laboratorio de microbiologia - Universidad Técnica Federico Santa

Universidad Técnica Federico Santa María
Departamento de Ingeniería Química y Ambiental
Laboratorio de Microbiología
Practico N° 2
“REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES, MEDIOS DE CULTIVOS Y
SIEMBRA DE MICROORGANISMOS”
Todas las formas de vida, desde los microorganismos a los seres humanos,
comparten ciertos requerimientos nutricionales en lo que se refiere a las sustancias
químicas necesarias para su crecimiento y funcionamiento normal. Debemos tener
presente que en la naturaleza existe una gran variedad de tipos de requerimientos
nutricionales entre las bacterias.
Los organismos toman de su ambiente los materiales necesarios para todas las
reacciones metabólicas, dichos elementos se denominan NUTRIENTES y son los que
les permiten a los microorganismos sintetizar su material celular y generar energía. Los
nutrientes se pueden clasificar en:
1.- Nutrientes indispensables: sin los que la célula no puede vivir
2. Nutrientes no indispensables: los cuales son utilizados si están presentes, pero no
son esenciales.
3.-Macronutrientes: cuando se requieren en gran cantidad.
4.-Micronutrientes: cuando se requieren en pequeñas cantidades. Con frecuencia, son
requeridos a tan pequeña concentración que es difícil determinar exactamente la
cantidad requerida y otras veces pasa desapercibido el requerimiento de un determinado
micronutriente por no ser detectable.
5.-Nutrientes con fines energéticos: no son incorporados directamente en el material
celular y al ser degradados liberan energía.
6.- Nutrientes con fines estructurales: con los que la célula sintetiza macromoléculas y
otras estructuras.
En general las vías asimiladoras de nutrientes de los microorganismos, reflejan al
ambiente natural en el cual viven. De acuerdo a la fuente de energía y a la fuente de
carbono, los microorganismos pueden clasificarse:
a) Quimioheterótrofo: aquellos que ocupan un compuesto orgánico tanto como fuente
de energía, como de carbono. También son llamados “Organotrofos”.
b) Quimiolitótrofos: aquellos que ocupan un compuesto inorgánico como fuente de
energía y CO2 como fuente de carbono. También son llamados “litótrofos”.
c) Fotoheterótrofos: aquellos que ocupan luz como fuente de energía y compuestos
orgánicos simples como fuente de carbono.
d) Fotoautótrofos: aquellos que ocupan luz como fuente de energía y CO2 como fuente
de carbono. También son llamados “autótrofos”.
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Estas dos últimas categorías son conocidas también como “Fotótrofos”.
Como puede verse, el conocimiento del hábitat de un organismo es una ayuda
práctica para hacer un medio de cultivo específico para un microorganismo recién
aislado. Sin embargo, no debe pensarse que el medio de cultivo es un duplicado del
ambiente natural, ya que su objetivo en el laboratorio es obtener, para el trabajo
experimental, poblaciones de células generalmente muchos mayores que las que se
encuentran en la naturaleza.
Ejemplos de organismos que emplean diferentes tipos de producción de energía y
fuentes de carbono:
- Quimiohetrótrofos: animales, la mayoría de las bacterias, hongos y protozoos.
- Quimiolitótrofos:
bacterias del hidrógeno, bacterias sulfurosas incoloras, bacterias
nitrificantes, bacterias férricas.
- Fotoheterótrofos:
pocas algas, la mayoría de las bacterias púrpuras y verdes,
algunas Cianobacterias.
- Fotoautótrofos:
plantas verdes, la mayoría de las algas, Cianobacterias, algunas
bacterias púrpuras y verdes
Los organismos vivos requieren carbono en alguna forma, todos requieren al menos
pequeñas cantidades de CO2, pero la mayoría requiere algunos compuestos orgánicos de
carbono, tales como azúcares y otros carbohidratos. Las plantas utilizan el CO2 y lo
convierten en carbohidratos mediante la fotosíntesis. Muchas bacterias requieren
también sólo CO2 como única fuente de carbono. Hablando en términos nutricionales,
todos estos organismos son autótrofos. Otras bacterias son nutricionalmente semejantes
a los animales, en el sentido de que no pueden utilizar el CO2 como única fuente de
carbono y dependen de los autótrofos para la producción de carbohidratos y otros
compuestos orgánicos, que luego ellos utilizan como alimentos. Los microorganismos
que requieren compuestos orgánicos como fuente de carbono son heterótrofos.
