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ORIGINALES
La concentración de ácido hialurónico citosólico
define ciertas propiedades clinicobiológicas
del carcinoma ductal infiltrante
de mama CD44v5 positivo
Álvaro Ruibala,b, José Ignacio Ariasc, M. Carmen del Ríod,
Juan Manuel San Románe, Gregoria Lapeñaa, José Schneiderb,f
y Armando Tejerinab,f
Servicio de Medicina Nuclear. aFundación Jiménez Díaz. Madrid. bFundación Tejerina.
c
Servicio de Cirugía General. Hospital Monte del Naranco. Oviedo. dServicio de Bioquímica.
Hospital de Barbanza. Ribeira. La Coruña. eServicio de Cirugía. Fundación Jiménez Díaz.
Madrid. fCentro de Patología de la Mama. Madrid.
FUNDAMENTO: El ácido hialurónico es uno de los ligandos de la molécula de adhesión CD44. En
este estudio hemos querido analizar si su concentración citosólica podía modular ciertos parámetros clinicobiológicos en el carcinoma ductal infiltrante (CDI) de mama CD44v5+.
PACIENTES Y MÉTODOS: Hemos determinado, mediante un método de radioligando, las concentraciones citosólicas de ácido hialurónico en 127 casos. Así mismo, dosificamos los valores citosólicos de receptor de estrógenos, progesterona, pS2, catepsina D y activador del plasminógeno
tipo tisular (t-AP), así como las del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) en las
membranas celulares. Se tuvieron presentes también el estado menopáusico, tamaño, invasión
ganglionar axilar, grado histológico, ploidía y fase de síntesis celular.
RESULTADOS: Los CDI con ácido hialurónico positivo (> 4.800 ng/mg de proteína) que representa
la mediana obtenida en 252 CDI, cursaron con mayores concentraciones de receptores de progesterona (p = 0,035) y t-AP (p = 0,000), mientras que los CDI con ácido hialurónico negativo
mostraron con mayor frecuencia un tamaño superior a 2 cm (p = 0,015), aneuploidía (p =
0,002) y una fase S mayor del 14% (p = 0,019), así como un grado histológico 3 que rozó la
significación estadística (p = 0,062), indicadores todos ellos de un peor comportamiento y evolución.
CONCLUSIONES: Los resultados anteriores indican que, como ocurre con el de membrana, la concentración del ácido hialurónico citosólico parece modular ciertas propiedades clínicobiológicas
del CDI/CD44v5+, lo que realza el papel de ambos parámetros y podría ayudar a explicar algunas discordancias descritas en la bibliografía acerca de su interés práctico cuando se consideran aisladamente cada uno de ellos.
Palabras clave: Carcinoma ductal; Ácido hialurónico; Parámetros clinicobiológicos; Citosol.
The cytosolic hyaluronic acid level defines some clinical-biological properties
of CD44v5-positive infiltrating ductal carcinomas of the breast
BACKGROUND: The hyaluronic acid (HA) is a ligand of CD44 adhesion molecule. In this work, we
study if the cytosolic level of this proteoglycan can modulate certain clinical-biological properties at CD44v5-positive infiltrating ductal carcinomas (IDC) of the breast.
PATIENTS AND METHODS: We have assayed, by a radioligand method, the cytosolic level of hyaluronic acid in 127 IDC. Likewise, cytosolic levels of estrogen receptors (ER), progesterone receptors (PR), pS2, cathepsin D and tissu.-type plasminogen activators (t-PA) have been dossified,
as well as those of epidermal growth factor receptor (EGFR) at cell surfaces. The menopausal
status, tumor size, axillary lymph node involvement, histological grade, ploidy and S-phase
have also been taken into account.
RESULTS: HA positive (> 4800 ng/mg prt., which represents the median value obtained with 252 tumors) carcinomas had higher levels of PR (p = 0.035) and t-PA (p = 0.000), whereas HA negative showed a higher frequency of a tumor size > 2 cm (p = 0.015), aneuploidy (p = 0.015)
and S-phase > 14% (p = 0,019), as well as histological grade 3 which reached statistical significance (p = 0.062), all of which were indicators of a worse behaviour and evolution.
CONCLUSIONS: Our results suggest that, as it also happens with that of the cell surface, cytosolic
HA levels seems to modulate certain clinical-biological features of CD44v5-positive infiltrating
ductal carcinomas of the breast. Likewise, they can help us to explain the discordant results
described at the literature concerning its practical value when each of them are considered separately.
Med Clin (Barc) 2000; 115: 205-207
Correspondencia: Dr. A. Ruibal.
