“Caracterización genética y fenotípica de nrb2, un mutante de

“Caracterización genética y
fenotípica de nrb2, un mutante
de Arabidopsis thaliana
insensible al BTH”
Trabajo de Fin de Máster
Realizado por:
Fernando Xavier Rivas Romero
Director:
Dr. Pablo Tornero Feliciano
Valencia, Julio de 2013
1
Pablo Tornero Feliciano, Científico titular del Consejo Superior de Investigaciones
Científicas
CERTIFICA
Que el presente trabajo titulado “Caracterización genética y fenotípica de nrb2, un
mutante de Arabidopsis thaliana insensible al BTH” ha sido realizado por
Fernando Xavier Rivas Romero, bajo mi dirección en el Instituto de Biología
Molecular y Celular de Plantas (UPV-CSIC) y autorizo la presentación del Trabajo de
Fin de Máster el cual se adecua a los requisitos formales, metodológicos y de
contenido, de acuerdo con la normativa publicada por la Comisión Académica del
Máster de Biotecnología Molecular y Celular de Plantas de la Universidad Politécnica
de Valencia.
Y para que conste a los efectos oportunos lo firmo en Valencia a 30 de julio de 2013.
Director del TFM
Pablo Tornero Feliciano
2
Ismael Rodrigo Bravo, profesor titular del Departamento de Biotecnología de la
Universidad Politécnica de Valencia,
CERTIFICA
Que el presente trabajo titulado “Caracterización genética y fenotípica de nrb2, un
mutante de Arabidopsis thaliana insensible al BTH” ha sido realizado por
Fernando Xavier Rivas Romero, bajo mi tutoría en el Instituto de Biología Molecular y
Celular de Plantas (UPV-CSIC) y autorizo la presentación del Trabajo de Fin de Máster
el cual se adecua a los requisitos formales, metodológicos y de contenido, de acuerdo
con la normativa publicada por la Comisión Académica del Máster de Biotecnología
Molecular y Celular de Plantas de la Universidad Politécnica de Valencia.
Y para que conste a los efectos oportunos lo firmo en Valencia a 30 de julio de 2013.
Tutor del TFM
Ismael Rodrigo Bravo
3
Para Mi madre:
Otro logro más…. Todo gracias a ti
Por la vida que me diste, en todos los sentidos
Esto es para ti
Gracias por ser la mamá más mala del mundo
Para Santy:
Mi Hermano, Mejor amigo y compañero
Por tomar mi lugar y cuidar nuestro mayor tesoro
Nuestra madre
Esto también es por ti y gracias a tí
Para Iara Anahí:
Angelito mío que viniste a alegrar nuestras vidas
Por la fuerza que me diste, aunque no lo sepas
Dedicado para ti
Desde lo más profundo de mi ser
Los Quiero,
Fer 10
4
Agradecimiento
Un agradecimiento especial al Dr. Pablo Tornero, por su colaboración, apoyo y
consejos en la dirección de este trabajo.
A la Secretaría Nacional de Educación Superior, Ciencia y Tecnología del
Ecuador
(SENESCYT),
por
darme
la
oportunidad
de
prepararme
profesionalmente a través de su programa de becas “Convocatoria Abierta
2011”
A mis compañeros del laboratorio, especialmente a María Laura, Ana, Javi,
Juanvi, Loli y Vicente; por la ayuda desinteresada, el constante apoyo con el
trabajo y por una verdadera convivencia de laboratorio.
A mis profesores del máster, con mención especial a José Gadea, Alejandro
Atarés, Vicente Moreno, Ismael Rodrigo, Ramón Serrano y José Miguel Mulet,
por los conocimientos de alta calidad impartidos durante el transcurso del
máster.
A mis amigos: Ryan, Jorge, Jonas, Kalle, Stefan, Mario, Wicki, Sabrina, Afroditi,
Dani y Wanda, por hacerme sentir la calidez de una familia mundial y hacer de
esta experiencia realmente inolvidable.
A mi familia ecuatoriana en Valencia: Isabel, Estefania y Daniel. Por el apoyo
incondicional que me han dado en los momento más duros durante mi estancia
aquí y fortalecer aún más la amistad que nos ha unido desde las aulas de la
universidad ecuatoriana.
A mis amigos ecuatorianos, compatriotas becarios como yo, un agradecimiento
especial por la convivencia y la ayuda mutua que nos brindamos al estar lejos
de la Pachamama y hacer más “ecuatoriano” nuestro paso por tierras
extranjeras.
5
CONTENIDOS
INTRODUCCIÓN ................................................................................................................ 7
I.
1.1
Sistema de defensa de las plantas .......................................................................... 7
1.1.1
Respuesta Hipersensible (HR) ....................................................................... 12
1.1.2
El ácido salicílico y la SAR .............................................................................. 13
II.
OBJETIVOS ...................................................................................................................... 18
III.
MATERIALES Y MÉTODOS ...................................................................................... 19
3.1
Material Vegetal ........................................................................................................ 19
3.2
Mapeo genético de la mutación ............................................................................. 19
3.3
Análisis de segregación........................................................................................... 20
3.4
Caracterización fenotípica ....................................................................................... 20
3.4.1
Peso fresco ........................................................................................................ 20
3.4.2
Germinación en ácido salicílico ...................................................................... 21
3.4.3
Curvas de crecimiento bacteriano ................................................................. 21
RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................................................... 23
IV.
V.
4.1
Caracterización genética ......................................................................................... 23
4.2
Caracterización Fenotípica ..................................................................................... 30
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ............................................................... 37
5.1
Conclusiones ............................................................................................................. 37
5.2
Recomendaciones .................................................................................................... 38
BIBLIOGRAFÍA ......................................................................................................................... 39
6
I.
INTRODUCCIÓN
1.1 Sistema de defensa de las plantas
Las plantas, al ser organismos superiores están sometidas a un estrés
de tipo biótico continuo, por lo que es muy importante que desarrollen
nuevas estrategias para evitar que los patógenos venzan la resistencia de la
planta y pongan en juego la supervivencia de la especie.
Las plantas han tenido que adaptarse continuamente a este juego de
evolución, y dado que las plantas son organismos sésiles, su defensa se
complica al no poder escapar, tal como lo hacen los organismos móviles. A
pesar de estas limitaciones, éstas han desarrollado mecanismos muy
complejos y sofisticados para defenderse de los patógenos (Jones y
Takemoto, 2004).