Todos los organismos vivos requieren nitrógeno, en alguna forma. Las plantas utilizan
el nitrógeno en forma de sales inorgánicas de nitrato de potasio, en tanto que los
animales requieren compuestos orgánicos, de nitrógeno tales como las proteínas y sus
productos de degradación, es decir péptidos y ciertos aminoácidos. Las bacterias son
extremadamente versátiles en este aspecto, algunos tipos utilizan nitrógeno atmosférico,
algunas utilizan compuestos inorgánicos de nitrógeno y otras requieren nitrógeno
procedente de compuestos orgánicos nitrogenados.
El requerimiento animal típico de azufre se satisface como compuestos orgánicos de
azufre mientras que el requerimiento típico vegetal de azufre se satisface con
compuestos inorgánicos de azufre. Algunas bacterias requieren compuestos orgánicos
de azufre, algunas son capaces de utilizar azufre elemental. El fósforo lo proporcionan
usualmente los fosfatos, por ejemplo sales de ácido fosfórico.
Los organismos vivos requieren varios elementos metálicos como sodio, potasio, calcio,
magnesio, hierro, cobre y cobalto entre otros para su crecimiento normal. Las bacterias
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no son una excepción. Las cantidades requeridas son usualmente simples vestigios y se
miden en partes por millón.
Las vitaminas son necesarias para los organismos vivos, la mayoría de éstas participan
en la formación de sustancias que activan a las enzimas. Los animales, incluidos los
seres humanos, deben recibir estas sustancias en la dieta. Las bacterias muestran un
patrón variable en este aspecto de la nutrición aunque todas las bacterias requieren
vitaminas en sus procesos metabólicos normales, algunas son capaces de sintetizar sus
requerimientos totales de vitaminas a partir de otros compuestos del medio. Otras no
crecerán a menos que se les proporcione en el medio, una o más vitaminas preformadas.
Todos los organismos requieren agua para sus funciones metabólicas y para su
crecimiento. En el caso de las bacterias, todos los nutrientes deben estar en solución
para que puedan penetrar en el organismo.
Los nutrientes que se utilizan dependen del tipo de bacteria. El siguiente cuadro
presenta un resumen según sus requerimientos específicos:
Fuentes de:
Energía
Carbono
Nitrógeno
Azufre
Iones
inorgánicos
Sales
AUTÓTROFOS
luz
CO2, CO3
HETERÓTROFOS
UTILIZACIÓN
Oxidación, fermentación
glucosa,
lactosa,
ác.
pirúvico, almidón, celulosa
peptonas,
extracto
de
levadura y carne
Síntesis
de
compuestos
carbonados
N2, NH3, NO2, NO3
Síntesis
de
compuestos
nitrogenados: aminoácidos, bases
nitrogenadas, etc.
SO4, S, H2S
aminoácidos
azufrados: Síntesis de otros aminoácidos
metionina, cisteína y cistina azufrados y CoA
iones disueltos: Fe+2, iones disueltos: Kg+, Mg+, Cofactores enzimáticos
Fe+3 y Ca+2
Mn+, Na
Sulfatos (síntesis de aá sulfurados); fosfatos (aá Como sustancias
fosfatados); carbonatos (aá carbonados y tampones); amortiguadoras de pH.
cloruros (equilibrio iónico de Na – K).
CULTIVO
Cultivo es el procedimiento a través del cual se crean en el laboratorio de microbiología
las condiciones ambientales adecuadas con el fin de promover el crecimiento de los
microorganismos.
Uno de los procedimientos más importantes para identificarlos es observar su
crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. Este
material alimenticio en el cual crecen es el MEDIO DE CULTIVO.
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Conceptos de Medio de Cultivo.
Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros
componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los
microorganismos. Es decir, es un soporte que proporciona sustancias nutritivas que
permitan el desarrollo y reproducción de microorganismos. La diversidad metabólica de
los microorganismos es enorme, por ello, la variedad de medios de cultivo también lo
es, no existiendo un medio de cultivo universal adecuado para todos ellos.
El conocimiento de las necesidades nutritivas y físicas de los microorganismos es
fundamental para seleccionar un medio de cultivo adecuado.
