FUNDACION BARCELO – FACULTAD DE MEDICINA BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR – Dr Eduardo Kremenchutzky – Profesor Titular DOGMA CENTRAL DE LA BIOLOGIA MOLECULAR DUPLICACION – TRANSCRIPCION - TRADUCCION Reseña histórica de la Genética La construcción de la Genética constituye una de las aventuras intelectuales más apasionantes y prodigiosas de la mente humana. Aunque la Genética es una ciencia del siglo XX -pues se inicia con el redescubrimiento de las leyes de Mendel en 1900 y no fue hasta 1906 que el británico William Bateson acuñó el término y escribió el primer libro de texto-, los avances conceptuales del siglo XIX fueron fundamentales para el pensamiento genético posterior. La segunda mitad del siglo XIX Durante el periodo 1850-1900 la biología emerge de los últimos vestigios medievales y aristotélicos y surge una visión unificada cuyo paradigma no es esencialmente distinto del nuestro. La teoría celular se había establecido ya en los años 30, pero en 1858 el fisiólogo alemán R. Virchow introduce una generalización adicional, el principio de la continuidad de la vida por división celular, que sintetiza en su célebre frase omnis cellula e cellula. Se establece entonces la célula como la unidad de reproducción. El reconocimiento de la célula como unidad reproductora condujo al abandono de la generación espontánea y del preformacionismo. Un animal o una planta se originan de una simple célula mediante un proceso epigenético, a través de sucesivos estados de diferenciación de un huevo indiferenciado. La célula contiene las potencialidades de generar un organismo. Esta generalización llevó casi compulsivamente a la búsqueda de la base material de la herencia. El naturalista británico Charles Darwin introduce en su libro de 1859 El origen de las especies la segunda gran unificación del siglo XIX: la teoría de la evolución biológica. Según ésta, la formas orgánicas ahora existentes proceden de otras distintas que existieron en el pasado, mediante un proceso de descendencia con modificación. Darwin reunió una evidencia arrolladora procedente de muy diversas disciplinas de investigación biológica en favor del hecho evolutivo y logró que esas disciplinas convergieran un una única explicación: la selección natural. Con el objeto de imponer estas dos revolucionarias concepciones Darwin introduce una nueva y radical perspectiva metafísica: el pensamiento poblacional. En contraste con la visión esencialista dominante en su tiempo, la variación individual, lejos de ser trivial, es para Darwin la piedra angular del proceso evolutivo. Son las diferencias existentes entre los organismos en el seno de una población las que, al magnificarse en el espacio y en el tiempo, constituirán la evolución biológica. La teoría de la evolución fue casi inmediatamente aceptada por la comunidad científica, pero su teoría de la selección natural tuvo que esperar hasta la tercera década del siglo XX para su aceptación general. El esquema de Darwin carecía de una explicación para el origen y el mantenimiento de la variación genética sobre la que opera la selección. Años después del Origen, en 1868, 1 FUNDACION BARCELO – FACULTAD DE MEDICINA BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR – Dr Eduardo Kremenchutzky – Profesor Titular Darwin intenta explicar el fenómeno de la herencia a través de la hipótesis provisional de la pangénesis. Esta hipótesis es el resultado de un intenso trabajo de recopilación e interpretación conceptual de un gran número de observaciones y experimentos, que se recogen en un tratado de dos volúmenes The variation of animals under domestication. En ella postula la existencia de partículas hereditarias o de reproducción, que llamó gémulas. Cada parte del organismo e incluso partes de las células producen sus propias y específicas gémulas -los ojos, las gémulas de los ojos, el corazón las gémulas del corazón-. Las gémulas fluyen por todas las partes del cuerpo, de modo que en cada parte, tales como en los óvulos y el esperma, pueden encontrarse todos los tipos de gémulas. Así las células reproductoras tienen la potencialidad de desarrollar un organismo completo. Contrariamente a las conclusiones del Origen, su hipótesis de la herencia resultó errónea, como demostró, entre otros, su sobrino Francis Galton en un experimento de transfusión sanguínea recíproca entre dos cepas de conejos que diferían en su color. De cualquier modo, su trabajo estimuló el pensamiento genético. Tres años antes del tratado de Darwin sobre la herencia, en 1865, el monje austríaco Gregor Mendel publicó el trabajo Experimentos de hibridación en plantas en el Boletín de la Sociedad de Ciencias Naturales de Brno (Moravia, actualmente en la República Checa). En él se resumían experimentos que había llevado a cabo durante 8 años en el guisante Pisum sativum. El trabajo de Mendel se enmarcaba dentro del paradigma de la teoría de la evolución, pues una de las razones para efectuar dicho trabajo era "alcanzar la solución a una cuestión cuya importancia para la historia evolutiva de las formas orgánicas no debería ser subestimada". Sus experimentos son el paradigma del análisis genético y su trabajo es considerado fundacional de la ciencia de la Genética. Un diseño experimental sencillo junto con un análisis cuantitativo de sus datos fue la fuerza principal de su trabajo. Los experimentos demostraron que (1) la herencia se transmite por elementos particulados (refutando, por tanto, la herencia de las mezclas) que (2) siguen normas estadísticas sencillas, resumidas en sus dos principios. Pero el momento no era propicio y el nuevo paradigma de la ciencia de la Genética debería esperar 35 años. Y no fue, como se ha creído, porque su trabajo fuera desconocido. El trabajo de Mendel fue, simplemente, inapreciado. Mendel intercambió correspondencia con el alemán Carl Nägeli, unos de los más preeminentes botánicos del momento. Éste no pareció muy impresionado por su trabajo y le sugirió a Mendel que estudiara otras plantas, entre otras Hieracium, en