Servicio de Medicina Nuclear. Fundación Jiménez Díaz.
Avda. Reyes Católicos, 2. 28040 Madrid.
Recibido el 17-1-2000; aceptado para su publicación el 8-6-2000
El CD44 es una molécula de adhesión celular que interviene en numerosas funciones biológicas, entre las que destacan el
movimiento celular, la hematopoyesis y la
apoptosis1,2. Su gen consta de 20 exones,
de los cuales los cinco primeros y los cinco últimos son constantes, mientras que
los otros 10 pueden sufrir procesos de
partición (splicing) alternativos, lo que
comporta la génesis de regiones e isoformas variantes (CD44v)3. Así mismo, su
expresión está regulada por la vía de la
fosfolipasa D y la proteincinasa C4. La presencia de la forma estándar (CD44s) o sus
variantes se asocia con ciertas propiedades clinicobiológicas, indicadoras de un
mejor o peor pronóstico según cual sea el
tumor analizado5-10. El principal ligando
del CD44 es el ácido hialurónico (AH),
proteoglicano de la matriz extracelular e
implicado en la angiogénesis y en el proceso invasivo-metastásico de los tumores,
ya sea directamente, a través de la hialuronidasa, o merced a ciertas interleucinas
o metaloproteasas11,12.
En relación con la isoforma CD44v5, en
los carcinomas mamarios existen ciertas
discordancias en la bibliografía. Así, Hefler et al13 consideran que su expresión
está regulada positivamente durante el
proceso de transformación neoplásico,
no siendo necesaria para adquirir el fenotipo metastásico; sin embargo, aquélla no
se correlacionó con otros parámetros clinicobiológicos ni fue un factor pronóstico.
Tempfer et al14 observan que la supervivencia libre de enfermedad a los 5 años
era mayor en los casos CD44v5+ que en
los CD44v5-, pero la molécula de adhesión tampoco demostró ser un factor
pronóstico independiente. En estudios
previos15,16, nuestro grupo pudo comprobar que, en los carcinomas ductales infiltrantes (CDI) de mama, la expresión del
CD44v5 se asociaba sólo con la positividad para los receptores de progesterona
y un tamaño tumoral mayor de 2 cm.
Un aspecto de enorme interés biológico
radica en el hecho de que el CD44 interviene activamente en la unión y degradación del AH, correlacionándose este hecho con la cantidad de receptor y el
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MEDICINA CLÍNICA. VOL. 115. NÚM. 6. 2000
potencial invasivo celular17. Así mismo,
este receptor promueve la supervivencia
de las células tumorales, de tal modo que
su supresión induce la apoptosis celular,
posiblemente por disminución de su habilidad para penetrar en las barreras del
AH del huésped18.
Dada la discordancia respecto al interés
del CD44v5 en los tumores mamarios según los diferentes grupos por lo que se
refiere a que el principal ligando del
CD44 es el ácido hialurónico, el efecto de
la interrelación CD44-AH en el proceso
invasivo y que la concentración de este
último en membrana modula ciertas propiedades clinicobiológicas de los carcinomas ductales infiltrantes de mama
CD44v5+19, nos pareció interesante estudiar si también la concentración citosólica de este último podía hacerlo, lo que
apoyaría el papel de este proteoglicano
en el significado biológico de la isoforma
variante del CD44.
Pacientes y métodos
El grupo del estudio incluyó a 127 pacientes afectadas de carcinomas ductales infiltrantes de mama
CD44v5+, de las cuales 61 fueron AH+, utilizando
como dintel la cifra de 4.800 ng/mg de proteína (prt.),
que representa la mediana obtenida en un grupo de
252 tumores del mismo tipo histológico.