Los requisitos que debe reunir el cultivo de un microorganismo tienden a reproducir el
ambiente natural en el que se desarrollan.
Las características de los microorganismos a tener en cuenta al momento de preparar un
medio de cultivo adecuado para su desarrollo en el laboratorio son:




Tipo trófico: se refiere a los requerimientos de carbono y energía.
Tipo respiratorio: aerobios, anaerobios, anaerobios facultativos y microaerófilos.
Temperatura óptima de crecimiento
Rango de pH: en general el rango óptimo de pH
Un buen medio de cultivo es aquel que le provee a los microorganismos los nutrientes
indispensables en la concentración adecuada, cantidad necesaria de sales y agua, que
tenga la consistencia y el pH adecuados, que sea estéril y que no contenga sustancias
inhibidoras.
La adición de elementos nutritivos en concentración adecuada, depende del
conocimiento que se tenga de las condiciones del desarrollo en el hábitat natural.
La cantidad de sales y agua que se agregue a un medio de cultivo, se relaciona
directamente con el pH y la presión osmótica que se le quiera brindar a los
microorganismos.
En función de la consistencia se puede clasificar a los medio en líquidos, semisólidos y
sólidos. En el laboratorio, los medios de cultivo pueden presentarse en forma líquida, en
cuyo caso se los denomina caldos, o en forma sólida si se le agrega agar.
En cuanto a la esterilización, este procedimiento garantiza la destrucción de todos los
microorganismos no deseados que se encuentran presentes durante la preparación del
medio de cultivo. Si los componentes del medio son estables al calor se los lleva al
autoclave (121 ºC, 15 minutos). Si se requiere sangre u otros componentes inestables,
como antibióticos y compuestos fácilmente oxidables al calor, se los esteriliza por
separado por otros procedimientos y se lo agrega al medio que ha sido esterilizado
cuando se haya enfriado a 50 ºC.
En cuanto a los inhibidores, cabe aclarar que un compuesto puede actuar como inhibidor
para algunos microorganismos y no para otros.
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1.- Nutrientes medio de cultivo
a) Factores orgánicos de crecimiento
Los factores orgánicos de crecimiento son compuestos orgánicos específicos que se
requieren en muy pequeñas cantidades por las bacterias heterótrofas y no pueden ser
sintetizadas por las células.
Estas sustancias normalmente son aportadas al medio de cultivo por el extracto
de levadura o por la sangre, e incluyen vitaminas, aminoácidos, purinas y pirimidinas,
Algunos microorganismos son capaces de sintetizar estos compuestos, se
denominan prototrofos para diferenciarlos de los mutantes auxótrofos que requieren el
factor de crecimiento.
a.1) Vitaminas Fueron los primeros factores de crecimiento descubiertos. En los
organismos vivos, muchas vitaminas funcionan en forma de coenzimas por ejemplo el
ácido nicotínico que es parte del coenzima NAD. Algunos microorganismos tienen
requerimientos vitamínicos muy complejos, mientras que otros sólo necesitan algunas
vitaminas. Las bacterias del ácido láctico Streptococcus y Lactobacillus, tienen unos
requerimientos vitamínicos muy complejos que incluso pueden superar a los del
hombre. La cobalamina (vitamina B12) es requerida por algas y bacterias acuáticas. Sin
embargo, los hongos no requieren nunca vitamina B12.
a.2) Aminoácidos Muchos microorganismos requieren aminoácidos específicos. La
incapacidad para sintetizar un aminoácido está relacionada con la falta de enzimas
necesarias para su síntesis. Los aminoácidos requeridos pueden ser suministrados como
aminoácidos libres o incorporados en otros elementos.
La determinación de los requerimientos para un aminoácido en particular es complicada
por el hecho de que en ocasiones la presencia de un aminoácido en exceso disminuye la
absorción de otros que se requieren para el crecimiento. Este fenómeno se denomina
“aminoacid imbalance”.
a.3) Purinas y pirimidinas Las purinas y pirimidinas, que son componentes
estructurales de los ácidos nucleicos y coenzimas, son factores de crecimiento para
muchos microorganismos. Es imposible conocer la forma en que deben ser
suministrados a la célula.
Si se suministran como bases libres, deben convertirse en el interior de la célula en
nucleótidos antes de poder ser utilizadas.
