente diana
y otros agentes infecciosos. Esa capacidad se determina analizando los patógenos estrechamente
relacionados mediante la prueba en cuestión.
5. RANGO
En algunas ocasiones pueden jerarquizarse de forma arbitraria las técnicas analíticas. La prueba debe
optimizarse en la fase lineal de la curva de respuesta a la dosis. El rango de un ensayo se define como el
intervalo existente entre la concentración máxima y mínima de un agente infeccioso en una muestra en
la que el agente puede detectarse de forma fiable.
3ª ETAPA. DETERMINACIÓN DE LAS CARACTERÍSTICAS
OPERATIVAS DEL ENSAYO
1. SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD DIAGNÓSTICAS
La sensibilidad diagnóstica (proporción de animales de referencia que se sabe que están infectados, y
que dan respuesta positiva en el ensayo) y la especificidad diagnóstica (proporción de animales de
referencia que se sabe que no están infectados, y que dan respuesta negativa en el ensayo) son los
parámetros más importantes obtenidos durante la validación de un ensayo. Constituyen la base para el
cálculo de otros parámetros y son, por lo tanto, cruciales para el conjunto del proceso de validación. Se
puede calcular el número de muestras de referencia que se requiere para determinar las estimaciones y
el error admisible de la sensibilidad y de la especificidad diagnósticas. Para hacer esto, debe utilizarse
una predicción razonable de la sensibilidad y de la especificidad diagnósticas. Normalmente, la
confianza de la estimación se establece en el 95%. Sin embargo, ninguna fórmula puede tener en
cuenta los numerosos factores del hospedador/organismo que pueden afectar al resultado de la
prueba. En el capítulo I.1.2 se explica, a grandes rasgos, el número de muestras requeridas para
determinar las estimaciones de la sensibilidad y de la especificidad diagnósticas. Se sabe que el
conseguir esta cantidad de ensayos moleculares puede ser difícil y costosa. La comprobación de
pequeñas cantidades dará como resultado una reducción en la confianza de la estimación. El estado de
los animales que se sabe que están infectados y el de los que no lo están, debería establecerse mediante
comparaciones con otros ensayos. No es adecuado el empleo de muestras descartadas en la PCR, ya
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Chapter 1.1.3. - Validación y control de calidad de los PCR utilizado para el diagnóstico de enfermedades infecciosas
que éstas podrían no ser representativas de muestras infectadas de forma natural, y de esta forma
podría ponerse potencialmente en riesgo todo el proceso de validación.
2. REPETIBILIDAD Y REPRODUCIBILIDAD
La repetibilidad y la reproducibilidad son dos parámetros importantes de la precisión de un ensayo. La
repetibilidad se mide como el grado de concordancia entre las réplicas probadas durante la realización
de un ensayo y las probadas en distintas realizaciones del mismo ensayo. La reproducibilidad se
determina utilizando un ensayo idéntico (protocolo, reactivos y controles) en diferentes laboratorios.
Hoy en día es poco frecuente realizar en su totalidad la 3ª etapa recomendada por la OIE en los
laboratorios de diagnóstico veterinario llevando a cabo ensayos de la PCR. Tradicionalmente, muchos
laboratorios han utilizado pruebas de elaboración propia, probablemente por razones prácticas. Deben
aplicarse los métodos estandarizados y validados que se hayan publicado. Tienen que llevarse a cabo
los procesos de validación entre laboratorios, incluso si son costosos y requieren un trabajo intenso.
Este trabajo propiciará la realización de los ensayos estandarizados, permitiendo la actividad
diagnóstica armonizada en diferentes países.
4ª ETAPA. SEGUIMIENTO DE LA VALIDEZ DE LA OPERATIVIDAD DEL ENSAYO
Es preciso estimar la prevalencia del virus en la población para calcular el valor predictivo de los
resultados positivos (VP+) o negativos (VP–) de la prueba. Esto se aplica por igual a los métodos de
ensayos moleculares y a otros métodos tales como el enzimoinmunoensayo.
Se insta a los laboratorios de referencia a determinar los valores de la sensibilidad y especificidad
diagnósticas de la forma más precisa posible, ya que éstas son muy importantes para valorar el
rendimiento real de un ensayo cuando se usa en el campo. También es importante estimar los valores
predictivos (VP+ o VP–) en las circunstancias locales.
5ª ETAPA. MANTENIMIENTO Y MEJORA DE LOS CRITERIOS DE VALIDACIÓN
Cuando el ensayo se utiliza como una prueba rutinaria, es importante mantener el CC interno. Es preciso
supervisar de forma constante la repetibilidad y precisión del ensayo. La OIE recomienda que la
reproducibilidad entre laboratorios (prueba del anillo) se compruebe, al menos, dos veces al año (9)
Si el ensayo se va a aplicar en otra región geográfica y/o población, podría ser necesaria una revalidación
del mismo bajo las condiciones nuevas. Esto es especialmente cierto para los ensayos de la PCR ya que es
muy común que en muchos agentes infecciosos tengan lugar mutaciones puntuales (esto es
particularmente importante en virus ARN). Las mutaciones que se pueden producir dentro de las
secuencias del cebador pueden afectar la eficacia de un ensayo y, de ser así, la validación establecida ya no
es válida. También es recomendable secuenciar de forma regular las regiones genómicas seleccionadas en
los aislamientos nacionales o regionales de los agentes infecciosos. Esto es especialmente cierto en el caso
de los cebadores si se quiere garantizar que los mismos permanezcan estables con el fin de que no pueda
cuestionarse la validez de la prueba.
