5CFE01-266

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Caracterización molecular mediante SSRs de genotipos resistentes de Castanea sativa
Mill. seleccionados por resistencia a Phytophthora cinnamomi.
CUENCA, B.1, GONZÁLEZ, L.1, GONZÁLEZ, M.V.2, LÓPEZ, M.2, REY, M.3, MIGUÉNS,
J.J.2 y OCAÑA, L.4
1
Departamento de Mejora Agroforestal, Unidad de Viveros de TRAGSA, Maceda (Ourense), bcuenca@tragsa.es
2
Departamento de Fisiología Vegetal. Universidad de Santiago de Compostela. Campus Sur, 15782 Santiago de Compostela
(Coruña), e-mail: mvictoria.gonzalez@usc.es; mariaangeles.lopez@usc.es
3
Departamento de Biología Vegetal y Ciencia del Suelo, Universidad de Vigo, Campus Universitario, 36310 Vigo
(Pontevedra), e-mail: mrey@uvigo.es
4
TRAGSA. Dirección Técnica. Unidad de Viveros. C/ Maldonado 58, 4º planta 28006 Madrid. locana@tragsa.es
Resumen
El presente trabajo tiene como objetivo la identificación molecular mediante microsatélites
(SSRs) de material vegetal de castaño seleccionado por su comportamiento en campo.
El análisis molecular se ha realizado en material procedente de especies asiáticas (cultivadas y
salvajes) con las que el castaño europeo ha sido frecuentemente hibridado, y de variedades de
fruto y plantas de la región de procedencia “Montañas y Mesetas Interiores de Galicia” de C.
sativa. Hasta el momento han sido analizados, tanto en el material citado como referencia
como en los clones seleccionados, 8 microsatélites descritos por diferentes autores, bien para
especies asiáticas y cuya transferencia a C. sativa fue posteriormente testada, o bien
desarrollados directamente en C. sativa.
Seis de los 8 loci analizados produjeron alelos reproducibles y fueron utilizados para la
identificación genotípica del material de interés. El análisis de agrupamiento obtenido a partir
de las distancias genéticas generadas con los datos de microsatélites proporcionó una buena
representación del material vegetal clasificado en las 4 especies analizadas. El dendrograma
mostró dos clusters principales separados por un coeficiente de similitud de solamente 0,13.
El primer cluster agrupó los individuos de C. mollissima y C. henryi, estando cada especie a
su vez agrupada en un subcluster diferente con un coeficiente de similitud de 0,35. El otro
cluster principal constó de dos subclusters separados por un coeficiente de similitud de 0,26
que incluyen cada uno los individuos de C. crenata y C. sativa respectivamente. Todos los
individuos procedentes de la selección en campo aparecieron agrupados con los individuos de
C. sativa, excepto el material procedente de una de las selecciones de A Coruña costa.
El análisis de microsatélites permitió asignar con cierta fiabilidad los genotipos a las distintas
especies de Castanea estudiadas dado que la probabilidad de identidad y el promedio de la
frecuencia de alelos nulos fueron bajos. No obstante, para asegurar la fiabilidad de la
asignación de individuos seleccionados a una especie concreta, sería necesario ampliar la base
genética del estudio y analizar un mayor número de loci, trabajo que se está realizando en la
actualidad.
Palabras clave
Castanea sativa, microsatélites, selección en campo, resistencia a Phytophthora cinnamomi
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1. Introducción
Entre los años 2000 y 2005, el Departamento de Mejora Agroforestal de TRAGSA
realizó una selección exhaustiva de ejemplares de castaño del país por resistencia a
Phytophthora. Se emplearon los datos del III Inventario Forestal Nacional, superpuestos con
el Mapa Forestal, localizando en zonas de fuerte afección de la enfermedad, parcelas donde el
castaño fuese primera o segunda especie. Se seleccionaron un total de 206 pies candidatos
muestreando un total de 18.808,84 ha contenidas en 513 teselas del Mapa Forestal con
presencia de castaño, en las zonas 1 y 2 de regresión del castaño según BOUHIER (1979).
Estos 206 clones se establecieron en cultivo in vitro, para iniciar su propagación con el
objetivo final de proponer los genotipos resistentes al catálogo Nacional de Materiales Base.