Normalmente los nucleótidos no pueden ser utilizados como factores de crecimiento ya
que la presencia del grupo fosfato, produce la ionización de la molécula y se disminuye
la capacidad de penetración en la célula.
a.4) Anillo porfirinico
La clorofila, citocromo y hemoglobina, todos contienen el
anillo porfirínico. El requerimiento de este anillo, explica porqué hay microorganismos
patógenos como Haemophilus influenzae que requieren cultivarse sobre medios que
contengan hematíes (grupo hemo). Las bacterias que requieren el grupo hemo carecen
de la capacidad de sintetizar porfirinas y su crecimiento queda restringido a ambientes
donde existe sangre. Como este anillo es necesario para la síntesis de citocromo, el
aparato respiratorio de estas células se encuentra alterado en ausencia del grupo hemo.
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a.5) Ácidos grasos Las bacterias del rumen requieren ciertos factores de crecimiento
presentes en el rumen. Estos factores de crecimiento fueron identificados como ácidos
grasos de 4- 6 átomos de carbono lineal o ramificado y que son solo factores de
crecimiento para las bacterias del rumen.
b) Suplementos
Algunos microorganismos son muy difíciles de cultivar y deben agregarse a los medios
elementos que son denominados como suplementos como por ejemplo; Extracto de
levadura, peptonas y extracto de carne.
b.1) Extracto de levadura. Es un extracto de la hidrólisis ácida o enzimática de las
células de levadura, que han sido lisadas previamente por calor. Es una fuente rica en
vitamina B, contiene además nitrógeno orgánico y compuestos carbonados. Se puede
adquirir comercialmente en forma de polvo.
b.2) Peptonas. Productos que resultan de la digestión de materiales proteicos, por
ejemplo carne, caseína y gelatina. Existen disponibles en el comercio muchos tipos
diferentes de peptonas (dependiendo de la proteína utilizada y del método de digestión)
para su utilización en medios bacteriológicos; las peptonas difieren en cuanto a su
capacidad de soportar el crecimiento de las bacterias.
Las peptonas son la principal fuente de nitrógeno orgánico; pueden contener además
algunas vitaminas y a veces carbohidratos, dependiendo del material proteico digerido.
b.3) Extracto de carne. Es un extracto concentrado de los productos hidrosolubles de la
carne de buey. Es la fuente principal de carbohidratos, compuestos orgánicos de
nitrógeno, vitaminas hidrosolubles y sales.
c) Otros Requerimientos
Otros elementos necesarios para el crecimiento y que deben encontrarse presentes en los
medios de cultivos son: NaCl en cantidades del 0,5% para evitar fenómenos de lisis en
la célula bacteriana.
Todos los medios de cultivo deben ser hidratados con agua la cual debe ser
destilada para evitar la formación de carbonato de calcio que enturbie el medio e
impida el crecimiento bacteriano.
2.-Estado medio de cultivo
a) Sólidos: permiten visualizar las características macroscópicas de la(s)
colonia(s) y cuantificar su desarrollo. Fueron introducidos por R. Koch
(1881) y han representado un valioso aporte en bacteriología, para obtener
cepas puras de microorganismos, lo cual facilita la clasificación y
tipificación bacteriana.
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b) Líquidos: son de mayor sensibilidad en el desarrollo de los microorganismos,
sin embargo se contaminan con mayor frecuencia. fueron los primeros
medios de cultivo usados y fueron ideados por L.Pasteur. En ellos el crecimiento microbiano está uniformemente disperso por todo el líquido.
c) Semisólidos: permiten observar la movilidad de algunos microorganismos.
3.-Presentación medio de cultivo
a) En placa: se usa sólo para medios sólidos. Su principal utilidad está en el
aislamiento primario, es decir la siembra de la muestra con obtención de
colonias separadas (aisladas) para su posterior identificación y sensibilidad.
b) En tubo: puede contener medio líquido, sólido o semi-sólido.
4.- Agentes Solificantes.
a) Agar-Agar. Es un carbohidrato complejo (polisacárido) que se obtiene de ciertas
algas marinas y que se encuentra constituido por agarosa y agaropectina.
El agar es insoluble en agua fría y soluble en agua caliente a una temperatura por sobre
los 45°C. Funde a una temperatura entre 80 y 100°C. Una vez fundido se mantiene
líquido hasta una temperatura de 44-45°C.