1. PRECAUCIONES Y CONTROLES
Teniendo en cuenta la incertidumbre en torno a la seguridad y fiabilidad de la PCR en el diagnóstico
rutinario, se deberían tomar precauciones especiales en cualquier laboratorio que utilice la técnica de
PCR para la detección de agentes infecciosos, con el fin de evitar resultados positivos o negativos
falsos. Estos, junto con controles internos (miméticos) garantizan la evaluación segura de los
resultados.
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Capítulo 1.1.3. — Validación y control de calidad de los PCR utilizado para el diagnóstico de enfermedades infecciosas
a)
Precauciones para evitar resultados positivos falsos
Los resultados positivos falsos (muestras negativas que presentan una reacción positiva), pueden
originarse, bien de restos de productos de muestras positivas o, más comúnmente, de la
contaminación cruzada por los productos de la PCR de experimentos anteriores. Se han utilizado
varias prácticas y herramientas para prevenir los resultados positivos falsos. Las muestras y las
mezclas se deben manejar en campanas de flujo laminar, que se descontaminan de forma regular
utilizando luz UV y lejía. La construcción y utilización de soportes de tubos y abridores especiales
ayuda a evitar resultados positivos falsos de la PCR. Además, se deberían aplicar prácticas de
laboratorio seguras, esto es, realizar las etapas básicas de la PCR anidada, preparación de la mezcla
y del cebador, preparación de la muestra, etc.). en áreas del laboratorio separadas (1, 2). También
es muy importante incluir controles negativos, es decir, muestras que sean tan parecidas a las
muestras de prueba como sea posible, pero sin la diana. Debería usarse al menos un control
negativo por cada cinco muestras de diagnóstico.
b)
Controles internos (miméticos) para evitar resultados negativos falsos
Los resultados negativos falsos (muestras infectadas que han resultado negativas) se deben en su
mayor parte a los efectos inhibidores y/o a los errores de pipeteo. Por tanto los controles internos
(denominados “miméticos”), se utilizan como indicadores de la eficacia de la amplificación. Los
miméticos tienen las mismas secuencias de unión a los cebadores que las del molde, pero
flanquean un fragmento de ADN heterólogo de diferente tamaño. Las secuencias idénticas de
nucleótidos de unión al cebador permiten la co-amplificación simultánea del molde y del
mimético en el mismo tubo con una competición mínima. Las diferencias de tamaño permiten
una discriminación fácil. Los controles internos aumentan la fiabilidad del diagnóstico por PCR
(1, 2). Se debe tener precaución al diseñar y validar los miméticos. Es necesario realizar muchas
pruebas para garantizar que el mimético añadido, junto con su amplificación no compite con la
PCR de diagnóstico y de este modo disminuye la sensibilidad analítica. El mimético se utiliza en
una concentración ligeramente mayor que el límite de detección de la PCR de diagnóstico a fin de
garantizar la eficacia de la prueba.
En los ensayos de la PCR en tiempo real, también es posible emplear controles internos mediante
la detección de un fragmento seleccionado del genoma del animal hospedador. Mediante la
inclusión de dicho control intrínseco, con un fluoróforo indicador específicamente coloreado, es
posible comprobar la calidad de la muestra y controlar los errores de pipeteo simultáneamente a la
detección del agente en estudio (8).
2. PREPARACIÓN DE LOS ESTÁNDARES
Los laboratorios de referencia deben proporcionar muestras estándar representativas de un agente
infeccioso dado. Dichas muestras pueden ser agentes infecciosos cultivados, especímenes clínicos, etc.,
que se distribuyen de manera que el agente infeccioso se conserve bien. De esta forma, las muestras se
distribuyen congeladas en disolventes orgánicos (por ejemplo, trizol) o de otras formas adecuadas. Las
muestras también se pueden enviar como ácidos nucleicos (congelados, secados por congelación o en
etanol). Para los detalles específicos, véase el capítulo correspondiente a cada enfermedad.
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negatives in diagnostic PCR. Mol. Cell. Probes, 10, 159–164.
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MACKAY I.M., AARDE K.E. & NITSCHE A. (2002). Real-time PCR in virology. Nucleic Acids Res., 30,
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9.
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In: OIE Quality Standard and Guidelines for Veterinary Laboratories: Infectious Diseases. OIE,
Paris, France, 53–63.
*
* *
NB: Existe un Centro Colaborador de la OIE para la aplicación de métodos de la reacción en cadena de
la polimerasa para el diagnóstico de enfermedades víricas en medicina veterinaria (en la página Web de la
OIE puede consultarse la lista actualizada de los laboratorios de referencia y centros colaboradores de la
OIE: www.oie.int).
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