Además de testar la resistencia, ha sido necesario desarrollar un protocolo de caracterización
que permitiese distinguir entre las diferentes especies puras del genero Castanea e identificar
los híbridos interespecíficos, para poder saber en qué medida la posible resistencia que
encontramos se debía a la presencia de genes foráneos debido a hibridaciones, o a la selección
accidental de híbridos introducidos.
Los métodos tradicionales de identificación de genotipos vegetales se basan en
descripciones morfológicas que, sin embargo, son susceptibles de errores debido a que la
expresión de las características genéticas se ve afectada por variaciones ambientales.
El desarrollo de marcadores basados en DNA ha proporcionado los suficientes
polimorfismos para identificar rápidamente individuos permitiendo incluso la construcción de
mapas genéticos.
Entre ellos, se han utilizado marcadores RAPDs para la caracterización de castaño
(GALDERISI et al., 1998; HUANG et al., 1998; KUBISIAK & ROBERDS, 2006;
SANTANA et al., 1999), y aunque este tipo de marcadores son eficientes desde el punto de
vista del coste y el tiempo de ensayo empleado, tienen la desventaja de requerir una
estandarización muy precisa del análisis para poder obtener datos reproducibles, y además
pueden ser difíciles de interpretar debido a su dominancia. En cambio, los microsatélites (en
inglés Simple Sequence Repeats, SSRs), abundantes y distribuidos uniformemente en el
genoma, tienen un mayor potencial para genotipado basado en DNA debido a su elevada
reproducibilidad, alto grado de polimorfismo y herencia codominante. Desde el punto de vista
práctico, se analizan mediante una reacción de PCR definida por una pareja única de
cebadores para cada locus a partir de una pequeña cantidad de DNA. Los productos de la PCR
se analizan mediante un secuenciador automático que convierte los resultados en datos que
permiten un eficiente y objetivo intercambio de la información obtenida entre laboratorios.
La utilización de marcadores multialélicos y codominantes para el análisis de especies
heterocigotas es muy útil, ya que permite genotipar inequívocamente individuos (POWELL et
al., 1996), lo cual es muy importante para la identificación de cultivares, la caracterización
genética de colecciones de germoplasma y poblaciones naturales, así como para la realización
de estudios filogenéticos y análisis de ligamiento.
El uso de microsatélites en castaño es escaso, principalmente debido a que su utilización
requiere un esfuerzo previo de determinación de las secuencias. Por ello en algunos casos se
utilizan microsatélites previamente identificados en especies del género Quercus (ALDRICH
et al., 2003; BARRENECHE et al., 2004; KUBISIAK & ROBERDS, 2006). No obstante, ya
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hay disponibles microsatélites propios del género Castanea (BUCK et al., 2003; GOBBIN et
al., 2007; MARINONI et al., 2003; TANAKA et al., 2005; YAMAMOTO et al., 2003),
algunos de los cuales hemos utilizado en nuestro trabajo.
2. Objetivos
El presente trabajo se enmarca dentro de un proyecto más amplio liderado por la
empresa TRAGSA y cuyo objetivo final es la selección de clones de Castanea sativa
resistentes a Phytophthora cinnamomi y con buenas características de adaptabilidad a la
Galicia interior, para su propuesta al Registro Gallego y desde él al Catálogo Nacional de
Materiales de Base. En ese objetivo global, el presente trabajo se plantea la caracterización
molecular mediante microsatélites de los diferentes individuos resultantes de la selección
como sativas puros o híbridos. Se pretende además proporcionar la huella genética de los
clones seleccionados para que sea posible el control de sus producciones en cuanto a asegurar
la identidad clonal de material propagado.
3. Metodología
Material vegetal y extracción de ADN.
Los análisis se realizaron utilizando material vegetal procedente de 3 especies asiáticas
de Castanea, C. crenata (códigos SS1-CC), C. mollisima (códigos SS1-CM) y C. henryi
(códigos SS1-CH). Se analizaron además 12 plantas adultas de C. sativa procedentes de la
Región “Montañas y Mesetas Interiores de Galicia” (códigos RP2-CS), y 7 variedades
tradicionales de fruto de esta misma especie: Blanca (clones BL2B y BL4), Amarelante (clon
AM43), Garrida (clones GA5 y GA37), Garrida de Chantada (clon GACH), Parede (clones
PA27 y PA39), Luguesa (clones LU18 y LU52), Raigona (clones RA6A y RA20).