El agar es muy poco tóxico. Tiene el inconveniente de que a pH ácido no solidifica, por
lo cual es muy importante ajustar el pH del medio al cual se le ha agregado agar a un pH
= 7.
b) Gelatina. Se obtiene por hidrólisis del colágeno. Es insoluble en agua fría y soluble
en agua caliente. No es muy transparente. Licúa a 28°C y tiene el inconveniente de que
es fácilmente atacada por los microorganismos.
No se emplea generalmente como agente solidificante. Es empleada de preferencia en
las pruebas de identificación bioquímica para las bacterias.
Silico gel. Es un gel inorgánico que se prepara con HCl y silicato de sodio. Tiene la
ventaja de solidificar a pH ácido. Sirve para estudios de nutrición y para cultivar
microorganismos que degradan los otros agentes solidificantes. Se utiliza para aislar
microorganismos del suelo.
c)
5.- Clasificación de medios de cultivo
a) Según la fuente de nutrientes:
a.1. Natural: Son aquellos que existen como tales en la naturaleza, por ejemplo, papa,
huevos, leche, tierra, etc.
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a.2. Artificial: Están compuestos de substancias que son manipuladas por el hombre en
el laboratorio.
b) Según su composición:
b.1. Medios sintéticos o definidos: se le conoce su composición química exacta.
Se usan para microorganismos a los que se les conoce sus requerimientos nutricionales.
Generalmente contienen: fuentes de carbono, como la glucosa; de nitrógeno, usualmente
de cloruro, sulfato o fosfato de amonio; y varias sales inorgánicas incluidas trazas de
metales.
Ejemplo: agar-almidón:
Almidón
NaCl
Agar
Agua Dest.
12,5 gr.
5,0 gr.
15,0 gr.
1,0 lt.
b.2. Medios complejos o no definidos: es aquel que tiene ingredientes de
composición química desconocida o parcialmente conocida. Se usan para hacer crecer
microorganismos de difícil cultivo.
Ejemplos: agar sangre, agar yema de huevo, caldo lactosado, medio marino, agar
nutritivo.
Caldo nutritivo:
Extracto de carne
3 gr.
Peptona
5 gr.
Agua Destilada
1 lt.
c)
Según su consistencia:
c.1. Medios líquidos: Ejemplos caldo nutritivo
c.2. Semisólido:
Ejemplo caldo nutritivo, de la composición descrita
anteriormente, más 0,8 gr. de agar-agar por cada 100 ml de
medio.
c.3. Sólido:
Ejemplos Agar nutritivo.
d) Según su utilización:
d.1. Medios Selectivos:
Son medios que favorecen el crecimiento de determinados microorganismos. Es
un medio que ha sido modificado para incluir uno o más agentes inhibitorios,
restringiendo el crecimiento de ciertas especies de organismos. Las sustancias
inhibitorias usadas son por lo general: antibióticos, colorantes, sales biliares para
enriquecer enterobacterias, cristal violeta que inhibe el crecimiento de bacterias Gram
positivas y permite el crecimiento de las Gram negativas, medio con 25% de NaCl para
enriquecer halófilas.
Otros ejemplos de medios selectivos son:
- Brillant green bile broth.
- Chapman, para desarrollo de Staphylococcus.
- MacConkey
- Baird-Parker medium.
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d.2. Medios de diagnóstico o diferencial:
Contienen reactivos que diferencian entre los distintos tipos de bacterias, sirven
para una identificación presuntiva o preliminar. Se usan para determinar propiedades
fisiológicas y bioquímicas.
Ejemplos de este tipo de medio:
- Agar sangre.
- Agar leche.
- Agar yema de huevo.
- Agar citrato Simmons
- Agar gelatina.
- Agar almidón.
d.3. Medios de crecimiento o mantención:
Tienen como objetivo preservar un stock de cultivo, con lo cual se tiene en el
laboratorio una cantidad de microorganismos viables.
Ejemplos de este tipo de medio:
- Agar nutritivo.
- Caldo peptonado.
- Medios de congelación (se baja a la mitad los componentes
nutritivos del medio y se agrega glicerol para impedir la
formación de cristales).
d.4. Medios mejorados:
Se obtienen añadiendo al medio corriente sustancias de mayor valor nutritivo que tiene
el efecto de proporcionar condiciones favorables para el cultivo de microorganismos
exigentes, por ejemplo: caldo cerebro corazón, agar sangre, etc.