En los últimos años, la investigación vegetal se ha concentrado en una
pequeña planta, la cual se ha convertido en el modelo ideal para todo tipo
de investigación. Esta planta es Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), que
pertenece a la familia de las Brasicaceae. Esta planta se ha utilizado como
modelo genético, bioquímico y fisiológico por la facilidad de su manejo que
incluye desarrollo total en un corto tiempo (6-8 semanas) reducido tamaño,
pequeño genoma totalmente secuenciado (The Arabidopsis Initiative, 2000)
y los resultados de su investigación son extrapolables a casi cualquier
planta (Meinke, et al., 1998).
En Arabidopsis han sido descritos los principales mecanismos de
defensa de patógenos, por lo que se convierte en una excelente
herramienta para estudiar las interacciones de las plantas con los
patógenos (Glazebrook, et al., 1997).
7
En la naturaleza existen varios tipos de patógenos que atacan a las
plantas y dependiendo del tipo de interacción que tienen con las plantas se
pueden dividir en biotrofos, los cuales mantienen a las células vivas durante
la infección y se nutren de sus moléculas; y en necrotrofos, los cuales
matan a las células y se nutren de sus componentes. Dentro de éstos, se
puede considerar un tipo intermedio de patógenos conocido como
hemibiotrofo, puesto que infecta inicialmente a las plantas como biotrofo y
produce la muerte de las células al final del proceso infectivo (García-Mas,
et al., 2004; Glazebrook, 2005).
Para poder infectar a la planta, el patógeno debe primero atravesar una
serie de barreras físicas que impiden el paso al interior de la célula. Estas
barreras son la cutícula y la pared celular. Cuando los patógenos intentan
cruzar estas barreras, la planta activa una serie de mecanismos de defensa
conocidos como defensa apoplástica que inhibe las enzimas microbianas,
fortalece la pared celular y reduce el crecimiento del patógeno
(Hückelhoven, 2007).
Una vez que el patógeno ha superado estas barreras físicas, es
indispensable el reconocimiento del patógeno por parte de la planta.
Para ello, las plantas han desarrollado dos grandes sistemas de defensa
para el reconocimiento de los patógenos. El primero utiliza receptores
transmembrana de reconocimiento de patrones (PRR, Pattern recognition
receptors) que básicamente actúan a nivel externo en el reconocimiento de
pequeñas moléculas efectoras asociadas a patógenos (Jones y Dangl,
2006).
Estas moléculas efectoras son generalmente de origen microbiano y se
conocen como “Patrones moleculares asociados a patógenos” (PAMPs o
Pathogen-associated molecular patterns, como la flagelina) que inducen la
expresión de genes de respuesta defensiva, con la subsiguiente producción
de sustancias antimicrobianas por parte de la célula huésped (Nurnberger y
Brunner, 2002; Jones y Dangl, 2006)
8
El otro sistema de defensa es el producido por los genes R, cuyas
proteínas actúan por lo general en el interior celular (Jones y Dangl, 2006).
La mayoría de genes R son codificantes del tipo de proteínas NB-LRR.
Su nombre deriva de que son proteínas con dominios de unión a
nucleótidos (NB, Nucleotide binding) y dominios de repeticiones ricas en
leucinas (LRR, Leucine-rich repeats) características en muchas proteínas
de defensa (Dangl y Jones, 2001; Jones y Dangl, 2006).
Bajo el concepto clásico de la resistencia a patógenos, los genes R
reconocen a las proteínas de avirulencia (Avr) de los patógenos a manera
de un receptor y desencadena la respuesta inmunitaria de la planta (Van
der Biezen y Jones, 1998; Dangl y Jones, 2001, Jones y Dangl, 2006),
produciendo
una
interacción
incompatible.
Si
no
se
produce
el
reconocimiento, el patógeno infecta a la planta, en lo que se conoce como
interacción compatible. Los genes Avr abarcan un amplio espectro de
moléculas expresadas por los patógenos que favorecen el desarrollo de la
infección, que pueden ser desde moléculas microbianas conservadas, hasta
efectores patogénicos, como el sistema de efectores tipo III bacterianos
(Lee, et al., 2009). En la figura 1.1, se muestra el denominado modelo “zig
zag” donde se explica de mejor manera el desarrollo del proceso de
infección y defensa (Jones y Dangl, 2006).
9
Figura 1.1. Modelo zig zag del proceso de defensa contra la infección patogénica
(Fuente: Jones y Dangl, 2006)
En la primera fase se reconocen los PAMPs mediante las proteínas
PRR, las cuales median una serie de señales que se traducen en la
activación de la inmunidad mediada por PAMPs, PTI (PAMPs-triggered
immunity) que evita la colonización (Fig 1.2a).
El ejemplo más estudiado de PTI es el de la percepción de la flagelina
bacteriana, que es la principal proteína del flagelo bacteriano, el cual es
indispensable para la patogenicidad en plantas. La percepción de la
flagelina se realiza a través del receptor FLAGELLIN SENSITIVE 2 (FLS2).
Este receptor es una proteína de la familia LRR-RLK con un dominio
extracelular rico en repeticiones de leucina, un dominio transmembrana y un
dominio citosólico unido a quinasas. Cuando el receptor LRR-RLK percibe
la flagelina, se desencadena una señalización mediada por MAPK quinasas
que activan los factores de transcripción WRKY, que a su vez activan la
expresión de los genes de defensa correspondientes (Bent y Mackey, 2007;
Boller y Félix, 2009; Zipfel, 2009). Los mutantes de Arabidopsis en este
receptor (fls2) son más susceptibles a la infección de Pseudomonas
syringae patovar tomato DC3000 (Pto) (Segonzac y Zipfel, 2011).
Si el patógeno logra liberar efectores que interfieren con la PTI se
desarrolla una segunda fase con el proceso conocido como ETS (Effectortriggered susceptibility) (Fig 1.2b). Los patógenos específicos de la planta
son capaces de suprimir la PTI en su planta hospedadora. Esto lo realizan a
través de la producción de los efectores que son característicos de cada
grupo de patógenos, aquellos que les permiten inhibir las proteínas
involucradas en la señalización de la PTI y esquivar su detección
promoviendo la infección (Jones y Dangl, 2006).