El análisis de las 3 variedades asiáticas y de la RP2 de C. sativa se realizó a partir de
entre 9 y 12 plantas germinadas en viveros de TRAGSA y procedentes de semilla certificada.
El resto del material analizado procedía de 1 ó 2 individuos injertados con púas de 12 clones
de las 7 variedades tradicionales de fruto de C. sativa ya indicadas. Las púas para los injertos
de las diferentes variedades fueron proporcionadas a TRAGSA por el Centro de
Investigaciones e Información Ambiental de Lourizán (Pontevedra).
El análisis también incluyó 11 accesiones de plantas aclimatadas obtenidas in vitro a
partir de explantos procedentes de 4 árboles adultos procedentes de la selección por
resistencia a Phytophthora cinnamomi realizada por TRAGSA. Los árboles adultos fueron
seleccionados en zonas de costa de A Coruña (C06 y C011) y Pontevedra (P011 y P014).
El material utilizado para la extracción de ADN fueron hojas jóvenes recién brotadas y
almacenadas a -20ºC hasta su utilización. Para la extracción del ADN se utilizó el DNeasy
Plant Minikit (Qiagen, Hilde, Alemania) y se siguieron las instrucciones del fabricante. El
ADN genómico fue visualizado en un gel de agarosa y cuantificado con el Gene Tools
software package (Syngene, Cambridge, Reino Unido) usando como marcador de peso
molecular Lambda DNA/EcoRI+Hind Marker, 3 (Fermentas, Glen Burnie, Maryland, USA).
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Marcadores microsatélites.
El análisis se realizó utilizando 8 microsatélites previamente descritos por otros
autores. Así, fueron analizados los microsatélites KT002a, KT004a, KT005a y KT015a
desarrollados por YAMAMOTO et al. (2003) para C. crenata, y CsCAT1, CsCAT3, CsCAT6
y CsCAT16 descritos por MARINONI et al. (2003) para C. sativa.
Las reacciones de amplificación de los diferentes alelos fueron realizadas en un
volumen total de 20 μl de una mezcla que contenía 10 ng de ADN molde, 0.5 μM de cada
cebador, 200 μM de cada dNTP, 0.5 U de BIOTAQ TM DNA polimerasa (Bioline, London,
Reino Unido), 1.5 mM de MgCl2, en un tampón de reacción 10X (100mM Tris-HCL, pH 8.3,
500 mM KCL). El cebador “forward” de cada pareja se marcó con un fluorocromo de
diferente color (6-FAM, NED, VIC, PET) para su análisis en un secuenciador automático.
Las condiciones de amplificación de los cebadores KT002a, KT004a, KT005a y
KT015a fueron las descritas por YAMAMOTO et al. (2003) con una temperatura de
“annealing” de 52.8, 57, 50 y 50º C, respectivamente. Las condiciones de amplificación para
los otros 4 cebadores fueron las descritas por MARINONI et al. (2003). Una muestra control
fue repetida en todas las reacciones de amplificación y con todos los cebadores para asegurar
la reproducibilidad de los datos.
Los productos de las reacciones de amplificación se separaron en un secuenciador
automático ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA,
USA). La determinación del tamaño de los fragmentos obtenidos se realizó utilizando GS500
como marcador interno de tamaño molecular. El escrutinio definitivo de los alelos presentes
en cada planta analizada se realizó con ayuda del software GeneMapper versión 3.7 (Applied
Biosystems).
Análisis de los datos.
Los alelos de cada microsatélite fueron transformados en datos de presencia (1) y
ausencia (0), e incorporados a una matriz binaria. La matriz fue entonces analizada usando el
NTSYS-PC sofware, versión 2.10 (ROHLF, 1993). La similitud para datos cualitativos fue
calculada usando el índice de similitud de Dice (SNEATH & SOKAL, 1973) y la similitud
analizada mediante el método de asociación UPGMA. La agrupación resultante se visualizó
como un dendrograma. Además, el coeficiente de correlación cofenética fue calculado por
comparación de la matriz de distancia genética original con la matriz cofenética obtenida a
partir del dendrograma (ROHLF & SOKAL, 1981).