la que Nägeli estaba especialmente interesado. En ella Mendel no encontró normas consistentes en la segregación de sus caracteres y empezó a creer que sus resultados eran de aplicación limitada, por lo que su fe y entusiasmo en su trabajo disminuyó. No fue hasta mucho tiempo después de la muerte de Mendel, en 1903, que se descubrió que un tipo especial de partenogénesis ocurre en Hieracium, la cual produce desviaciones de las proporciones esperadas. Debido al olvido y a la desidia hacia su trabajo, se puede afirmar que sin Mendel la ciencia de la Genética posiblemente sería la misma. Nuevas técnicas citológicas, el desarrollo del micrótomo y de las lentes de inmersión en aceite en la década 1870-80, condujeron al descubrimiento de la fecundación, la fusión de los núcleos del óvulo y del esperma para formar el núcleo del huevo, y la mitosis. En 1784 Nägeli enuncia la teoría del idioplasma, que establece que el núcleo celular es el vehículo de la herencia. En 1883 van Beneden trabajando en el nemátodo Ascaris 2 FUNDACION BARCELO – FACULTAD DE MEDICINA BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR – Dr Eduardo Kremenchutzky – Profesor Titular descubre la meiosis y reconoce la individualidad de los cromosomas. T. Boveri, en un programa de investigación que se inicia en 1888 y acaba en 1909, demuestra que los cromosomas mantienen su estabilidad entre generaciones. A partir de 1880 había un acuerdo general que el material hereditario residía en los cromosomas -a pesar que esto no estuvo completamente claro hasta 1916. El alemán August Weismann enuncia en 1885 su teoría de la continuidad del plasma germinal. En ella reconoce dos tipos de tejidos en los organismos, el somatoplasma y el germoplasma. El primero forma la mayor parte del cuerpo de un individuo, mientras que el germoplasma era una porción inmortal de un organismo que tenía la potencialidad de duplicar a un individuo. A diferencia de la teoría de la pangénesis, el germoplasma no proviene del somatoplasma ni se forma nuevamente cada generación, sino que constituye la continuidad de la información genética entre generaciones. Su teoría rechazaba rotundamente la herencia de los caracteres adquiridos y supuso un mayor énfasis en el material hereditario. Se llamó Neodarwinismo a la fusión de la teoría de la evolución por selección natural y la hipótesis del plasma germinal de Weissmann. En 1883 Weismann propuso la teoría de que las partículas hereditarias o bióforas eran invisibles, autorreplicativas y asociadas con los cromosomas de un modo lineal y postuló que cada biófora estaba implicada en la determinación de una característica. Su intuición fue realmente prodigiosa. En 1871 el médico suizo Fiedrich Miescher aisló nucleína de núcleos de células de pus humanos, hoy sabemos que esta nucleoproteína forma la cromatina. En 1886 el citólogo americano E. B. Wilson sugiere una relación entre la cromatina y el material genético. El siglo XX 1900-1940: la Genética clásica La entrada en el siglo XX produce una explosión de nuevos descubrimientos que ya no se detendrá, y que se continuará a un ritmo siempre creciente. Se resumirán brevemente los avances principales. En la primera década se produce la síntesis de los trabajos genéticos (de hibridación experimental) y citológicos. Esta síntesis simboliza la mayoría de edad de la Genética, iniciándose como ciencia propia e independiente. El siglo empieza con el redescubrimiento de las leyes de Mendel por los trabajos de 3 botánicos: Carl Correns, Hugo de Vries y Eric Von Tschermak, a las que el británico William Bateson dará un gran impulso. Se produce una integración inmediata de los estudios genéticos y citológicos. En 1902, Boveri y Sutton se percatan, de forma independiente, de la existencia de un estrecho paralelismo entre los principios mendelianos recién descubiertos y la conducta de los cromosomas en la meiosis. En 1905 Bateson acuñó (en 1901 había introducido los términos alelomorfo, homocigoto y heterocigoto) el término genética para designar "la ciencia dedicada al estudio de los fenómenos de la herencia y de la variación". En 1909 el danés Wilhelm Johannsen introduce el término 3 FUNDACION BARCELO – FACULTAD DE MEDICINA BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR – Dr Eduardo Kremenchutzky – Profesor Titular gen como "una palabrita... útil como expresión para los factores unitarios... que se ha demostrado que están en los gametos por los investigadores modernos del mendelismo". Durante la segunda década de este siglo Thomas Hunt Morgan y su grupo de la Universidad de Columbia inician el estudio de la genética de la mosca del vinagre Drosophila melanogaster. En 1910 descubren la herencia ligada al X y la base cromosómica del ligamiento. En 1913 A. H. Sturtevant construye el primer mapa genético y en 1916 Calvin Bridges demuestra definitivamente la teoría cromosómica de la herencia mediante la no disyunción del cromosoma X. En 1927 H. J. Muller publica su trabajo en el que cuantifica mediante una técnica de análisis genético (la técnica ClB) el efecto inductor de los rayos X de letales ligados al sexo en Drosophila. En 1931 Harriet Creighton y Barbara McClintock en el maíz y Gunter Stern en Drosophila demuestran que la recombinación genética está correlacionada con el intercambio de marcadores citológicos. Todos estos descubrimientos condujeron a la fundación conceptual de la Genética clásica. Los factores hereditarios o genes eran la unidad básica de la herencia, entendida tanto funcional como estructuralmente (la unidad de estructura se definía operacionalmente por recombinación y por mutación). Los genes, a su vez, se encuentran lineal y ordenadamente dispuestos en los cromosomas como perlas en un collar. Paralelamente a estos avances, otro conflicto que había surgido con el Origen de Darwin empezó a resolverse. Era el problema de la naturaleza de la variación sobre la que se produce la evolución. Mientras que Darwin puso énfasis en la evolución gradual y continua que transforma la variación dentro