Existen varios sistemas de secreción de efectores en bacterias, siendo el
sistema de efectores tipo III el más importante en la virulencia de las
bacterias, ya que puede inyectar hasta 40 efectores diferentes en las
10
células para inhibir la PTI (de Wit, 2007). Las cepas de Pto mutadas en este
sistema de efectores carecen de la capacidad para suprimir la PTI y se
convierten en no patogénicas (Jones y Dangl, 2006).
Estos efectores bacterianos inyectados al huésped por el sistema III
actúan inhibiendo la PTI. Así, AvrRpm1 y AvrRpt2 comprometen
directamente la respuesta mediada por PAMPs (de Wit, 2007; Segonzac y
Zipfel, 2011). Por otra parte, AvrPto interacciona con el dominio quinasa de
FLS2 impidiendo la ruta de señalización hasta la expresión de los genes R,
mientras que AvrPtoB ubiquitina FLS2 promoviendo su degradación
(Segonzac y Zipfel, 2011) y además se ha visto que también puede inducir
la ruta de ácido abscísico (ABA) favoreciendo al desarrollo del patógeno (de
Wit, 2007).
En la tercera fase, estos efectores son reconocidos por una proteína R
específica desencadenando la inmunidad mediada por efectores, ETI
(Effector-triggered immunity). La ETI es una forma amplificada de la PTI que
resulta en resistencia a la enfermedad, muchas veces activando la
respuesta hipersensible (HR) que involucra la muerte celular programada en
la zona de contacto con el patógeno (Fig 1.2c). En una cuarta fase, la
selección natural empuja al patógeno a esquivar la ETI mediante la
diversificación de sus proteínas efectoras o adquiriendo nuevas proteínas
efectoras que no puedan ser reconocidas por las plantas (Fig 1.2d) (Jones y
Dangl, 2006).
11
Figura 1.2 a) PTI; b) ETS; c) ETI; d) El patógeno ha superado la ETI y ha logrado
colonizar la planta (Fuente: Bent y Mackey, 2007, Modificado)
1.1.1
Respuesta Hipersensible (HR)
Como se ha explicado anteriormente, la respuesta hipersensible es un
mecanismo producido en las células de las plantas que provoca la muerte
celular en la zona circundante a la de la interacción con el patógeno. En
otras palabras, se manifiesta como una pequeña lesión necrótica que afecta
a un reducido número de células, lo que le permite sobrevivir al resto de la
planta (Heath, 2000).
El sistema más estudiado es la muerte celular por acumulación de
especies reactivas de oxígeno (ROS) (Heath, 2000). La acumulación de
especies reactivas de oxígeno es una consecuencia del ataque del
patógeno y se produce por la liberación por parte de las células muertas de
12
altas cantidades de H2O2, O2·-, O3 y OH.-, así como óxido nítrico.
Inicialmente se cree que el ión superóxido (O2·-) es el que se produce con
más frecuencia y es convertido en peróxido de hidrógeno (H2O2) por una
superóxido dismutasa, el cual, al ser más estable se acumula de mejor
manera, produciendo, en este caso, la muerte de las células involucradas
(Boller y Félix, 2009).
Además de la acumulación de estas especies reactivas de oxígeno en la
zona de lesión, se han encontrado niveles considerables de ácido salicílico
(SA). También se ha encontrado una correlación directa entre estos niveles
de concentración de SA y mecanismos más avanzados de defensa como la
SAR que se explicará más adelante (Ryals, et al., 1996).
1.1.2
El ácido salicílico y la SAR
El SA es una molécula derivada de la hidroxilación del ácido benzoico, y
que tiene una enorme importancia dentro del proceso de defensa de las
plantas. En un principio, la inducción del mismo está asociada a la aparición
de la respuesta hipersensible y actúa como la molécula señalizadora
principal para la activación de la resistencia sistémica adquirida (SAR).
La SAR es la capacidad de respuesta de la planta a la infección de
patógenos, especialmente biotrofos, que se distribuye en todos los tejidos
de la planta. La activación de este sistema proporciona una protección de
amplio espectro a la planta contra una gran variedad de patógenos,
independientemente del patógeno inicial que haya provocado la reacción
(Ryals, et al., 1996). Sin embargo, esta protección solamente se hace
efectiva contra agentes biotrofos, mientras que contra los necrotrofos se ve
reducida (García-Mas, et al., 2004).
La presencia de SAR, o de otros tipos de resistencia, coincide con la
expresión de una serie de genes, siendo los más conocidos los genes PR
(Van Loon, et al., 2006).
13
Los genes PR son familias génicas que codifican un grupo de proteínas
denominadas PR (Pathogenesis-related), que tienen un importante rol en la
resistencia de las plantas contra patógenos (Edreva, 2005). Las proteínas
PR fueron descubiertas en hojas de tabaco mediante la interacción de éstas
con el virus del mosaico del tabaco (TMV) por dos grupos independientes
(Gianninazzi, et al., 1970; Van Loon y Van Kammen, 1970). El término “PR”,
indica que son definidas como proteínas codificadas por la planta huésped
pero solamente son inducidas en situaciones patológicas o relacionadas a
ésta (Antoniw, et al., 1980; Van Loon, et al., 2006). Actualmente se
reconocen 17 familias de PR descubiertas y clasificadas en diferentes
especies vegetales (Van Loon, et al., 2006).
El SA tiene un papel muy importante dentro de la activación de la SAR,
puesto que los niveles de SA en las plantas aumenta significativamente
después de la infección de un patógeno compatible, y también se ha podido
comprobar la activación la SAR a través de la expresión de sus genes
marcadores tras la aplicación exógena de SA, así como algunos de sus
análogos como el Benzotiadiazol (BTH) (Görlach, et al., 1996) que ha sido
objeto de nuestro estudio.
El BTH es un análogo químico del SA que es capaz de inducir la defensa
en Arabidopsis (Lawton, et al., 1996; Görlach, et al., 1996) y es
comercializado como un activador de la SAR. El BTH induce la expresión de
genes como las PR (Lawton, et al., 1996). Un estudio reveló que el BTH
puede ser usado en nuevo modelo de percepción de SA, relacionando la
pérdida de masa con la activación de la defensa de las plantas (Figura 1.3)
aprovechando la baja fitotoxicidad del BTH en este modelo (Canet, et al.,
2010a).