Asimismo, la heterocigosidad esperada y observada (NEI, 1973), la probabilidad de
identidad (PAETKAU et al., 1995) y la frecuencia de alelos nulos (BROOKFIELD, 1996)
fueron determinados usando el programa IDENTITY 1.0 (WAGNER & SEFC, 1999).
4. Resultados y discusión
Los resultados obtenidos hasta la fecha indicaron que 6 (KT002a, KT015a, CsCAT1,
CsCAT3, CsCAT6 y CsCAT16) de los 8 loci analizados produjeron alelos reproducibles y
pueden ser utilizados para la identificación genotípica del material de interés, mientras que los
otros dos loci (KT004a y KT005a) fueron descartados por producir más de dos alelos por
individuo.
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El análisis molecular usando los 6 microsatélites seleccionados en las 4 especies de
castaño dio como resultado un total de 81 alelos, con un promedio de 13,5 alelos por locus
(Tabla 1). El mayor número de alelos por locus se obtuvo con los loci CsCAT3, CsCAT6 y
CsCAT16, mientras que los loci descritos por YAMAMOTO et al. (2003) mostraron un
número de alelos muy inferior.
El número de alelos por locus fue muy parecido a los obtenidos por YAMAMOTO et
al. (2003) para los loci KT002a y KT015a, aunque estos autores analizaron un número de
individuos mucho menor. Teniendo en cuenta el bajo número de alelos obtenido para estos
loci, y que la mayoría de ellos son compartidos por dos o más de las especies analizadas, su
potencial para la identificación específica parece bajo.
El número de alelos por loci observados para los loci CsCAT1, CsCAT3, CsCAT6 y
CsCAT16 también fue muy parecido a los obtenidos por MARINONI et al. (2003). La
mayoría de los alelos observados en nuestros individuos de C. sativa coinciden con los
descritos por estos autores para la misma especie. Además, estos loci también amplificaron
alelos en las otras especies analizadas; los resultados obtenidos mostraron claras diferencias
en los rangos alélicos observados entre los individuos de Castanea sativa y los de C.
mollissima y C. henry, mientras que los rangos alélicos de C. sativa se solaparon total o
parcialmente con los obtenidos para C. crenata. Estos datos indican el gran potencial de estos
microsatélites para el estudio de las relaciones genéticas entre distintas especies del género
Castanea.
Tabla 1. Alelos obtenidos para los 6 microsatélites analizados en 4 especies de castaño (género Castanea).
Loci
KT002a
KT015a
CsCAT1
CsCAT3
CsCAT6
CsCAT16
C. crenata
213, 243, 245,
247, 249
168, 170, 196,
206
186, 188, 194,
214, 222
198, 202, 206,
210, 222, 224,
226, 238, 240,
260, 262
138, 160, 174,
178, 182, 184,
194
130, 132, 146,
148
Alelos (bp)
C. mollissima
C. henryi
213, 247, 249
213, 245, 247
C. sativa
213, 247
168, 190
168, 182, 188
168, 170, 196
178, 180, 184,
186,
206, 210, 212,
214, 216
178, 180, 182,
186, 192, 208
202, 204, 206,
208, 210, 220,
222
194, 208, 218, 222
134, 144, 146,
150
144, 148
156, 158, 160,
174, 186
150, 160, 170,
174, 182
224, 226, 232, 234,
236, 238, 240, 248,
250
160, 164, 166, 168,
170, 172, 174, 178,
182, 184, 190
132, 134, 136, 142,
144, 146, 150
La matriz de datos binarios construida con los datos de microsatélites se utilizó para
obtener una matriz de distancias genéticas utilizando el coeficiente de Dice. A su vez, esta
matriz se utilizó para agrupar los individuos de castaño mediante un análisis basado en el
procedimiento UPGMA. La correlación cofenética entre la matriz de distancias genéticas y la
matriz cofenética obtenida a partir de los agrupamientos fue de 0,86, indicando un buen ajuste
del análisis de agrupamiento a la diversidad genética estudiada.