de las poblaciones en variación entre poblaciones, otros, como Thomas Huxley e, inicialmente, Galton (cuyo libro Natural inheritance, 1989, se considera fundador de la ciencia de la Biometría) creían que la evolución procedía de forma rápida y discontinua, por lo que la selección usaba primariamente variación discontinua, no teniendo ningún valor evolutivo la variación continua. Con el mendelismo este antagonismo se acentuó hasta convertirse en conflicto entre los mendelianos por un lado -que apoyaban la evolución discontinua- y los biométricos por el otro -que estudiaban la variación en los caracteres físicos cuantitativamente y creían en la evolución darwiniana-. Los primeros estaban capitaneados por Bateson, Morgan y Hugo de Vries mientras que Karl Pearson y W. F. R. Weldom (junto con Galton, que se les unió ideológicamente después) fueron los principales biométricos. En 1908 se formula la ley de Hardy-Weinberg que relaciona las frecuencias génicas con las genotípicas en poblaciones panmícticas. Entre 1918 y 1932 la larga polémica entre biométricos y mendelianos se zanja finalmente: Ronald Fisher, Sewal Wright y J. B. S. Haldane llevaron a cabo la síntesis del darwinismo, el mendelismo y la biometría y fundan la teoría de la Genética de poblaciones. Fisher demuestra en 1918 que la variación cuantitativa es una consecuencia natural de la herencia mendeliana. El desarrollo de modelos matemáticos de acción de la selección despejó las dudas en cuanto a si la selección podía o no producir cambios importantes incluso cuando sus coeficientes eran débiles: la selección volvió a adquirir un papel preponderante como agente evolutivo. En la Genética de poblaciones la teoría de la evolución se presenta como una teoría de fuerzas -la selección, la mutación, la deriva genética y la migración-. Estas fuerzas actúan sobre un acervo genético que tiende a permanecer invariable como consecuencia de la ley de Hardy-Weinberg que a su vez es una consecuencia de la extensión de la primera ley de Mendel a las poblaciones. La 4 FUNDACION BARCELO – FACULTAD DE MEDICINA BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR – Dr Eduardo Kremenchutzky – Profesor Titular Genética de poblaciones se estableció como el núcleo teórico, el componente explicativo, de la teoría de la evolución. La integración de la Genética de poblaciones con otros programas de investigación evolutiva -tales como la biología de poblaciones experimental, la sistemática, la paleontología, la zoología y la botánica- produjeron durante el periodo de 1937-1950 la teoría sintética o neodarwinista de la evolución. En ella se produce la mayor integración de disciplinas, nunca antes alcanzada, de una teoría evolutiva. Desde 1940 en adelante: el acceso al nivel molecular Tras la segunda guerra mundial se produce el verdadero asalto a la naturaleza física del material hereditario. La genética de procariotas inicia los nuevos horizontes de indagación. Se establece finalmente el ADN como la substancia genética. A ello le sigue el descubrimiento del dogma del flujo de la información genética: ADN -> ARN > proteínas. También se producen grandes avances en el conocimiento de la estructura y función de los cromosomas. Por último los setenta producen las técnicas de manipulación de ADN que afectarán revolucionariamente a todas las disciplinas de la genética. A continuación se exponen, muy brevemente, los principales hitos de este periodo. A partir de los 1940 se aplican las técnicas moleculares sistemáticamente y con extraordinario éxito en Genética. El acceso al nivel molecular ha empezado: la estructura y función de los genes es el próximo frente del avance genético. 1941: George Beadle y E. L. Tatum introducen la revolución de Neurospora estableciendo el concepto de un gen-una enzima: los genes son elementos portadores de información que codifican enzimas. 1944: Oswald Avery, Colin McLeod y Maclyn McCarty demuestran que el "principio transformador" es el ADN. 1953: Este año representa un momento culminante. James Watson y Francis Crick interpretan los datos de difracción de rayos X de Maurice Wilkins junto con datos de composición de bases de Erwin Chargaff concluyendo que la estructura del ADN es una doble hélice, formada por dos cadenas orientadas en direcciones opuestas (antiparalelas). La estructura 3-D se mantiene gracias a enlaces de hidrógeno entre bases nitrogenadas que se encuentran orientadas hacia el interior de las cadenas. Dicha estructura sugería, de un modo inmediato, como el material hereditario podía ser duplicado o replicado. Una estructura pasmosamente simple proveía la explicación al secreto de la herencia: la base material (ADN), la estructura (doble hélice 3-D) y la función básica (portador de información codificada que se expresa y se transmite íntegramente entre generaciones) del fenómeno genético era, por fin, inteligible. No debe sorprendernos que el descubrimiento de la doble hélice se considere el más revolucionario y fundamental de toda la biología. 1958: Matthew Meselson y Franklin Stahl demostraron que el ADN se replicaba semiconservativamente. El problema de cómo la secuencia del ARN se traduce en secuencia proteica se empieza a resolver. Un triplete de bases codifica un aminoácido. 5 FUNDACION BARCELO – FACULTAD DE MEDICINA BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR – Dr Eduardo Kremenchutzky – Profesor Titular Rápidamente se establece el flujo de la información genética (el dogma). Ese mismo año Arthur Kornberg aísla la polimerasa del ADN y un año después Severo Ochoa aísla la ARN polimerasa, con la que inicia la elucidación del código. 1961: Sidney Brenner, François Jacob y Meselson descubrieron el ARN mensajero. 