14
Figura 1.3 Fenotipo macroscópico de plantas tratadas con agua (izquierda y con BTH
(derecha) al mismo tiempo (Tomado de Canet, et al., 2010a)
No todas las rutas de defensa están relacionadas con la SAR. Por
ejemplo, las rutas de señalización de insectos son totalmente diferentes de
la SAR. El daño producido por cierto tipo de insectos y herbívoros es
señalizado a través de la ruta del ácido octadecanoico con la producción de
oxilipinas, las cuales provienen de la peroxidación de ácidos grasos, como
el ácido linoleico y linolénico, que actúan como precursores de los
jasmonatos, los cuales activan la resistencia inducida a insectos y hongos
necrotrofos (Fidantsef, et al., 1999).
El sistema SAR, mediado por la acumulación de SA, inhibe la resistencia
inducida mediada por jasmonatos. Adicionalmente se observa que existe
una conexión entre ellos a través de una ruta que, hasta este momento es
desconocida. La descripción del proceso de señalización se muestra en la
Fig. 1.3 (Fidantsef, et al., 1999; Van Loon, et al., 2006).
15
Figura 1.3 Esquema de la señalización que se produce en el ataque de patógenos y de
insectos (Fuente: Fidantsef, et al., 1999).
Ha habido gran interés en encontrar mutantes incapaces de activar la
SAR, aunque sus concentraciones de SA sean lo suficientemente altas para
activarlo. Entre estos mutantes se ha caracterizado uno que bloquea la
señal para desencadenar la SAR y se conoce como NPR1 (Non expresser
of PR genes 1), que se caracteriza por la expresión nula de los genes PR
en presencia de SA (Cao, et al., 1997), presentándose una acentuada
susceptibilidad a patógenos, tanto bacterias como oomicetos tales como
Pseudomonas syringae patovar maculicola ES4326 y Hyaloperonospora
arabidopsidis Noco 2 (Clarke, et al., 2000). Se ha demostrado que NPR1
actúa a nivel de la ruta de señalización del SA, después de la síntesis del
mismo, pero antes de la expresión de genes de defensa. Por ello se ha
identificado como el gen clave en la percepción del SA y necesario para la
transducción de la señal de la presencia de SA hasta la activación del SAR
(Cao, et al., 1997; Yu, et al., 2001; Dong, 2004; An y Mou, 2011).
En otro estudio, se ha descrito un nuevo mutante, que es insensible a
BTH, que se ha denominado NRB4 (Non-response to BTH 4) Se ha
16
determinado que el gen NRB4 codifica una proteína del tipo Mediator,
ortólogo a MED15 en Arabidopsis y actúa después de la señalización de
NPR1 (Canet, et al., 2012).
Un estudio reciente caracterizó dos parálogos de NPR1, NPR3 y NPR4,
los cuales se han descrito como receptores de la ruta del SA. En este
modelo, la activación se produce por la degradación de NPR1 en el
proteasoma, mediada por SA. Esta afirmación se apoya en el hecho que la
proteína NPR1 (la cual tiene un dominio BTB), se degrada en el
proteasoma, unida a NPR3 y NPR4 (que tienen dominios Cullin 3 ubiquitín
E3 ligasas), con distintas afinidades y mediada por la interacción de SA con
estas nuevas proteínas (Fu, et al., 2012). Sin embargo, otros autores
proponen que NPR1 es el auténtico receptor del SA (Wu, et al., 2012).
Además de la señalización del sistema de defensa, el SA influye en
muchos otros procesos fisiológicos de la planta, tales como desarrollo de la
plántula, el cierre de los estomas y la respuesta a estreses abióticos.
(Rivas-San Vicente y Plasencia, 2011).
El SA es una molécula versátil, que actúa en muchos procesos
regulatorios, por lo que su estudio es muy importante en el ámbito del
desarrollo vegetal.
17
II.
OBJETIVOS
Una vez que se ha definido los integrantes más recientes de la ruta de
señalización mediada por SA, aún quedan espacios dentro de la ruta que
deben ser llenados. Estos espacios están definidos antes y después de la
percepción de la molécula señalizadora y es muy importante encontrar las
proteínas que actúan en esos pasos, puesto que muchos procesos de
interacción biótica con el medio ambiente dependen de la discriminación por
parte de la planta entre qué es patógeno y qué no es patógeno, es decir,
una interacción simbiótica y una infección.
Como la ruta es muy compleja y se conocen muy pocos integrantes, es
bastante probable en que se encuentre, mediante el análisis de mutantes
algún candidato que pueda encajar dentro. Mediante el uso de BTH como
análogo del SA, se han descrito algunos mutantes que son insensibles a
este análogo, que pueden actuar como candidatos a genes de señalización.
Con estos antecedentes, de una colección de mutantes nrb se ha
escogido un grupo de complementación, denominado nrb2, para su
caracterización, y para ello nos hemos planteado los siguientes objetivos:
-
Caracterizar genéticamente la mutación nrb2, mediante mapeo
genético, análisis de segregación y secuenciación para determinar
exactamente la identidad del gen, así como su posición dentro del
genoma.
-
Caracterizar fenotípicamente el grupo de alelos nrb2 para determinar
si existen diferencias entre cada uno de ellos
18
III.
MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 Material Vegetal
El material vegetal utilizado para esta investigación proviene de una
colección de mutantes sin respuesta a BTH (un regalo de Syngenta,
Madrid), descrita por Canet, et al., (2010b) El mutante está definido por seis
alelos: n204 (nrb2-1), n208 (nrb2-2), n212 (nrb2-3), n218 (nrb2-4), n221
(nrb2-5) y n225 (nrb2-6). Los alelos están en fondo NPR1H, que
originalmente es un fondo Columbia con una copia de un transgén que
sobreexpresa NPR1 (35S::NPR1) (Cao, et al., 1998). Todos los reactivos y
oligonucleótidos utilizados provienen de Sigma (Barcelona).
