al DNA

¿Cuál de estas 3 posibilidades de replicación es la
que ocurre?
Marcaje del DNA
bacteriano con N15
Experimento de
Meselson-Stahl
(1958)
1. Bacteria crecida en
N14
2. Bacteria crecida en
N15
3. Incubación en
presencia de N14
4. Centrifugación de
generaciones
sucesivas
CONCLUSIÓN: La Replicación es semi-conservativa
La replicación es catalizada por:
DNA polimerasa
• Las DNA polimerasas añaden dNTPs
complementarios a una cadena molde
• Se necesita un 3’OH libre para que las
DNA polimerasas actúen (cebador)
• Las DNA polimerasas requieren Mg2+
como cofactor
Se produce un ataque nucleofílico del
3’OH al fosfato  del dNTP entrante
Reacción básica de la replicación de DNA
DNA polimerasa
(DNA)n+1 + PPi
DNAn + dNTP
Mg2+
dNTP



DNAn
molde
PPi
(DNA)n+1



¿Dónde comienza la replicación?
¿En una molécula circular de doble cadena, en qué
sentido ocurre la replicación?
¿Además de la polimerasa hay otras moléculas
involucradas en replicación?
?
La REPLICACIÓN comienza en una secuencia
llamada ORIGEN y es BIDIRECCIONAL
Hay DOS Horquillas de replicación en sentido opuesto
• Cada cadena de DNA original sirve de molde para una
cadena nueva
• Los precursores son desoxiribonucleósidos 5’ TRIfosfato (dNTPs: dATP, dTTP, dGTP, dCTP)
• Las cadenas de DNA originales se separan y se
sintetiza la complementaria de cada una de manera
simultánea
• La replicación comienza en una secuencia llamada
Origen
•La DNA polimerasa requiere de un cebador que
proporcione el 3’OH para la catálisis
•Se requiere la función de otras enzimas además de la
DNA polimerasa durante la replicación
Origen de Replicación bacteriano OriC
En bacteria hay un solo origen de replicación
Secuencias repetidas en
tandem (13 pb)
Cajas DnaA (9 pb)
1.
Activación por metilación de A en GATC
2.
Unión de DnaA “abre el DNA”
3.
Unión de DnaB y DnaC- actividad helicasa
ATP dependiente
4.
Unión de SSB para mantener separadas las
cadenas de DNA
DNA B (helicasa)
Rompe los puentes
de hidrógeno
entre las bases y
separa las dos
hebras
La HELICASA es un hexámero que utiliza
ATP para romper puentes de hidrógeno
en el DNA
Proteínas de unión a cadena sencilla
(SSB) mantienen las hebras separadas
La unión de SSB es cooperativa y ayuda a la
polimerasa facilitando su actividad
5. Síntesis de Cebador de RNA
6. Polimerización de DNA
1. Primasa
2. Polimerasa
RNA
DNA polimerasas de bacterias
Exonucleasa
Pulgar
Palma
La estructura de las polimerasas asemeja un mano que agarra el
DNA y lo sujeta firmemente mientras va tejiendo la nueva hebra
Actividad de polimerasa
5’ 3’
Actividad de
exonucleasa 3’ 5’
La fidelidad de la DNA polimerasa
III es de 109
El cromosoma
bacteriano tiene
DOS horquillas de
replicación activas
Cada horquilla
tiene una cadena
que crece de
manera continua y
otra discontinua
Ambas cadenas
crecen en dirección
5’
3’
Esquema de la horquilla que va en contra-sentido
de las manecillas del reloj
Hebra “guía”
Fragmentos de Okazaki
Hebra
“retrasada”
El crecimiento de ambas cadenas es en sentido 5’
3’
En cada horquilla de replicación, la DNA pol III es la que replica
las dos hebras al mismo tiempo.
La replicación de la hebra retrasada se interrumpe cada 1000 nt
aproximadamente
Subunidades de la DNA polimerasa III de E. coli
Sub
# por
holoenzima
Mr
Función

2
132,000
Actividad polimerasa

2
27,000
Exonucleasa 3’5’

2
10,000
Se requiere para la union de
DnaB

2
71,000

1
52,000

1
35,000
’
1
33,000

1
15,000

1
12,000

4
37,000
Unión estable al molde,
dimerización del núcleo
Complejo que carga las
subunidades  al DNA
Pinzas que forman una rueda
(abrazadera) sobre el DNA
y aseguran óptima
procesividad
Núcleo de
la
polimerasa
Modelo del
dímero
La DNA pol III es
altamente procesiva
gracias a las
subunidades  que
forman una abrazadera
El complejo γ monta
a la abrazadera
sobre el DNA en
cada hebra
proteínas 
(abrazadera)
complejo 
La DNA polimerasa III es muy procesiva
gracias a la abrazadera (subunidades β)
Video
DNA polimerasas en E. coli
Pol I
Pol II
pol III
gen
pol A
polB
polC
PM (kDa)
103
90
130
mol/cél.
400
100
10
Vmax
20 nt/s
3 nt/s
750 nt/s
3' exonucl.
+
+
+
5' exonucl
+
no
no
10000
500000
procesiv.
3-200
DNA polimerasa I
La DNA pol I rellena los
espacios entre fragmentos
de Okazaki
Utiliza actividad
exonucleasa 5’3’ para
eliminar cebador de RNA
DNA ligasa
La DNA ligasa sella un enlace fosfodiester cuando ya no falta
ningún nulceótido por añadir
La replicación causa
superenrollamiento
Las topoisomerasa Girasa alivia la
tensión
Terminación de la replicación
Topoisomerasa IV
participa en la
terminación de la
replicación de
moléculas circulares.
Cómo se asegura la célula que su DNA se
replica solo una vez?
Patrones de metilación del DNA
Las enzimas Dam
metilasas regulan
el inicio en el
origen de
replicación