1966: Marshall Nirenberg y Har Gobind Khorana terminan de desvelar el código genético. Simultáneamente a estos descubrimientos, Seymour Benzer publica en 1955 su primer trabajo sobre la estructura fina del locus rII en el fago T4. En 1961 Jacob y Jacques Monod proponen el modelo del operón como mecanismo de regulación de la expresión génica en procariotas. Charles Yanofsky y su equipo demuestran la colinearidad entre genes y sus productos proteicos en 1964. En 1966 R. Lewontin, J. L. Hubby y H. Harris aplican la técnica de la electroforesis en gel de proteínas al estudio de la variación alozímica de las poblaciones naturales, obteniéndose las primeras estimas de la variación genética de un sinnúmero de especies. La teoría neutralista de la variación molecular introducida por el japonés M. Kimura en 1968 suministra la primera explicación satisfactoria al exceso de variación hallada. Los 70 presencian el advenimiento de las técnicas de manipulación del ADN. En 1970 se aíslan las primeras endonucleasas de restricción y H. Temin y D. Baltimore descubren la transcriptasa inversa. En 1972 se construye en el laboratorio de Paul Berg el primer ADN recombinante in vitro. El año 1977 fue pródigo: se publican las técnicas de secuenciación del ADN de Walter Gilbert y de Frederick Sanger; Sanger y sus colegas publican, a su vez, la secuencia completa de 5387 nucleótidos del fago f X171; varios autores descubren que los genes eucariotas se encuentran interrumpidos (intrones). Los primeros ratones y moscas transgénicos se consiguen en 1981-82. Thomas Cech y Sidney Altman, en 1983, descubren la autocatálisis del ARN. Este mismo año M. Kreitman publica el primer estudio de variación intraespecífica en secuencias de ADN del locus Adh de Drosophila melanogaster y S. Arnold y R. Lande introducen el análisis correlacional a los estudios de selección fenotípica en la naturaleza. En 1986 Kary Mullis presentó la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa. En 1990 LapChee Tsui, Michael Collins y John Riordan encontraron el gen cuyas mutaciones alélicas son las responsables principales de la fibrosis quística. Ese mismo año Watson y muchos otros lanzan el proyecto del genoma humano para cartografiar completamente el genoma humano y, finalmente, determinar su secuencia de bases. No es hasta 1995 que se secuencia el primer genoma completo de un organismo celular, el de Haemophilus influenzae. En 1996 se obtiene en el laboratorio de I. Wilmut el primer mamífero clónico (la oveja Dolly) obtenido a partir de células mamarias diferenciadas. La era genómica El proyecto Genoma humano, con una presupuesto de 3 mil millones de dólares y la participación de un Consorcio Público Internacional, formado por EEUU, Reino Unido, Japón, Francia, Alemania, China y otros países, tenía como objetivo principal la 6 FUNDACION BARCELO – FACULTAD DE MEDICINA BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR – Dr Eduardo Kremenchutzky – Profesor Titular consecución de la secuencia completa del genoma humano, el texto lineal formado por la secuencia de las cuatros bases químicas del ADN que contiene las instrucciones para construir un ser humano. Iniciado en 1990, el proyecto se dio por concluido en el 2003, dos años antes de lo previsto. Otros objetivos del proyecto eran la secuenciación de genomas de otros organismos modelos sobre los que se tenía un amplio conocimiento previo, como la bacteria Escherichia coli, la levadura Saccaromyces cerevisiae, el gusano Caenorhabditis elegans, o la mosca del vinagre Drosophila melanogaster, y el considerar las implicaciones éticas, legales y sociales que suscitarían los resultados del proyecto. Ocho años después del inicio del proyecto público apareció en escena una empresa privada, Celera genomics, presidida por un brillante y revolucionario científico, Craig J. Venter, que lanzó el reto de conseguir la secuencia humana en un tiempo récord, antes del previsto por el Consorcio Público. Proponía una estrategia de secuenciación alternativa a la secuenciación jerárquica que seguía el Consorcio, la secuenciación aleatoria (shotgun), con la que había conseguido secuenciar el primer genoma celular en 1995, el de la bacteria Haemophilus influenzae. Empieza a partir de ese momento una carrera apasionante por la conquista del genoma humano, que acabaría finalmente en tablas. El 26 de Junio de 2000, en un acto auspiciado por el presidente Bill Clinton y que tuvo como escenario la Casa Blanca, se encontraron los dos máximos representantes de las partes en competición, Venter por Celera, y el director del Consorcio Público, Francis Collins. Se anunció de forma conjunta la consecución de dos borradores de la secuencia completa del genoma humano. Las publicaciones correspondientes de ambas secuencias no aparecieron hasta Febrero de 2001. El Consorcio Público publicó su secuencia en la revista Nature, mientras que Celera lo hizo en Science. Tres años después, en 2004, el Consorcio publicó la versión final o completa del genoma humano. El proyecto genoma humano había concluido con un éxito rotundo y, en palabras de F. Collins, se iniciaba una nueva era de investigación basada en la genómica que afectaría crucialmente a la biología, a la salud y a la sociedad. Con ello se inaugura una nueva era, que dada la coincidencia con el nuevo siglo, bien podríamos definir con el lema, el siglo XXI, el siglo del la Genética Dogma central de la biología molecular Es un conjunto de hipotesis que se consideran básicas para la biología celular actual. 1- los genes se componen de ADN y están situados dentro de los cromosomas. 2-Cada gen contiene información codificada en forma de una serie específica de nucleótidos de purina y pirimidina dentro de la molécula de ADN 3- la unidad de información genética es el CODÓN que es un grupo de tres nucleótidos adyacentes que especifican un Aa en una cadena de proteínas 4- el código genético es un código tripleto 5- la molécula de ADN consta de dos cadenas complementarias de polinucleótidos arrollados entre sí en una espiral y unidas por enlaces de hidrógeno entre pares específicos de bases de purina y pirimidina. 