3.2 Mapeo genético de la mutación
Para la población de mapeo se utilizaron las progenies de los mutantes,
cruzados con un ecotipo diferente al parental y seleccionadas por su
ausencia de respuesta al BTH. El ecotipo para el mapeo es Landsberg
erecta (La-er) y el fondo de la mutación es NPR1H.
Se hizo un mapeo preliminar del grupo de alelos utilizado en el presente
estudio mediante el uso de marcadores moleculares tipo microsatélites
proporcionados por el INRA (Institut National de la Recherche Agronomique,
París, Francia) y por PCR se evaluó cada cromosoma en busca de posibles
regiones génicas donde mapeaba la mutación, utilizando como controles
La-er y NPR1H.
Adicionalmente, se extrajo DNA de una población de mapeo nrb2-1 x Laer para corroborar las zonas de mapeo. Este DNA se secuenció por la
empresa BGI (Hong-Kong, China) y se analizó por la técnica de mapeo por
secuenciación denominada Next-Generation Maping, NGM (Austin, et al.,
2011)
a
través
de
la
herramienta
(http://bar.utoronto.ca/NGM/).
19
en
línea
NGM
3.3 Análisis de segregación
Para el análisis de segregación se realizó el cruce de dos alelos: nrb2-1
y nrb2-4 con los ecotipos Col-0, La-er y el parental NPR1H. A partir de la F1
se autopolinizó y se obtuvo la F2 segregante, que fue utilizada para el
estudio. Se sembraron 200 semillas de cada cruce y se realizaron
aplicaciones de BTH 350 µM, según el procedimiento de Canet, et al.
(2010a). Al cabo de 4 aplicaciones se contaron las semillas germinadas y
plantas desarrolladas; y entre las desarrolladas, las que responden al BTH y
las que no lo hacen. El experimento se repitió tres veces de forma
independiente.
Como un control adicional, se sembraron semillas del cruce F2 La-er x
nrb2-4 y se trataron con BTH. Esta vez se aislaron plantas con respuesta y
sin respuesta a BTH para realizar un mapeo en las zonas donde se localiza
la mutación. Los resultados del mapeo se contrastaron con la evaluación
fenotípica de la descendencia F3 de estas plantas para observar la fijación
de las mutaciones en el genoma La-er.
3.4 Caracterización fenotípica
3.4.1
Peso fresco
Para verificar el efecto que tiene el BTH sobre el mutante se crecieron
dos tandas de plantas: A un grupo se le trató con BTH, según el
procedimiento de Canet, et al. (2010a) y al otro se le tomó como control.
Como controles positivos se usaron los ecotipos Col-0 y NPR1H (Cao, et
al., 1998); y como control negativo npr1-1 (Cao, et al., 1997). Después de 4
aplicaciones, se pesaron 15 plantas de cada miembro del grupo y de cada
tratamiento dividido en tres medidas. Una vez que se tuvieron todos los
pesos, se calculó la media y la desviación estándar para cada individuo y
con ello el porcentaje en peso fresco en comparación con su tratamiento
20
control. El experimento se repitió tres veces de forma independiente con
resultados similares.
3.4.2
Germinación en ácido salicílico
Para determinar la sensibilidad de los miembros del grupo de
complementación al SA, se germinaron las semillas en placas con medio
Murashige Skoog (MS) 0.5x en agar, 2% p/v de sacarosa, suplementados
con SA a una concentración final de 0.5 mM. Como tratamiento control se
utilizó solo medio 0.5x MS en agar, 2% p/v de sacarosa. El grupo de
complementación utilizado tiene NPR1H, por lo que los controles usados
para éste fueron NPR1H (Cao, et al., 1998) y npr1-1 (Cao, et al., 1997). Las
semillas fueron esterilizadas inicialmente con etanol comercial al 96% y
calentadas a 65ºC durante 10 minutos y luego con formaldehído al 1% v/v y
SDS 1% durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación.
Posterior a esto se realizaron 5 lavados a las semillas con agua destilada
estéril para retirar el formaldehído. Las semillas se resuspendieron en agua
destilada estéril y se plaquearon en los medios con y sin SA. Las placas con
semillas fueron selladas e incubadas a 4ºC y oscuridad durante 2 días y
luego a 24ºC a régimen de día largo, contando como día cero desde que se
coloca en la cámara de incubación, durante 14 días. Las placas se
fotografiaron al día 14. El experimento se repitió tres veces de forma
independiente.
3.4.3
Curvas de crecimiento bacteriano
Para todos los experimentos, las plantas de Arabidopsis fueron
sembradas en macetas pequeñas, mantenidas a 4ºC y oscuridad durante
tres días y luego transferidas a cabinas de crecimiento con régimen de día
corto (8 horas de luz, 16 de oscuridad) a 21ºC con luz y 19ºC con oscuridad.
Las plantas utilizadas eran de 2 semanas de edad. La bacteria
Pseudomonas syringae patovar tomato DC3000 (Pto) transformada con el
vector vacío pVSP61 fue utilizada para estudiar la interacción planta –
21
bacteria compatible; y dos cepas derivadas de Pto: avrRpm1 que es una
cepa de Pto con el gen avrRpm1 de Pseudomonas syringae patovar
macuicola cepa Psm M2 (Ritter y Dangl, 1995); y avrRpt2 que es una cepa
isogénica de Pto con el gen avrRpt2 (Chen, et al., 2004) para estudiar la
interacción
planta
–
patógeno
incompatible.
Ambas
cepas
fueron
mantenidas como describen Ritter y Dangl (1996) y fueron cultivadas,
inoculadas y recuperadas como describen Tornero y Dangl (2001) con
ligeras modificaciones. Como controles para la interacción compatible se
utilizaron Col-0, NPR1H (Cao, et al., 1998) y npr1-1 (Cao, et al., 1997),
mientras que para las interacciones incompatibles se utilizaron NPR1H
(Cao, et al., 1998) y rar1 ndr1 (Tornero, et al., 2002) El experimento se
repitió tres veces de forma independiente.
22
IV.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1 Caracterización genética
Una vez que se ha determinado el fenotipo, se procedió al mapear el
gen mutado, responsable del fenotipo. El rastreo que se realizó con los
marcadores dio como resultado dos regiones fijadas: la primera en el
cromosoma I, que abarca casi la totalidad del mismo (aproximadamente 25
Mb); y la segunda en el cromosoma III, que abarca aproximadamente 6 Mb
en las cercanías de la zona centromérica (Figura 4.1) Los resultados del
mapeo fino en la zona del cromosoma III fijada confirmó la zona de mapeo.
