Benemérita Universidad Autónoma de Puebla Facultad de Ciencias Químicas Laboratorio de Neurofarmacología

Benemérita Universidad Autónoma de Puebla
Facultad de Ciencias Químicas
Laboratorio de Neurofarmacología
Tesis profesional
El papel del Aß25-35 en el hipocampo de ratas neonatas, sobre la
memoria espacial y la producción de óxido nítrico en la etapa adulta.
Para obtener el título de:
QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO
Presenta
pQFB. Luis Manuel de Jesús Vásquez
Directores de tesis
Dr. Ilhuicamina Daniel Limón Pérez de León
MC. Félix Luna Morales
27 de MARZO 2009
El papel del Aß25-35 en el hipocampo de ratas neonatas, sobre la memoria espacial y la producción de óxido nítrico en la etapa adulta.
Índice
Índice .................................................................................................................................................... 2
1
Abreviaturas ....................................................................................Error! Bookmark not defined.
2
Introducción ................................................................................................................................... 5
2.1
El desarrollo del sistema nervioso central de la rata ............................................................. 5
2.2
El período neonatal de la rata ...................................................Error! Bookmark not defined.
2.2.1
Neurotoxicología de la etapa neonatal ....................................Error! Bookmark not defined.
2.2.2
Daño cerebral en ratas de 7 días de edad: alteraciones neurológicas y lesiones permanentes .....Error!
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2.3
El péptido Amiloide-..............................................................Error! Bookmark not defined.
2.3.1
Toxicidad del A25-35............................................................Error! Bookmark not defined.
2.3.2
Participación del NO en La toxicidad del A25-35 ......................Error! Bookmark not defined.
2.3.3
Respuesta de los astrocitos frente a las lesiones del cerebro ..........Error! Bookmark not defined.
2.3.4
El óxido nítrico ...................................................................Error! Bookmark not defined.
2.4 El L-NAME, herramienta para investigar el mecanismo fisiológico del NOError! Bookmark
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2.5
Aprendizaje y memoria ............................................................Error! Bookmark not defined.
2.5.1
Sistema cerebral de referencia espacial ....................................Error! Bookmark not defined.
2.5.2
Participación del hipocampo en las tareas espaciales ..................Error! Bookmark not defined.
3
Justificación .....................................................................................Error! Bookmark not defined.
4
Hipótesis ..........................................................................................Error! Bookmark not defined.
5
Objetivo general ................................................................................Error! Bookmark not defined.
5.1
Objetivos particulares ..............................................................Error! Bookmark not defined.
6
Diagrama general de trabajo ...............................................................Error! Bookmark not defined.
7
Procedimiento del trabajo experimental ................................................Error! Bookmark not defined.
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El papel del Aß25-35 en el hipocampo de ratas neonatas, sobre la memoria espacial y la producción de óxido nítrico en la etapa adulta.
7.1
Animales de experimentación ..................................................Error! Bookmark not defined.
7.2
Preparación del A 25-35 .............................................................Error! Bookmark not defined.
7.3
Procedimiento para la cirugía estereotáxica ............................Error! Bookmark not defined.
7.4
Prueba conductual ...................................................................Error! Bookmark not defined.
7.4.1...............................................................................................Error! Bookmark not defined.
7.4.2
7.5
Cuantificación de nitritos ........................................................Error! Bookmark not defined.
7.5.1
Obtención de la muestra ........................................................Error! Bookmark not defined.
7.5.2
Técnica de Griess .................................................................Error! Bookmark not defined.
7.5.3
Técnica de Lowry .................................................................Error! Bookmark not defined.
7.6
Metodología para determinar los cambios neuronales ............Error! Bookmark not defined.
7.6.1
Sacrificio y obtención de la muestra ........................................Error! Bookmark not defined.
7.6.2
Tinción de Hematoxilina y Eosina ..........................................Error! Bookmark not defined.
7.6.3
Técnica histoquímica aminocúprica de plata ............................Error! Bookmark not defined.
7.7
Microscopia de fluorescencia ...................................................Error! Bookmark not defined.
7.7.1
8
Programa de la prueba de aprendizaje y de memoria espacial ......Error! Bookmark not defined.
Inmunohistoquímica de doble marcado: anti-GFAP más DAPI ...Error! Bookmark not defined.
Resultados .......................................................................................Error! Bookmark not defined.
8.1
Sitio de la microinyección con azul de metileno ......................Error! Bookmark not defined.
8.2
Resultados conductuales de grupos tratados con el A25-35 .....Error! Bookmark not defined.
8.2.1
El A25-35 deteriora el Aprendizaje y Memoria espacial ..............Error! Bookmark not defined.