7 FUNDACION BARCELO – FACULTAD DE MEDICINA BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR – Dr Eduardo Kremenchutzky – Profesor Titular 6- la molécula de ADN se duplica cuando las dos tiras de la espiral se separan y cada una actúa como modelo para la formación de una nueva cadena complementaria. Cada par de tiras , uno antiguo y uno nuevo se arrollan formando dos espirales hijas. El dogma central plantea entonces que el ADN origina al ARN , proceso denominado TRANSCRIPCIÓN. La excepción al dogma central es la síntesis de ADN a partir de ARN , la cual se realiza en algunos virus , como el del sarcoma de Rous, por medio de una enzima denominada ADN POLIMERAZA ARN DEPENDIENTE o TRANSCRIPTASA INVERSA. Esto también se denomina "inversión del flujo de la información genética". CONCEPTOS BASICOS Todos los caracteres de un individuo se producen en forma directa o indirecta por la presencia de una o más proteínas. Controlando la fabricación o síntesis de proteínas , se tiene control entonces sobre las características de un individuo. El control de la síntesis de proteínas lo tiene el ADN , que también puede transmitir a la herencia esa información. La transmisión de célula a célula se efectúa en el momento de la división celular , de la siguiente manera: Durante el periodo G1 cada célula tiene una sola copia de la información genética , ya que tiene una sola copia del ADN. Durante el periodo S se produce la duplicación del ADN , en la cual se origina una molécula de ADN exactamente igual que la original , con la misma información para la síntesis de proteínas y por lo tanto la misma información genética. Durante el periodo G2 la célula tiene la información duplicada. Durante la mitosis , cada célula hija recibe una de las dos cadenas del ADN . De esta manera se efectúa la transmisión de la información genética a las células hijas . La información genética también se transmite a la descendencia. En el caso del ser humano debemos recordar que al comienzo de su gestación está formado por una sola célula , la célula huevo o cigota , formada por la unión del óvulo y el espermatozoide . Durante la fecundación se produce la unión del material genético de la madre , contenido en el óvulo , con el del padre , contenido en el espermatozoide. 8 FUNDACION BARCELO – FACULTAD DE MEDICINA BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR – Dr Eduardo Kremenchutzky – Profesor Titular La forma en que se originan el óvulo y el espermatozoide es algo distinta a la mitosis y se llama meiosis .Por lo tanto , la transmisión de la información genética a la descendencia se produce cuando se originan las células germinales , durante el proceso de meiosis. Estructura del gen Un gen es una secuencia de bases del ADN que tiene la información para la síntesis de una proteína o de una molécula de ARN Un gen tiene secuencias con código que se denominan exones y secuencias sin código denominadas intrones . Entre un gen y otro existe una secuencia llamada ADN espaciador ARN : Existen 3 tipos básicos de ARN : ARN mensajero : transporta una copia de la información genética desde el núcleo al citoplasma. ARN de transferencia : es el portador de los aminoácidos. ARN ribosómico : tiene la maquinaria necesaria para realizar el síntesis de las proteínas. proceso de Descripción de los principales tipos de ARN ARN mensajero : Se sintetiza en el núcleo a partir del ADN por un proceso llamado TRANSCRIPCIÓN. Su secuencia de bases es complementaria a la del ADN que lo origina. La información genética que se encuentra almacenada en el ADN es copiada por el ARN , que luego pasa al citoplasma y utiliza la información para la síntesis de las proteínas. Hemos dicho que la información genética es la información sobre la síntesis de proteínas. La información que indica cual es cada uno de los Aa de cada proteína es un triplete de nucleótidos llamado codón. Cada codón equivale en el código genético a un aminoácido. 9 FUNDACION BARCELO – FACULTAD DE MEDICINA BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR – Dr Eduardo Kremenchutzky – Profesor Titular El ARNm se une al de transferencia por la interacción del codón con el anticodón , que es una secuencia de tres nucleótidos del ARN t. También se une con el ARN r. Es el molde para la síntesis de proteínas. El ARNm se origina a partir del pre ARNm o ARNm inmaduro , el cual es producido por la transcripción del ADN . Tiene la copia de los intrones y los exones. Después de originado se transforma en el ARNm maduro o definitivo por un mecanismo llamado PROCESAMIENTO CISTRON: El total de codones que tienen la información para la síntesis de una proteína completa , se llama cistron. Es el equivalente del gen del ADN . El termino gen se utiliza cuando se trata de ADN , el termino cistrón , cuando se trata de ARNm Una molécula de ARN puede tener un sólo cistrón (monocistrónico) o varios cistrones (policistrónico) , pudiendo por lo tanto controlar la síntesis de varias proteínas. Estructura del ARNm Tiene el extremo 5' cubierto por un capuchón o cap, que es una estructura de 7metilguanosina , y una cola de 100 a 200 nucleótidos de adenina en el extremo 3' , que le confiere estabilidad. ARN de transferencia : Son moléculas de ARN pequeñas que portan un Aa y lo llevan hasta el ribosoma , para que se una con otros en la síntesis de proteínas. El Aa que se encuentra unido al ARNt no puede ser cualquiera , sino que depende de una secuencia de tres bases , llamada anticodón. De acuerdo al anticodón que tenga el ARNt , será el Aa que lleve unido. Es fundamental que la unión del Aa se efectúe con el ARNt que le corresponde y no con otro Dicha unión la efectúa una enzima llamada enzima activante o aminoacil - transfer - sintetasa 10 FUNDACION BARCELO – FACULTAD DE MEDICINA BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR – Dr Eduardo Kremenchutzky – Profesor Titular CARACTERÍSTICAS COMUNES A TODOS LOS ARNt 1- Estructura bidimensional en forma de hoja de trébol , llamado modelo de Holley 2- Secuencia de bases fija CCA en el extremo 3' que es el que se une al aminoácido , llamado extremo aceptor. 