Figura 4.1 Esquema representativo de las zonas mutantes obtenidas por mapeo
convencional. En celeste se representan las zonas mutantes, en gris las heterocigotas y las
rojas silvestre.
Para tratar de obtener una posición de mapa más definida, se envió a
secuenciar una población F2 nrb4-1 x La-er seleccionada por BTH. Los
datos de secuenciación destacan una concentración de polimorfismos en
zonas específicas del cromosoma I (Fig 4.2a) y del cromosoma III (Fig
4.2b).
23
Figura 4.2 Zonas cromosómicas obtenidas por secuenciación, donde los picos indican
alta tasa de variación a) Cromosoma I; b) Cromosoma III
Estos datos de mapeo por secuenciación, confirman parcialmente los
resultados del datos de mapeo con marcadores, ya que éste destaca un
enriquecimiento de zonas Col-0 a lo largo de casi todo el cromosoma I. El
mapeo por secuenciación destaca una zona altamente enriquecida en
polimorfismos en una estrecha zona del cromosoma I, correspondiente a la
zona de mapeo, pero no abarcando la totalidad de la misma. Esto se puede
explicar a que posiblemente, las mutaciones que producen el fenotipo nrb2
no destaquen entre los polimorfismos de Col-0 frente a La-er, o puede
haber otro motivo, como se menciona a más adelante en este trabajo.
La secuenciación y posterior análisis de la población de mapeo dio tres
posibles genes candidatos: dos candidatos en el cromosoma I y uno en el
cromosoma III. Sin embargo, al secuenciarse los genes candidatos aislados
de otros alelos de nrb2, se encontró que no estaban mutados. Para tratar de
cubrir cualquier eventualidad, se decidió secuenciar directamente otros tres
alelos. En el momento de escribir este trabajo, la secuencia ha sido
recibida, y se están analizando diferentes candidatos. Lo que si podemos
24
afirmar es que en los alelos secuenciados (cuatro en total), no existe
ninguna mutación en NPR1H, tanto en el gen silvestre como en el transgén.
A la par de este experimento, se realizó el análisis de segregación para
explicar la fijación de dos zonas de mapeo. Como resultado de este análisis
se obtuvo una distribución χ2 acorde con una interacción de dos genes, uno
dominante (A*, siendo el gen silvestre A) y uno recesivo (b, siendo el gen
silvestre B) (Tabla 4.1). Los datos del análisis de segregación se ajustan a
todos los cruces realizados (nrb2 x Col-0, La-er y NPR1H), por lo que se
excluye nuevamente a NPR1 como uno de los genes mutados, así como
también se excluye una interacción de mutaciones por genotipo. Para
confirmar estos resultados, se obtuvo la F3 de las plantas F2 del cruce Laer x nrb2-4 utilizadas en el análisis de segregación. Se seleccionaron las F2
por su respuesta o no al BTH y se realizó un barrido con los marcadores
utilizados para el mapeo genético grosero, con el fin de verificar su
estructura genética.
2
Tabla 4.1 Valores de χ de las segregaciones F2 que se ajustan a la distribución de dos
genes: 1 dominante y 1 recesivo (3/16 de fenotipo nrb).
nrb2-4 x
NPR1H
Experimento 1
Experimento 2
Experimento 3
Silvestre
E
O
125 115
125 120
120 112
nrb
O
17
23
18
E
27
28
26
Total
142
148
138
χ2 (1 g.l =
3,84)
3,84
0,80
2,59
Valor p
0,049774384
0,370762063
0,107734555
El rastreo con los marcadores mostró resultados sorprendentes, ya que
existían individuos heterocigotos entre las plantas F2 que presentaban la
mutación nrb2 (Figura 4.3b) y el fenotipado de las descendencias F3
obtenidas de cada uno de los individuos F2 estudiados en el análisis de
segregación mostró que los individuos nrb2 heterocigotos, aún seguían
segregando la mutación (Figura 4.4).
25
Figura 4.3 Estructura genética de varios individuos F2 con fenotipo nrb2 y la
segregación y fenotipo de la correspondiente descendencia F3; a) individuo nrb2
homocigoto Col -0 para todos los marcadores b) individuos nrb2 heterocigotos para la los
marcadores
Figura 4.4 Análisis de segregación de la progenie F2 del cruce nrb2-4 x La-er. La
imagen de la izquierda corresponde a la F3 de padres con fenotipo silvestre y a la derecha
F3 con padres de fenotipo nrb. Las flechas representan los fenotipos de segregación en
cada uno de los casos.
Sin embargo, en el análisis de segregación se pudo evidenciar también
una reducción en el porcentaje de germinación en todos los cruces F2,
especialmente en el cruce con La-er (Tabla 4.2), así como la presencia de
26
plantas que germinaban y paraban su desarrollo en un punto específico y
luego
morían
(Figura
4.5a
y 4.5b). De
estas plantas, llamadas
coloquialmente “pasmadas” a falta de una palabra más apropiada, se tiene
el DNA guardado para genotiparlas adecuadamente cuando se identifiquen
las mutaciones responsables de nrb2.
Tabla 4.2 Valores de porcentaje de germinación y desarrollo de las plantas F2 utilizadas en
el estudio donde se puede observar la reducción de la germinación y el desarrollo en los
cruces con La-er.
Genotipo
La-er x nrb2-4
La-er x nrb2-1
Semillas
Germinadas
68/200
59/200
%
34
29,5
Plantas
Desarrolladas
48/200
46/200
%
24
23
Figura 4.5 a) Plantas germinadas de los cruces La-er x nrb2-4 que se “pasman” en su
desarrollo. La primera planta de la izquierda es un control de desarrollo normal; b) Aspecto
que tienen las plantas en la placa. b) Las mismas plantas en comparación con otras con
desarrollo normal
Con estos nuevos resultados, se analizó la posibilidad de que estos
nuevos fenotipos estén relacionados con la mutación nrb2, y con lo que se
especula que hay por lo menos un gen más adicional interviniendo en el
fenotipo nrb2, y conociendo que la zona de mapeo del cromosoma I es muy
grande, esta posibilidad se hace más viable.