8.2.2
El A25-35 aumenta el tiempo de latencia al 1er y 3er acierto en la prueba de Aprendizaje espacialError!
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8.2.3
El A25-35 aumenta el tiempo de latencia al 1er y 3er acierto en la prueba de Memoria espacial. ...Error!
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8.2.4
El A25-35 aumenta los errores de trabajo en la prueba de aprendizaje espacialError!
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3
El papel del Aß25-35 en el hipocampo de ratas neonatas, sobre la memoria espacial y la producción de óxido nítrico en la etapa adulta.
8.2.5
El A25-35 aumenta los errores de trabajo en la prueba de memoria espacialError! Bookmark not
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8.2.6
El A25-35 aumenta los niveles de óxido nítrico 90 días después de su administración ..............Error!
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8.2.7
Efecto del A25-35 sobre los cambios neuronales en el hipocampo ..Error! Bookmark not defined.
8.2.8
Efecto del A25-35 sobre la neurodegeneración en el hipocampo ....Error! Bookmark not defined.
8.2.9
Efecto de la A25-35 sobre la nitración de proteínas y la inmunorreactividad de GFAP en el
hipocampo ........................................................................................Error! Bookmark not defined.
9
Discusión de resultados ......................................................................Error! Bookmark not defined.
10
Conclusiones.....................................................................................Error! Bookmark not defined.
11
Perspectivas .....................................................................................Error! Bookmark not defined.
12
Apéndice ..........................................................................................Error! Bookmark not defined.
12.1
Determinación de nitritos ....................................................Error! Bookmark not defined.
12.2
Procedimiento para realizar la curva estándar ....................Error! Bookmark not defined.
12.3
Determinación de proteínas totales .....................................Error! Bookmark not defined.
12.4
Procedimiento para hacer la curva estándar ........................Error! Bookmark not defined.
12.5
Técnicas histológicas ...........................................................Error! Bookmark not defined.
12.5.1
Fijación .............................................................................Error! Bookmark not defined.
12.5.2
Deshidratación ...................................................................Error! Bookmark not defined.
12.5.3
Aclaración..........................................................................Error! Bookmark not defined.
12.5.4
Infiltración .........................................................................Error! Bookmark not defined.
12.5.5
Inclusión ............................................................................Error! Bookmark not defined.
12.5.6
Corte .................................................................................Error! Bookmark not defined.
12.5.7
Tinción ..............................................................................Error! Bookmark not defined.
12.6
12.6.1
Tinción de Hematoxilina y Eosina.......................................Error! Bookmark not defined.
Procedimiento .....................................................................Error! Bookmark not defined.
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El papel del Aß25-35 en el hipocampo de ratas neonatas, sobre la memoria espacial y la producción de óxido nítrico en la etapa adulta.
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Bibliografía ......................................................................................Error! Bookmark not defined.
1 Introducción
1.1
El desarrollo del sistema nervioso central de la rata
El sistema nervioso en desarrollo es una diana muy vulnerable, que se ve afectada por
diferentes sustancias neurotóxicas, incluso a niveles de exposición que no inducen efectos
duraderos en el sistema nervioso adulto. Las causas de esta especial vulnerabilidad son
diversas, ya que el neurodesarrollo es un proceso extremadamente complejo que se
desarrolla en el espacio y en el tiempo (Grandjean, 2006). Las edades relativas en las que
suceden la formación de las estructuras anatómicas y los desarrollos histológicos
principales son comparables entre humanos y roedores, aunque las edades cronológicas no
coincidan. Las estructuras cerebrales de todos los mamíferos se forman en una secuencia
fija de proliferación, migración neuronal, diferenciación, sinaptogénesis y muerte neuronal
(apoptosis). Estas etapas, aunque son sucesivas, se solapan durante la mayor parte del
desarrollo (Rice y Barone, 2000).
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El papel del Aß25-35 en el hipocampo de ratas neonatas, sobre la memoria espacial y la producción de óxido nítrico en la etapa adulta.
Figura 1.- Secuencia de las etapas del desarrollo del sistema nervioso central de ratas: fertilización,
organogénesis e histogénesis. DG: día de gestación, DPN: día postnatal (Rice y Barone, 2000).
La neurogénesis implica proliferación y diferenciación, que en el ámbito del ciclo
celular, se traduce en la entrada y salida de neuroblastos en el ciclo celular, la cual regulará
y determinará el tamaño del cerebro. La diferenciación neuronal es un proceso clave en el
desarrollo y se encuentra estrechamente vinculada con el ciclo celular, ya que las células
que salen del ciclo celular en fases tempranas exhiben determinadas características,
mientras que las que salen en las fases tardías exhiben otras, por ello, debe existir una
precisa coordinación entre el ciclo celular y la diferenciación neural, cualquier sustancia
que interfiera con la proliferación hará que ciertas poblaciones neuronales no se formen, y
no puedan ejercer su función (Ohnuma y Harris, 2003).