El medio mejorado de uso más corriente es el agar sangre.
Agar sangre. Puede utilizarse sangre recién extraída, desfibrinada o citratada. La
sangre no puede ser esterilizada, por lo que ha de ser extraída y añadida a los medios,
guardando las más rigurosas condiciones de esterilidad.
Se extrae la sangre asépticamente, ya sea humana o de animal (cuy, conejo, etc.).
Se recibe en matraces estériles que contengan oxalato o citrato para que no se coagule, o
bien se desfibrina, agitándola con perlas de vidrio estériles.
Se mezcla la sangre con agar corriente previamente esterilizado y fundido y
enfriado a 50°C, en proporción a un tercio de sangre y dos tercios de agar nutritivo. Se
reparte en tubo o placas de Petri. Todas estas operaciones deben efectuarse al lado del
mechero Bunsen y alejadas de la corriente de aire para evitar contaminaciones.
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6.- Medios de cultivo para microorganismos anaerobios.
Los microorganismos anaerobios se pueden definir como bacterias que viven y
se reproducen sólo en medios privados de oxígeno libre.
Los medios de cultivo para microorganismos anaerobios se componen de las
mismas sustancias nutritivas que utilizan los aerobios, pero es necesario privarlos de
oxígeno libre. Para esto se utilizan varios procedimientos que pueden agruparse en
procedimientos físicos, químicos y biológicos.
Procedimientos físicos. Expulsión del aire por ebullición (regeneración de los
medios.)
Procedimientos químicos. Se basan fundamentalmente en la utilización de
sustancias que poseen poder reductor por ser muy oxidables. Ejemplo Agar de Brewer
en el cual la sustancia reductora es el tioglicolato de sodio.
Procedimientos biológicos. Estos procedimientos aprovechan la convivencia de
un microorganismo aerobio con un anaerobio estricto.
Entre los medios de cultivo especiales para anaerobios podemos citar: Agar de
Brewer, Caldo tioglicolato con agar (medio semisólido), Caldo tioglicolato.
7.- Medios de cultivo para microorganismos marinos.
Para estudiar los microorganismos que forman la flora del agua de mar, la
espuma, las bacterias de peces, mariscos, etc., es conveniente utilizar medios de cultivo
similares en todo a los ya estudiados, pero preparados en base a agua de mar esterilizada
(reemplaza al agua destilada) y en el caso de medios a base de albúminas animales,
sólidos o líquidos, la carne o sus productos se reemplazan por carne de pescado o sus
derivados (harina, etc.).
Conviene estudiar la salinidad necesaria para el crecimiento de estos
microorganismos, el pH adecuado y la tensión de oxígeno y anhídrido carbónico u otros
gases para obtener el mejor desarrollo.
Existen medios de cultivo para microorganismos mariscos preparados como el
agar de Zobell.
8.- Indicadores de ph:
Los indicadores de PH son incorporados en algunos medios de cultivo y dan evidencia
visual de los cambios de PH que ocurren durante el crecimiento de las bacterias. Los
indicadores para este objetivo no deberán ser tóxicos en la concentración empleada.
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9.-Preparacion de medios de cultivo:
La preparación de medios cultivos en microbiología implica los siguientes
pasos:
1.Pesar una cantidad específica del medio de cultivo sobre papel aluminio,
teniendo la precaución de no ensuciar la balanza, debido a que algunos compuestos son
muy higroscópicos los cuales se adhieren con gran facilidad a la superficie.
2.Posteriormente debe colocar el contenido pesado en un matraz erlenmeyer,
donde le añadirá el volumen requerido según las indicaciones y disuelva. Determine el
pH del medio líquido y ajuste al valor que sea óptimo para el tipo de bacterias que se va
a cultivar, generalmente se ajusta a pH=7.
3.Lugo caliente el medio al mechero hasta que hierva, teniendo la precaución de
que no se adhiera o se pegue en el fondo del matraz. Hierva lentamente, ya que así
evitará perdidas del medio por derrame.
4.Si es necesario dosifique en tubos, cuidando de que estos estén correctamente
rotulados y cerrados (pueden ser tapas o algodón hidrófobo).