27
Al final la nueva hipótesis afirma que al menos dos genes
independientes en el cromosoma I y un gen en el cromosoma III podrían ser
los responsables del fenotipo nrb2 y que al menos uno de los tres genes
tiene que ser recesivo, en este caso, el del cromosoma III que es el que
mapea de mejor manera.
Ajustando los datos del análisis de segregación, los datos del genotipado
de F2 y fenotipado de F3, con los datos de mapeo y secuenciación se ha
propuesto un modelo genético que explique la mayoría de los datos
obtenidos. El modelo postula que: Siendo A y B las formas silvestres de los
genes en el cromosoma I y C la forma silvestre en el cromosoma III, para
que la mutación nrb se exprese, el genotipo debe ser: Heterocigoto u
homocigoto mutante en A y en B y mutante en C (A*_B*_cc).
Sin embargo, este modelo se ajusta parcialmente a los datos de la
secuenciación, puesto que ésta muestra una zona específica de
concentración de polimorfismos a manera de un pico, mientras que el
mapeo con marcadores muestra una amplia zona enriquecida en Col-0 a
manera de meseta. Esto se debería a la posibilidad de que las mutaciones
que producen el fenotipo nrb2 no destaquen entre los polimorfismos de Col0 frente a La-er como se mencionó anteriormente. La proporción de
fenotipos mutantes con relación al total de individuos según el modelo
propuesto es de 9/64 y los datos de la χ2 sobre este valor de segregación se
ajustan parcialmente también (Tabla 4.3).
2
Tabla 4.3 Valores de χ de las segregaciones F2 que se ajustan a la distribución de tres
genes: 2 dominantes y 1 recesivo (9/64 de fenotipo nrb).
nrb2-4 x NPR1H
Experimento 1
Experimento 2
Experimento 3
WT
Nrb
Total
χ2 (1 g.l =
Valor p
E O E
O
125 122 17 20
142
3,84)
0,3551
125 127 23 21
148
0,1592
0,6898
120 119 18 19 1138
0,0492
0,8243
28
0,5512
Con estos resultados, especulamos que en este modelo, las proteínas
codificadas por estos tres genes hipotéticos podrían interactuar entre sí, de
una forma desconocida, actuando en forma conjunta para expresar el
fenotipo silvestre. También sugiere que la proteína C es muy importante en
la expresión del fenotipo silvestre en una interacción muy estrecha con los
genes A y B. Esto indica la posibilidad de que A, B, y C puedan ser genes
parálogos, producto una duplicación génica y posterior neofuncionalización.
Los genes A y B, al ser tan similares, podrían ser capaces por su cuenta de
sostener el fenotipo silvestre (o al menos un porcentaje de este) cuando uno
de los dos sea silvestre.
Al proponer este modelo, también se sugiere implícitamente que
pudiesen existir fenotipos intermedios entre silvestres y nrb2, incluso
fenotipos letales o de detrimento del desarrollo como las plantas
“pasmadas” o un porcentaje de las semillas que no germinan. Estos
fenotipos, al ser más sutiles, o en otros casos inviables, pueden pasar
desapercibidos a simple vista y requerirían un análisis más profundo para
detectarlos
Como ejemplo de un comportamiento similar en una familia génica, se
conoce que existen cinco genes en Arabidopsis con homología con NPR1
(Liu, et al., 2005), de los cuales NPR3 y NPR4 están relacionados con la
defensa (Zhang, et al., 2006; Fu, et al., 2012) y se conoce que existe
redundancia parcial entre ellos (Canet, et al., 2010b). Esta característica no
tiene por qué ser igual en el caso de nrb2; sin embargo, el hecho de que la
redundancia parcial sea un aspecto clave en el caso de NPR1 nos da una
pista de lo importante que es esta ruta de señalización y da pie a que los
demás componentes de la ruta que aún no se conocen presenten
características similares.
Independientemente de la redundancia funcional, aún quedan muchos
integrantes de la ruta de SA por dilucidar. Como un claro ejemplo, un
estudio describió NRB4 como un nuevo gen importante dentro de la ruta de
percepción de SA y parte integrante del complejo Mediator (Canet, et al.,
29
2012). Esto es una muestra de lo necesaria que se hace la caracterización
de todos los integrantes de la ruta de percepción de SA, de la que podría
formar parte NRB2 también.
4.2 Caracterización Fenotípica
La caracterización fenotípica mostró que los mutantes nrb2 analizados
tienen una sensibilidad reducida al BTH. El análisis de peso fresco indica
que los alelos de nrb2 presentan diferencias de sensibilidad entre ellos (Fig
4.6).
Básicamente el BTH promueve una reducción en tamaño y masa, es
decir, existe una relación inversamente proporcional entre respuesta a BTH
y peso fresco, lo que quiere decir que ante un mayor peso fresco en plantas
tratadas con BTH, presentan una menor respuesta a BTH. Estos resultados
indican que los mutantes nrb2 tienen diferentes niveles de percepción del
SA.
Figura 4.6 Porcentaje de peso fresco del mutante y sus alelos con respecto a los
controles tras ser tratadas con BTH. Esta gráfica y las siguientes muestran la media, y las
barras de error con la desviación estándar.
30
Las semillas de las plantas germinadas en presencia de SA demuestran
que el mutante, presenta una sensibilidad reducida con respecto al
tratamiento sin SA, y con respecto a sus controles, como se muestra en la
figura 4.7. Si bien, la insensibilidad no es total, es suficiente para
diferenciarse de los controles utilizados.
31
Figura 4.7 a. Plantas de Arabidopsis germinadas en medio MS sin SA. b. en medio
MS con SA. Las plantas en medio con SA presentan deficiencias en el crecimiento
en comparación con el control.
32
Una característica interesante en el estudio es que las plantas del
mutante npr1-1 presentan fallos en el metabolismo del SA (Cao, et al,
1997). Es decir, que al no percibir la señal que se trasmite a través del SA,
éste no puede degradarse y se acumula, afectando significativamente la
homeostasis de la planta. Entre los efectos más visibles de esta condición
está la reducción acusada del tamaño y el blanqueamiento de los
cotiledones de las hojas (Canet, et al., 2010a), así como la atrofia de las
raíces. Como se puede observar en la figura 4.7, nrb2 comparte este
fenotipo con npr1-1.