Una vez que las células salen del ciclo celular y adquieren el estatus de
postmitóticas, dejan la zona ventricular del tubo neural y migran (migración neuronal)
hacia las regiones donde se van a posicionar definitivamente. La posición final que las
neuronas van a ocupar está determinada por el lugar en la zona generativa, así como por el
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El papel del Aß25-35 en el hipocampo de ratas neonatas, sobre la memoria espacial y la producción de óxido nítrico en la etapa adulta.
momento en que la célula adquiere el carácter postmitótico. Excepcionalmente las células
continúan proliferando a la vez que migran de la zona ventricular (Rakik, 1988).
La función neuronal depende del establecimiento preciso de las conexiones entre las
neuronas y sus dianas, por lo que el desarrollo de los elementos pre y post sinápticos debe
ocurrir en el mismo lugar y al mismo tiempo. La migración a lo largo de las fibras de la glía
radial ocurre siempre en regiones donde las células están organizadas en capas, como la
corteza cerebral o el hipocampo (Rakic, 1971), y algunas regiones nucleares, entre las que se
encuentran el tálamo e hipotálamo (Shults y cols., 1990). Sin embargo, en algunas regiones
del cerebro, especialmente en los grupos nucleares de células, las neuronas migran sin el
soporte de las guías gliales (Edelman, 1983). La diferenciación neuronal puede ocurrir en
simultáneo con la migración celular. Las células postmitóticas en migración empiezan a
desarrollar proyecciones, las cuáles se extienden hacia las regiones donde establecerán su
posición final (Auladell y cols., 1995).
La sinaptogénesis es un proceso tardío de la diferenciación neuronal, aunque
algunas sinapsis aparecen durante fases más tempranas. Cuando las neuronas alcanzan su
posición final, empiezan a desarrollar prolongaciones dendríticas, con las cuales reciben
contactos de otras células. Las prolongaciones están guiadas por factores mecánicos y
químicos (Bradford, 1988; Song y Poo, 2001). La forma en que las neuronas alcanzan sus
dianas y establecen sus conexiones precisas durante el desarrollo, se basa en el
reconocimiento molecular donde cada neurona tiene especificada una identidad molecular
que le permite ser reconocida por otras neuronas que establecen contacto con ella; y en la
actividad neuronal, la cual sugiere que el patrón de actividad neuronal generado por
estímulos externos durante el desarrollo podría cambiar las conexiones, basándose en el
principio de que las conexiones que se utilizan quedan asentadas y las menos usadas son
eliminadas (Munno y Syed, 2003). Estas conexiones están determinadas en gran parte por
factores genéticos, y una vez establecidas permanecen estables. Sin embargo, las
interacciones con el medio durante el desarrollo postnatal pueden provocar cambios
plásticos en las neuronas y sus conexiones.
También, pueden ocurrir cambios de conectividad o de plasticidad durante el
aprendizaje o después de un daño cerebral. Durante el desarrollo del SNC se genera un
número excesivo de neuronas y conexiones siendo selectivamente eliminadas las neuronas
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El papel del Aß25-35 en el hipocampo de ratas neonatas, sobre la memoria espacial y la producción de óxido nítrico en la etapa adulta.
que no establecieron correctamente sus conexiones o que no llegaron a establecer
conexiones sinápticas con sus respectivas dianas (Bradford, 1985) y una muerte celular
extensiva reduce a la mitad el número de neuronas originadas en las fases previas. Se piensa
que ésta pérdida sirve para afinar la función neuronal y parece estar asociada con un
incremento en la especialización de las funciones cerebrales en diferentes regiones del
cerebro. La apoptosis es esencial para el desarrollo y mantenimiento de los organismos
multicelulares, y ocurre de manera natural durante el desarrollo del SNC. Además de todos
los procesos relacionados con neuronas, es ya conocida la importancia de las células gliales
como piezas relevantes de la función cerebral así como durante el neurodesarrollo
(Rickman cols., 1999).
Un período especialmente importante en el neurodesarrollo es la etapa de
“crecimiento del cerebro”, un período transitorio de rápida formación y reorganización de
las sinapsis. Estudios en mamíferos sugieren que el llamado período de crecimiento del
cerebro ocurre durante la etapa postnatal temprana (primera semana de vida extrauterina
de la rata), demostrándose en múltiples estudios que es una etapa susceptible al daño
neuronal (Rice y Barone, 2000).
nto acuático de Morris pero no así para adquirir una tarea de discriminación no
espacial una tarea de discriminación basada en la aversión al gusto (Skinner y cols., 1994).
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