Las muestras tisulares fueron limpiadas de sus componentes grasos, congeladas y almacenadas en nitrógeno líquido hasta su homogeneización. Ésta se realizó en un buffer (TRIS, 0,1 M; EDTA Na2, 0,015 M;
glicerol al 10%; monotioglicerol, 0,01%; pH, 7,5) y en
frío mediante un microhomogeneizador (OMNI 1000,
Waterbury, CT, EE.UU), siendo después centrifugadas
las muestras a 1.500 rpm durante 10 min, y posteriormente el sobrenadante se sometió a una ultracentrifugación a 100.000 g durante una hora a 4 ºC. El
nuevo sobrenadante (citosol) se utilizó para la determinación de los receptores de estrógenos (EIA. Abbott. EE.UU), de progesterona (EIA, Abbott, EE.UU),
pS2 (IRMA, CIS Biointernacional, Francia), catepsina
D (CAT-D) (IRMA, CIS Biointernacional, Francia), activador del plasminógeno tipo tisular (t-AP) (EIA, Boehringer Mannheim, Alemania) y AH (RIA, Pharmacia,
Suecia). El precipitado (pellet) fue empleado para determinar el receptor del factor de crecimiento epidémico (EGFR) (RLG, Viennalab, Austria) y CD44v5
(EIA, Bender Med-System, Austria), cuyo dintel de
positividad se estableció en 3 ng/mg prt.16. La ploidía
y fase de síntesis (fase S) fueron medidas por citometría de flujo (Bencton Dickinson, Fascam) a partir de
muestras en fresco. Así mismo, se tuvieron presentes
el tamaño, la afección ganglionar axilar, el grado histológico y el estado menopáusico. Los resultados fueron expresados por miligramos de proteína, determinada mediante el método de Bradford. Los dinteles
de positividad para los diferentes parámetros fueron,
basándonos en nuestra experiencia, los siguientes: 10
fmol/mg prt. para los receptores de estrógenos y de
progesterona; 5 ng/mg prt. para la pS2; 50 pmol/mg
prt. para la catepsina D; 4,5 fmol/mg prt. para el
EGFR; 3 ng/mg prt. para el CD44v5, y el 7 y el 14%
para la fase de síntesis celular.
El estudio estadístico se realizó mediante el programa
BMDP3; como los diferentes parámetros biológicos
no siguieron una distribución normal, hemos empleado pruebas no paramétricas, así como de la χ2. Por
ello, los resultados se han expresado mediante el intervalo y la mediana. Se consideró estadística una diferencia cuando el valor de p fue menor de 0,05.
Resultados
Tal como se observa en las tablas 1 y 2,
los CDI con AH positivo presentaron ma-
206
TABLA 1
Distribución de las concentraciones de los diferentes parámetros clinicobiológicos
en los dos subgrupos de tumores CD44v5+
AH+
Parámetro
RE
RP
pS2
EGFR
CAT
t-AP
Fase S
AH–
p
Intervalo
Mediana
0,1-1.248
0,1-1.250
0,1-214
0,6-105
1,5-1.145
0,1-54,0
0,9-24,0
24,0
28,4
5,5
4,3
43,2
6,2
5,2
NS
0,035
NS
NS
NS
0,000
0,026
Intervalo
Mediana
0,1-482
0,1-582
0,1-241
0,4-56,1
1,6-1.139
0,1-40,8
1,2-21,2
19,3
15,4
6,4
3,6
44,7
2,5
6,8
RE: receptor de estrógenos; RP: receptor de progesterona; EGFR: receptor del factor de crecimiento epidérmico; CAT: catepsina;
t-AP: activador del plasminógeno tipo tisular; fase S: fase de síntesis; AH: ácido hialurónico; NS: no significativa.
TABLA 2
Distribución de los porcentajes de positividades en los diferentes parámetros
clinicobiológicos en los dos subgrupos de tumores CD44v5+
Parámetro
N+
> 2 cm
> 5 cm
Aneuploides
GH3
Premenopausia
Metástasis
CAT+
EGFR+
Fase S > 7%
Fase S > 14%
RE+
RP+
pS2+
CAT+
AH+
p
AH–
27/61
22/61
1/61
14/61
13/61
23/61
0/61
24/61
30/61
27/61
6/61
43/61
42/61
44/61
24/61
NS
0,015
NS
0,002
0,062
NS
NS
NS
NS
NS
0,019
NS
0,068
NS
NS
32/66
38/66
2/66
32/66
24/66
18/66
3/66
30/66
25/66
31/66
17/66
39/66
35/66
41/66
30/66
Abreviaturas como en la tabla 1.
yores concentraciones de receptores de
progesterona (intervalo, 0,1-1.250; mediana, 28,4 frente a intervalo, 0,1-582;
mediana 15,4 fmol/mg prt.; p = 0,035) y
pS2 (intervalo, 0,1-54,0; mediana 6,2,
frente a intervalo 0,1-40,8; mediana
2,5 ng/mg prt.; p = 0,000). Por el contrario, los casos con AH-negativo mostraron
con mayor frecuencia un tamaño superior
a 2 cm (38/66 frente a 22/61; p = 0,015),
aneuploidía (32/66 frente a 14/61; p =
0,002), grado histológico 3 (24/66 frente
a 13/61; p = 0,062) y una fase de síntesis
superior al 14% (17/66 frente a 6/61;
p = 0,019).