Los resultados de estos experimentos demuestran la importancia de la
ruta de SA en los fenotipos de nrb2. Los experimentos de reducción del
peso fresco como medida de respuesta a BTH, así como el crecimiento en
SA indican que el mutante nrb2 tiene afectada la ruta de percepción del SA.
La interacción planta – bacteria compatible (Pto) demostró que el
mutante nrb2 presenta mayor susceptibilidad frente a infección de este
patógeno (Fig 4.8). Similar resultado se observó en las interacciones planta
- bacteria incompatible, tanto Pto(avrRpm1) como Pto(avrRpt2) donde el
mutante mostró altas concentraciones de bacteria en comparación con el
control NPR1H (Fig 4.9a y 4.9b). Estos resultados sugieren que este gen es
importante en la respuesta general a la presencia de patógenos del tipo
biotrofos. Además de la alta concentración de bacterias encontradas en los
mutantes, igual que en los datos de peso fresco se encontraron ligeras
diferencias entre alelos, diferencias que pueden ser relevantes una vez se
caractericen las mutaciones responsables de los fenotipos.
33
Figura 4.8 Curvas de crecimiento de la bacteria Pseudomonas syringae patovar tomato
DC3000 (Pto) en interacción compatible tras ser tratadas con SA, BTH o agua
34
Figura 4.9 a) Curva de crecimiento de Pto (avrRpm1) en interacción incompatible; b)
Curva de crecimiento de Pto (avrRpt2) en interacción incompatible
Cabe recalcar que no se encontró ningún alelo que muestre
contradicciones entre los resultados de peso fresco y crecimiento de
bacterias, es decir, todos los alelos que no responden a peso muestran
altas concentraciones de bacterias.
35
Asimismo, se encontró que ninguno de los alelos diferencia el SA del
BTH en cuanto a percepción, ya que todos los alelos presentan una
respuesta similar, tanto al BTH como al SA.
Los datos muestran una correspondencia entre peso fresco y la
respuesta a Pto, por eso se hace factible una selección de mutantes basada
en el peso tras tratar con BTH, como medida directa de su respuesta a SA,
por lo que podemos confirmar que el mutante nrb2 está afectado en el
sistema de defensa mediado por SA.
Así también, el hecho de que el mutante reaccione de manera similar
tanto en la interacción compatible como en la incompatible con AvrRpm1 y
AvrRpt2, indica que la ruta en el mutante podría estar afectada en cierto
grado en la activación general de la HR (de Wit, 2007). Como se explicó
anteriormente, la HR está directamente asociada con la ruta de señalización
de SA (Dangl, et al., 1996; Ryals, et al., 1996).
36
V.
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
5.1 Conclusiones
-
El análisis genético de la mutación indica que el fenotipo mutante nrb2
de Arabidopsis thaliana es provocado por mutaciones en varios genes,
localizados a lo largo de casi todo el cromosoma I (aproximadamente 29
Mb) y en una parte del cromosoma III (aproximadamente 6 Mb). Los
datos de la secuenciación se contraponen a estos resultados, ya que
indican picos de polimorfismos en zonas del cromosoma I y III
correspondientes a la zona de mapeo. Sin embargo, este resultado se
puede justificar con la posibilidad de que las mutaciones que producen el
fenotipo nrb2 no destaquen entre los polimorfismos de Col-0 frente a Laer
-
El modelo propuesto para la mutación indica que al menos dos genes
son los responsables de la mutación nrb2, un dominante en el
cromosoma I y un recesivo en el cromosoma III
-
La
presencia
de
fenotipos
de
detrimento
como
las
plantas
coloquialmente llamadas “pasmadas”, el bajo porcentaje de germinación
y la presencia de varios fenotipos intermedios, podrían sugerir que sean
al menos tres genes los responsables del fenotipo nrb2, siendo dos
dominantes en el cromosoma I y un recesivo en el cromosoma III. Los
datos se ajustan a ambos modelos, pero se precisan más estudios para
decantarse por uno de ellos
-
Una posibilidad de este modelo es que los tres genes sean parálogos,
con un origen común a partir de duplicaciones génicas y que se hayan
diferenciado entre sí por un proceso de neofuncionalización, siendo el
gen del cromosoma III el que mayor cambio habría sufrido. Siguiendo
esta línea de especulación, estos genes interactuarían entre sí para
garantizar el fenotipo normal de una manera aún desconocida.
37
-
El análisis fenotípico de la mutación indica que el mutante estudiado
nrb2 presenta un nivel de percepción de SA muy bajo, basado en los
análisis de peso fresco. La misma conclusión se obtiene del crecimiento
de bacteria después de aplicar SA o BTH.
-
Las curvas de crecimiento bacteriano indicaron que los alelos mutantes
presentan una mayor susceptibilidad a la infección por bacterias en
comparación con los controles silvestres, pero menor susceptibilidad en
comparación con el mutante npr1-1. Éste resultado se dio tanto en las
interacciones planta – bacteria compatible, como en la interacción planta
– bacteria incompatible guardando las respectivas proporciones.
5.2 Recomendaciones
-
Verificar si existe respuesta hipersensible (HR) en las hojas de las
plantas mutantes con bacteria incompatible, para confirmar el fenotipo
observado en curvas de crecimiento.
-
Obviamente, clonar los genes responsables de la mutación. Esto
permitirá comprobar una de las hipótesis mencionadas anteriormente;
que las proteínas correspondientes a los genes responsables de la
mutación interaccionan directamente.
-
Es muy importante conocer la respuesta de nrb2 en presencia de otras
mutaciones afectadas en la ruta de SA; Por esta razón se inició con la
obtención de los dobles mutantes de nrb2 con algunos mutantes de la
ruta de SA como npr1-1 y nrb4-1. Hasta la fecha se han obtenido plantas
heterocigotas para nrb4-1 que no responden a la adición de BTH, con
las cuales se podría obtener los dobles mutantes nrb2-4 nrb4-1 para los
análisis respectivos, pero es necesario continuar con el programa de
obtención.
38
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