5.-
Finalmente esterilice el medio en el autoclave a 121 ° C, durante 15 minutos.
En base a lo ya estudiado en el práctico, complete el siguiente recuadro, clasificando el
medio de Cultivo.
Nombre del medio de cultivo Componentes General
Uso
Selectivo Diferencial Complejo definido
Agar nutritivo
Agar MacConkey
Caldo cerebro- corazón
Agar Bair-Parker
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Siembra de microorganismos
Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porción de muestra (inóculo) en un
medio adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano. Luego de sembrado, el
medio de cultivo se incuba a una temperatura adecuada para el crecimiento.
La siembra puede realizarse en medio líquido, sólido o semisólido, utilizando asa en
punta o loop, hisopo o pipeta estéril.
Cultivo en medio líquido
Habitualmente se realiza en tubos o en matraces. El crecimiento se puede manifestar por
enturbiamiento, por formación de velo o película, o por sedimento.
Cultivo en medio sólido
Puede ser en tubos o placas.
a) Tubos con agar inclinado. Para sembrarlos, se mueve el ansa o la punta suavemente
sobre la superficie del agar con un movimiento en zigzag desde el fondo hasta la parte
superior, cuidando de no dañar el agar.
b) Tubos sin inclinar. Se siembran introduciendo una punta en el centro del agar.
También se llama siembra por picadura.
c) Siembra en placas. Puede ser en superficie o incorporada.
En superficie

1) Se colocan 0.1 mL de la dilución de la muestra con pipeta estéril en el centro
de
la
placa,
y
se
distribuye
con
un
rastrillo
estéril.
2) Se siembra con un ansa para aislar, como se explica más adelante.
3) Se siembra con un hisopo.
Incorporada

Se coloca 1 mL de la muestra en una placa estéril vacía, en el centro de la
misma. Sobre ella se agregan 20 mL de medio de cultivo fundido y
termostatizado a 45ºC; luego se agita la placa.
Las placas se incuban invertidas, ya que la alta concentración de agua en el medio puede
provocar condensación durante la incubación y si cae sobre la superficie del agar, se
extiende dando un crecimiento confluente.
En medio sólido cada célula viable dará origen a una colonia y por lo tanto la siembra
en placas se puede utilizar, no solo para cultivar microorganismos, sino además para
contar y aislar.
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1) Siembra de material sólido a medio líquido
Placa Petri o Tubo ensayo
 Tubo de ensayo (con asa loop)
 Matraz (con asa loop)
2) Siembra de material líquido a medio sólido
Tubo de ensayo o Matraz
 Tubo de ensayo (con asa loop)
 Placa Petri ( con asa loop)
3) Siembra de material sólido a medio sólido
Tubo de ensayo o placa Petri  Tubo de ensayo (con asa loop)
 Placa Petri (con asa loop)
4) Siembra de material liquido a medio líquido
Tubo ensayo o matraz
 Tubo ensayo (con asa loop o pipeta)
 Matraz (con asa loop o pipeta)
Para realizar los procedimientos anteriormente señalados, siga correctamente las
instrucciones dadas por el profesor o el ayudante de la asignatura, quienes le explicaran
como proceder correctamente en este practico de siembra.
Siembra en anaerobiosis.
Se utilizan los medios para anaerobiosis que se han descrito en la guía de
práctico de medios de cultivos.
En medios sólidos. Es necesario efectuar previamente la regeneración de los
medios, calentándolos a la temperatura de ebullición.
La siembra debe efectuarse cuando la temperatura haya descendido entre 45 y
50°C antes que se solidifique el agar. Se utilizan tubos largos para anaerobiosis los
cuales se siembran conforme a las técnicas estudiadas para siembras en medios
líquidos, pues el agar está líquido.
Una vez efectuada esta operación se agita el tubo de agar entre ambas manos por
rotación y se deja en posición vertical dentro de un recipiente con agua fría para que se
solidifique rápidamente impidiendo que penetre oxígeno en él.
En medios líquidos. Esta siembra se efectúa en la misma forma que hemos
efectuado para los aerobios.
En medios semisólidos. Si la muestra es sólida se utiliza es asa depositando el
inoculo en el fondo del tubo. Estos medios semisólidos necesitan también ser
regenerados, aunque en su composición lleven un reductor.
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