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El agrupamiento obtenido se visualizó mediante un dendrograma (Fig. 1),
proporcionando una buena representación de la clasificación del material vegetal en las 4
especies analizadas. Este dendrograma contiene dos clusters principales (I y II), claramente
separados uno del otro, con un coeficiente de similitud genética de solamente 0,13. El cluster
I está a su vez dividido en dos subclusters con un coeficiente de similitud de
aproximadamente 0,35. El subcluster I.A agrupa todas las plantas de C. crenata mientras que
el I.B agrupa todas las plantas de C. sativa, tanto las obtenidas en la región de procedencia
interior (RP2) como las variedades de fruto. Estos resultados revelan que las plantas
analizadas de C. sativa están más relacionadas con la especie japonesa, C. crenata, que con
las otras dos especies asiáticas.
El cluster II también se divide en dos subclusters con un coeficiente de similitud de
alrededor de 0,26. El subcluster II.A agrupa todos los individuos analizados de la especie
originaria de China, C. mollissima, mientras el II.B incluye todos los de C. henryi, excepto el
clon SS1-CH10 que se agrupa con C. mollissima. Esto puede deberse a un error de etiquetado
de la muestra, o bien a una mezcla de las semillas de las diferentes especies en el momento de
la germinación.
El agrupamiento mostrado en el dendrograma apoya los resultados de YAMAMOTO et
al. (2003) cuyos análisis mediante microsatélites ya revelaron que las accesiones japonesas de
Castanea eran muy diferentes de las accesiones chinas, mientras que no existían diferencias
respecto a que el origen de C. crenata fuese Japón o Corea.
Por otra parte, las plantas seleccionadas por su resistencia a Phytophthora aparecen
incluidas en el cluster II.B que incluye todo el material vegetal de C. sativa. Únicamente una
de las accesiones procedentes de la provincia de A Coruña (CO11) aparece incluida junto con
los individuos de C. crenata. Este hecho no es especialmente sorprendente ya que en Galicia
se han desarrollado programas de hibridación entre C. sativa y especies asiáticas buscando la
generación de híbridos con resistencia a la enfermedad de la tinta.
La fiabilidad de la asignación de individuos seleccionados a una especie concreta
mejoraría ampliando la base genética del estudio y el número de loci analizados, trabajo que
se está realizando en la actualidad.
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SS1-CC4
SS1-CC5
SS1-CC6
CO11-1
CO11-2
CO11-3
SS1-CC1
SS1-CC2
SS1-CC8
SS1-CC10
SS1-CC9
SS1-CC7
RP2-CS4
RP2-CS10
RP2-CS5
RP2-CS7
RP2-CS9
RP2-CS8-1
RA6A-1
PA27-1
GA5-2
GA5-1
AM43-2
AM43-1
RP2-CS6
BL4-1
BL4-2
PA39-1
PA27-2
BL2B-1
BL2B-2
LU52-1
LU52-2
LU18-1
RP2-CS12
RP2-CS1
RP2-CS11
CO6-1
CO6-2
CO6-3
RP2-CS3
RP2-CS2
GA37-2
GA37-1
GACH-2
GACH-1
RA20-1
PO14-2
PO14-3
PO11-1
PO11-2
PO11-3
SS1-CM1
SS1-CM2
SS1-CH10
SS1-CM3
SS1-CM6
SS1-CM4
SS1-CM5
SS1-CM9
SS1-CM7
SS1-CM10
SS1-CM8
SS1-CH5
SS1-CH3
SS1-CH4
SS1-CH6
SS1-CH19
SS1-CH2
SS1-CH7
SS1-CH12
SS1-CH16
SS1-CH11
SS1-CH9
SS1-CH1
0,13
0,35
0,57
0,78
1,00
Coeficiente de Dice
Figura 1. Dendrograma representativo de la similitud genética entre 75 muestras de 4 especies de castaño. El dendrograma
se ha obtenido utilizando el método de agrupamiento UPGMA basado en el coeficiente de similitud genética de Dice
obtenido mediante los datos de microsatélites.
5. Agradecimientos
Este trabajo se ha realizado gracias a la financiación de un proyecto por la Xunta de
Galicia (07MRU003E). También agradecemos a Belén Caride por la ayuda técnica en el
desarrollo de este trabajo. Los autores también desean agradecer al Departamento de Genética
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de la Universidad de Santiago de Compostela, y en particular a Jaime Castro y María L. Villar
por su ayuda en el análisis de fragmentos.
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