3- Tiene una mayor proporción de bases modificadas como por ejemplo seudouridina ácido inosilico metilcitosina metilguanina ribotimida 4- Anticodón :tiene las 3 bases que se aparean por puentes de hidrógeno al codón del ARNm 5- Asa "D" 6- ASA "T" 7- ASA Tridimensionalmente tendría forma de L , ya que las asas "D" y "T" se encuentran plegadas y unidas por puentes de hidrógeno. Cada molécula de ARNt se origina como todo ARN a partir del ADN , por el proceso de transcripción . Al igual que los otros tipos de ARN , el de transferencia también se origina en forma de un precursor , un ARNt más grande , llamado ARN preT, que luego se transforma en ARNt por un mecanismo llamado procesamiento. ARN Ribosómico : es el que constituye el ribosoma 11 FUNDACION BARCELO – FACULTAD DE MEDICINA BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR – Dr Eduardo Kremenchutzky – Profesor Titular DUPLICACIÓN DEL ADN : Proceso por el cual se forman dos moléculas de ADN a partir de una primitiva. Presenta las siguientes características : 1- ES SEMICONSERVADORA : Hipótesis de la duplicación del ADN * Hipótesis semiconservativa: formulada por Watson y Crick. En una doble hélice cada hebra servirá de molde y, mediante la complementariedad de bases, se formará una hebra copia de cada hebra molde, quedando al final dos dobles hélices formadas por una hebra antigua (molde) y una hebra nueva (copia). En 1957, experimentos realizados por Meselson y Stahl confirmaron esta hipótesis. * Hipótesis conservativa: tras la duplicación quedan dos hebras antiguas y dos hebras nuevas formando una doble hélice. No es correcta . * Hipótesis dispersa: se propone que las hebras están formadas por fragmentos distintos de ADN antiguo y ADN recién sintetizado. . No es correcta 2- ES SECUENCIAL : Significa que todo el ADN se duplica una sola vez y en una secuencia determinada y , una vez que se duplico , se bloquea la duplicación por un mecanismo desconocido hasta ahora. 3- ES ASINCRÓNICA : No todo el ADN se duplica al mismo tiempo. La asincronía puede ser a- intercromosómica : el ADN de cada uno de los cromosomas no se duplica al mismo tiempo que el de los otros. b- intracromosómica : el ADN del propio cromosoma no se duplica todo al mismo tiempo. Por ejemplo , las regiones heterocromáticas lo hacen más tardíamente. 4- ES BIDIRECCIONAL : Significa que , a partir de un punto la duplicación avanza hacia los dos sentidos simultáneamente. En el ADN mitocondrial y bacteriano es unidireccional. 12 FUNDACION BARCELO – FACULTAD DE MEDICINA BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR – Dr Eduardo Kremenchutzky – Profesor Titular 5- ES MULTIFOCAL : comienza en varios puntos de la molécula al mismo tiempo . En el ADN bacteriano comienza en un solo punto . MECANISMO MOLECULAR DE LA DUPLICACIÓN : 1- desenrollamiento de la doble hélice en un sitio determinado de la molécula 2- separación de las dos cadenas 3- colocación en fase de los nucleótidos complementarios. 4- unión de los nucleótidos por acción de la enzima ADN polimerasa 5'--3' 5- enlace por puentes de H Sistemas enzimáticos que intervienen en la duplicación del ADN: a-ADN POLIMERASAS : Existen 3 tipos llamadas poli I , poli II y poli III. En las células procariontes En general catalizan la síntesis de enlaces internucleotídicos en la nueva cadena de ADN. Siempre actúan en sentido 5'--3' , por lo que una cadena del ADN se copia en forma continua y otra en forma discontinua. Debe existir para que esta enzima actúe , ADN preformado con función de patrón o molde (TEMPLATE), que es el ADN original que se va a duplicar y ÁCIDO NUCLÉICO cebador (PRIMER) , ya que la enzima puede sintetizar ADN sólo cuando ya hay una primera parte formada previamente. ADN POLIMERASA I : Es una EXONUCLEASA que reconoce y elimina por hidrolisis las bases mal apareadas , con respecto a la cadena progenitora. Esto lo hace antes de la duplicación (lectura de prueba) , durante la duplicación , y también luego de la duplicación para corregir errores introducidos por mutación. Es la enzima reparadora del ADN. 13 FUNDACION BARCELO – FACULTAD DE MEDICINA BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR – Dr Eduardo Kremenchutzky – Profesor Titular ADN POLIMERASA II : es una enzima que interviene en la reparación del ADN ADN POLIMERASA III : Es la verdadera enzima duplicadora del ADN El estudio in vitro de la duplicación del ADN fue posible gracias al aislamiento de la enzima ADN-polimerasa por Kornberg. Esta enzima es incapaz de iniciar una cadena de novo; requiere la presencia de un extremo libre del carbono 3' de un nucleótido, para poder ir añadiendo los nucleótidos nuevos. Este extremo 3' libre lo aporta el cebador o «primer», que es una porción pequeña de nucleótidos complementaria al extremo de la cadena patrón. Por tanto, la cadena naciente siempre crecerá en el sentido 5'®3'. El primer nucleótido de la cadena nueva tiene un extremo 5' libre; se irán añadiendo nucleótidos a los extremos 3' libre y se irán formando los enlaces fosfodiester 3'®5', de forma que el último nucleótido tendrá libre el carbono 3'. Los nucleótidos se añadirán siguiendo las reglas de la complementariedad de bases, de manera que la nueva hebra sintetizada será antiparalela y complementaria a la patrón. b- ADN LIGASA: Repara roturas del ADN c- ARN POLIMERASA ADN DEPENDIENTE : Actúa en la iniciación de la duplicación . Su función es transcribir un pequeño segmento de ADN formando ARN , que actúa luego como cebador para la posterior formación de ADN MECANISMO MOLECULAR DE LA DUPLICACIÓN : La secuencia de nucleótidos en el origen de replicación del ADN actúa como señal de iniciación. La duplicación comienza en 30.000 puntos del ADN casi simultáneamente. Cuando la célula debe duplicar el ADN en poco tiempo , comienza en los 30.000 puntos al mismo tiempo , pero cuando debe hacerlo más lentamente , cuando tiene más tiempo , comienza en menos puntos , lo cual está regulado genéticamente. Por lo tanto la velocidad de la replicación depende de la cantidad de puntos de replicación que se inician simultáneamente. 