Discusión
El CD44 es miembro de una nueva familia
de moléculas de membrana que intervienen activamente en la adhesión celular. Su importancia como factor pronóstico depende de la forma utilizada (estándar
o variantes) y del tumor analizado20-23. En
la mama, el CD44s ha demostrado su utilidad para predecir la capacidad invasiva en
los tumores pequeños24, y en nuestra experiencia fue factor pronóstico independiente, junto con el grado histológico y el
Ki67, para predecir la afección ganglionar
en los casos con un tamaño inferior a 2
cm25. De las isoformas variantes, unas se
asocian a mal26,27 o buen pronóstico28,29, y
otras presentan resultados contradictorios,
siendo el CD44v5 un ejemplo de ello. En
general, se acepta que su expresión se incrementa con la transformación tumoral1316
, pero su valor pronóstico y utilidad como
factor predictivo están por establecer.
La mayoría de los trabajos realizados sólo
estudian la expresión de la isoforma, sin
prestar atención a su ligando principal: el
ácido hialurónico. Este proteoglicano de
la matriz extracelular está asociado a la
génesis y evolución de los tumores mamarios11,12 y sabemos que, tras su unión
al CD44, se internaliza celularmente y se
degrada, fenómeno este que se asocia a
una mayor proliferación y agresividad17.
Si el efecto biológico final parece ser consecuencia del balance AH/CD44 y no de
cada uno de estos parámetros aisladamente, lo que está apoyado por los hallazgos en ciertos tumores cerebrales30,
nos pareció interesante estudiar si la concentración de AH era capaz de modular
ciertas propiedades clinicobiológicas de
los carcinomas ductales infiltrantes de
mama CD44v5 positivos. En un estudio
previo19, pudimos observar que los tumores CD44v5+ con poco AH de membrana
mostraban más frecuentemente grado
histológico 3, aneuploidía y catepsina D
positiva, fenómenos todos ellos asociados
a un peor comportamiento y evolución31-33. Tras estos hallazgos, quisimos
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A. RUIBAL ET AL.– LA CONCENTRACIÓN DE ÁCIDO HIALURÓNICO CITOSÓLICO DEFINE CIERTAS PROPIEDADES
CLINICOBIOLÓGICAS DEL CARCINOMA DUCTAL INFILTRANTE DE MAMA CD44v5 POSITIVO
analizar también si el AH citosólico, que
refleja el tejido tumoral y la estroma vecino, mostraba el mismo comportamiento
biológico.
Los CDI-CD44v5+ fueron clasificados en
dos grandes grupos en función de una
concentración de AH citosólica de 4.800
ng/mg prt., cifra que se corresponde con
la mediana observada previamente en 252
CDI de mama (intervalo, 526-58.139). Los
tumores AH+ presentaron mayores concentraciones de receptor de progesterona
(p = 0,035) y de t-AP (p = 0,000), siendo
más frecuentemente positivos para el receptor de progesterona (p = 0,068). Por el
contrario, los tumores AH- presentaron
más frecuentemente un tamaño superior a
2 cm (p = 0,015), aneuploidía (p = 0,002)
y una fase de síntesis superior al 14% (p =
0,019), así como una tendencia, casi significativa (p = 0,062), a poseer un gran
histológico 3. También cursaron con mayores valores globales de fase de síntesis
celular (p = 0,026).
Estos resultados indican que los casos
AH+ son más dependientes de las hormonas y diferenciados, pues cursaron con
mayores concentraciones de receptores de
progesterona y t-AP, parámetros ambos ligados a la maquinaria estrogénica e indicadores de un mejor comportamiento y
evolución34-37. Por el contrario, los casos
AH- presentaron un mayor tamaño y cursaron más frecuentemente con aneuploidía, grado histológico 3 y una mayor proliferación celular, hechos que se asocian
con un peor comportamiento y evolución31,32,38-40. Estos resultados son similares
a los observados con el AH de membrana
y refuerzan el papel de la relación
AH/CD44v5 en la biología y evolución de
los CDI de mama. Un hecho que queda
por establecer es si ello tienen significación
pronóstica y si persiste cuando se consideran la forma estándar u otras isoformas.
Los resultados anteriores apuntan a que,
como ocurre con el de membrana, la
concentración del AH citosólico parece
modular ciertas propiedades clinicobiológicas de los CDI-CD44v5+, lo que realza
el papel de ambos parámetros y podría
ayudar a explicar algunas discordancias
descritas en la bibliografía acerca de su
interés práctico cuando se considera aisladamente cada uno de ellos.
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