2. La enzima helicasa separa las dos hebras de la doble hélice para que sirvan de molde. El desenrollamiento de la hélice da lugar al super enrollamiento en los extremos de la horquilla de replicación, actuando entonces las enzimas topoisomerasas que liberan esta tensión. La topoisomerasa I corta una hebra y 1. 14 FUNDACION BARCELO – FACULTAD DE MEDICINA BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR – Dr Eduardo Kremenchutzky – Profesor Titular 3. 4. 5. 6. 7. 8. la topoisomerasa II (denominada girasa en E. coli) las dos. Una vez liberada la tensión vuelven a sellar la doble hélice. Mientras se separan las dos hebras se van uniendo las proteínas estabilizadoras (SSB), de forma que se mantengan separadas ambas hebras y se estabilice la horquilla de replicación. El proceso de duplicación es bidireccional; hay dos horquillas de replicación por cada burbuja de replicación. La primasa (una ARN-polimerasa) sintetiza los fragmentos de ARN que sirven de cebador (primer) para la ADN-polimerasa. La ADN polimerasa puede sintetizar ADN sólo cuando ya ha comenzado la síntesis . Puede continuar , pero no puede comenzar a fabricar ADN , por lo cual es necesario que exista un fragmento en el cual la ADN polimerasa pueda "engancharse" y continuar o alargar dicho fragmento. Como no hay ninguna enzima que pueda comenzar a formar ADN , la única solución es que se comience formando ARN que sirva como principio . La ARN polimerasa ADN dependiente es la que sintetiza pequeños trozos de ARN de 50 a 100 nucleótidos , con función de cebador. Obsérvese la aparente paradoja de que para duplicar el ADN se comienza formando ARN. La ADN-polimerasa III incorpora en dirección 5'®3' los nucleótidos, formando una nueva hebra de crecimiento continuo denominada hebra conductora. Sobre la otra hebra antiparalela, primero, a unos mil nucleótidos del origen de replicación, se sintetizarán unos cincuenta nucleótidos de ARN cebador que servirán para que la ADN-polimerasa III incorpore los desoxinucleótidos, formándose los fragmentos de Okazaki a medida que se va abriendo la horquilla. Una vez formados, la ADN-polimerasa I, gracias a su función exonucleasa, irá eliminando los tramos de ARN y los irá rellenando con ADN, sintetizados gracias a su actividad polimerasa. Finalmente interviene la ADN-ligasa, que empalma entre sí los distintos fragmentos de la hebra de crecimiento discontinuo, denominada hebra retardada. Todo esto ocurre a una velocidad de 50 nucleótidos por segundo en los eucariontes. 15 FUNDACION BARCELO – FACULTAD DE MEDICINA BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR – Dr Eduardo Kremenchutzky – Profesor Titular TRANSCRIPCIÓN Y PROCESAMIENTO DEL ARN Es la formación de ARN a partir de ADN. No se forma directamente el ARN definitivo , sino que se forma un precursor llamado TRANSCRITO PRIMARIO ,que luego se transforma en el producto final o ARN maduro por un mecanismo llamado PROCESAMIENTO DEL ARN. LUGAR DE LA TRANSCRIPCIÓN : 1- TRANSCRIPCIÓN DEL ARN m: Se origina en genes llamados estructurales que se encuentran fuera del ADN organizador nucleolar. 2- TRANSCRIPCIÓN DEL ARNt: Se origina en genes llamados determinantes que están fuera del organizador nucleolar. Tiene 4s. 3- TRANSCRIPCIÓN DEL ARNr: a- ARN 28 , 18s y 5,8s : Se originan a partir de ARN 45 s , el cual se origina en genes determinantes que están dentro del organizador nucleolar (ADN ribosómico). b- ARN 5s : Se origina en genes determinantes fuera del nucléolo. MECANISMO MOLECULAR DE LA TRANSCRIPCIÓN : Actúa la ARN POLIMERASA ADN DEPENDIENTE . En eucariotas existen tres tipos de ARN-polimerasa, según el ARN que se va a sintetizar: ARNm, ARNt y ARNr. 16 FUNDACION BARCELO – FACULTAD DE MEDICINA BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR – Dr Eduardo Kremenchutzky – Profesor Titular MECANISMOS DE PROCESAMIENTO DEL ARN : El transcrito primario puede modificarse por alguno de los siguientes procesos : 1- clivaje o corte : es la división de una molécula grande para formar varios segmentos de ARN más chicos . 2- empalme: se sacan partes internas de la molécula que luego vuelve a empalmarse. 3- alargamiento : se agregan segmentos al final del trascrito primario que es más corto que el producto final. 4- modificación : cambios químicos en los nucleótidos. Procesamiento del ARNm a partir del precursor llamado Arman 17 Adición de una caperuza o protección por el extremo 5' del ARN-han que entre otras cosas lo protege de su degradación por dicho extremo. Esta caperuza ("capping" o abreviadamente tapón o "cap") consiste en la adición de un residuo de 7-metilguanosina mediante el establecimiento de un enlace trifosfato. Otra posible función de la caperuza del extremo 5'P es la suministrar una estructura que sea reconocible por el ribosoma para iniciar la traducción. Adición por el extremo 3' de una cola de Poli-A, esta cola de poli-A consiste en la adición de 150 a 200 residuos de adenina por el extremo 3'. En primer lugar una endonucleasa corta el ARN y después una Poli A polimerasa añade la cola de Poli A. La longitud de la cola de Poli A varia en eucariontes, es de 150 a 200 nucleótidos en células de mamíferos, y de 50 a 60 residuos en levaduras. La función de la cola de Poli A se cree que puede servir para evitar la degradación del ARN por ese extremo e intervenir en el transporte del ARN hacia el citoplasma. Eliminación de segmentos interiores del ARN-han. Los genes en eucariontes están fragmentados, de manera, que poseen regiones que se traducen a aminoácidos en la secuencia del polipéptido y que se denominan Exones y, regiones que no se traducen a aminoácidos en el polipéptido y que se denominan Intrones. Cuando la región de ADN correspondiente a un gen se transcribe, el ARN-han recién transcrito contiene los Exones y los Intrones, y durante el procesamiento posterior se van a eliminar los Intrones o regiones que no se traducen a aminoácidos en el polipéptido. Esta eliminación de los Intrones que tiene lugar durante el procesamiento no suele afectar al orden relativo de los que tenían los Exones en el ADN. FUNDACION BARCELO – FACULTAD DE MEDICINA BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR – Dr Eduardo Kremenchutzky – Profesor Titular TRADUCCIÓN DEL ARN : El ARN originado utilizando como molde al ADN , lleva entonces una copia de la información genética para la síntesis de proteínas. Una vez originado , pasa al citoplasma y se asocia con los ribosomas , para la síntesis de proteínas, que es la expresión del código genético. Consta de 3 pasos : 1-iniciacion 2-elongación 3-terminacion 1- INICIACION : En la iniciación de la cadena polipeptídica intervienen el primer ARN-t, o ARN-t iniciador de la traducción que habitualmente es el ARN-t-Formilmetionina, las subunidades ribosomales, el ARN-m, enzimas, los factores de iniciación IF1, IF2 e IF3 y una fuente de energía como GTP. Las subunidades ribosomales están separadas cuando no están ocupadas en la síntesis de polipéptidos. Para poder iniciar la traducción es necesario que ambas subunidades se ensamblen. Se pueden distinguir tres fases en el proceso de iniciación: Fase 1: Unión del mensajero (ARN-m) a la subunidad pequeña 30S de los ribosomas estimulada por la acción del factor IF3. Fase 2: El ARN-t-iniciador (ARN-t-Formilmetionina) se une al factor IF2 y a GTP y se situa en la Sede P. Fase 3: Unión de las dos subunidades ribosomales 30S y 50S mediante la hidrólisis del GTP unido a IF2 catalizada por una proteína ribosomal. Una vez unidas ambas subunidades se sueltan o disocian los factores IF2 e IF3. La función de IF1 no se conoce con exactitud aunque se cree que interviene en el proceso del reciclado de los ribosomas. El lugar del mensajero (ARN-m) al que se debe unir el ribosoma para comenzar la traducción, o la selección de los codones de iniciación correctos del ARN-m en bacterias, parece llevarse a cabo gracias a la existencia de unas secuencias cortas que preceden a los codones de iniciación y que son complementarias de secuencias del extremo 3' del ARN-r 16S de la subunidad pequeña (30S) de los ribosomas. Dichas secuencias fueron detectadas por Shine y Dalgarno (1974) y se las ha denominado secuencias Shine-Dalgarno. En eucariontes no se han detectado estas secuencias en el 18 FUNDACION BARCELO – FACULTAD DE MEDICINA BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR – Dr Eduardo Kremenchutzky – Profesor Titular ARN-r 18S y la traducción comienza siempre por el triplete AUG más cercano al extremo 5' del ARN-m. Se ha propuesto que el ribosoma se une al ARN-m por su extremo 5' con el capuchón o cap y se movería hacia el extremo 3' hasta encontrar el primer AUG. La señal de iniciación entonces es el codón AUG que , cuando está al comienzo de una cadena codifica la incorporación de formilmetionina . El ribosoma tiene la capacidad de reconocer cuando el codón AUG está al comienzo de un mensaje. En las células procariontes el primer complejo Aa-ARNt , por lo tanto , es la formil metionina , y entonces el primer aminoácido de toda cadena proteica recién formada es la formil metionina que luego es eliminada , ya que las proteínas no comienzan todas por ese aminoácido.. Cuando el codón AUG está , no en el comienzo , sino dentro de la secuencia de bases , el ribosoma lo reconoce de otra manera y el aminoácido que se incorpora es la metionina . En las eucariontes es la metionina y no la formil-metionina el primer aminoácido. FACTORES QUE INTERVIENEN EN LA INICIACION: SON UNA SERIE DE PROTEÍNAS llamadas IF QUE ACTÚAN EN LA INICIACION DE LA TRADUCCIÓN. 2- ELONGACIÓN : Es el agregado a la cadena de los Aa que corresponden a cada codón. Una vez formado el complejo de iniciación se puede comenzar la elongación del polipéptido. La elongación o crecimiento de la cadena polipeptídica tiene lugar en esencia mediante la formación de enlaces péptídicos entre los aminoácidos sucesivos. Intervienen en este proceso, el peptidil-ARN-t, los aminoacil-ARN-t, ribosomas, ARNm, enzimas, factores proteicos de elongación EF-Tu, EF-Ts y EF-G y fuentes de energía como GTP. Se pueden distinguir cuatro fases esenciales en el proceso de elongación: 19 Fase 1: El aminoacil-ARN-t correspondiente al siguiente triplete del ARN-m entra en el sitio A del ribosoma gracias a la intervención del factor EF-Tu. Fase 2: La transferencia de la cadena peptídica del peptidil-ARN-t que está en la Sede P al aminoacil-ARN-t nuevo que ha entrado en la sede A. Esta reacción está catalizada por un enzima que es la peptidil-transferassa. FASE 3 :Después el ribosoma avanza un codón sobre el ARN-m en la dirección 5'→3' (se transloca). FUNDACION BARCELO – FACULTAD DE MEDICINA BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR – Dr Eduardo Kremenchutzky – Profesor Titular FASE 4 : se libera el ARN-t descargado que estaba en la sede P y al moverse el ribosoma el péptidil-ARN- t recién formado que estaba en la sede A pasa a ocupar la sede P. Estas 4 fases del proceso de elongación se repiten tantas veces como aminoácidos posea el polipétido sintetizado FACTORES DE LA ELONGACIÓN: Son una serie de proteínas llamadas EF 3- TERMINACION : La terminación de la cadena polipeptídica en bacterias tiene lugar cuando los ribosomas en su avance a lo largo del ARN-m se encuentran con cualquiera de los siguientes tripletes de terminación o codones de fin: UAA, UAG y UGA. Además, durante la terminación intervienen los factores proteicos de terminación RF1, RF2 y RF3. No hay ningún ARN-t que reconozca a los tripletes de terminación, son los factores de terminación o liberación los que se encargan de reconocer los codones de STOP. El factor RF1 reconooce los codone UAA y UAG y el factor RF2 identifica a los codones UAA y UGA. El factor RF3 también colabora en la reacción de terminación. Cuando el peptidil-ARN-t está en la sede P los factores de terminación en respuesta a la existencia de un codón de terminación en el ARN-m entran en la sede A. Como consecuencia el polipéptido se libera de la sede P, se disocian las dos subunidades del ribosoma y se libera el ARN-t que estaba en la sede P. Esta reacción de terminación se lleva a cabo mediante la hidrólisis de GTP. FACTORES DE LA TERMINACION : Son proteínas llamadas RF 20