Aplicación de un diseño central compuesto para la determinación

Resumen: E-051
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2006
Aplicación de un diseño central compuesto para la determinación de especies
orgánicas e inorgánicas de arsénico en agua por HPLC-HG-AAS.
Blanes, Patricia S. - Garro, Oscar A. - Giménez, María C. - Hunzicker, Gabriel A.
Cátedra de Química Analítica I. - Cátedra de Microbiología en Alimentos
Facultad de Agroindustrias .U.N.N.E.- Cdte. Fernández 755. (3700). P. R. Sáenz Peña, Chaco. Argentina.
Tel-fax: 03732-420137. E-mail: cgimenez@fai.unne.edu.ar
Antecedentes
La concentración total de arsénico disuelto en agua depende de la composición geológica y geoquímica de las áreas
naturales de drenaje. Las especies más abundantes en aguas de río y aguas subterráneas son las especies inorgánicas
As(III) y As(V). A través de la actividad biológica, el arsénico inorgánico puede ser parcialmente detoxificado y
transformado en compuestos orgánicos metilados como por ejemplo, monometilarsénico (MMAs) y dimetilarsénico
(DMAs) entre otros. En aguas de río las concentraciones de estas dos especies metiladas se encuentran en niveles de
ultra-traza y en algunos casos pueden no ser detectadas.
Las bajas concentraciones de las diferentes especies de arsénico en el medioambiente requieren de técnicas de elevada
sensibilidad. La mayoría de las metodologías descriptas en la literatura para la especiación de este metaloide emplean la
técnica acoplada en línea HPLC-HG-AAS, en la cual, el arsénico en sus distintas formas, en medio ácido (HCl) es
reducido cuantitativamente a As(III) por acción de KI, que al reaccionar con solución de NaBH4 se convierte
instantáneamente a arsina AsH3, la cual es arrastrada por un flujo continuo de argón hasta la celda de absorción de
cuarzo, donde se convierte en átomos al estado gaseoso (Gettar et al., 2000; Martin et al. 1995). La señal generada se
almacena en un registrador de tipo continuo y mediante un programa computacional se integran los picos
cromatográficos para conocer la respuesta de las especies de arsénico estudiadas.
Dado el gran número de variables que intervienen en los métodos continuos de análisis, uno de los pasos a seguir debe
ser la optimización de aquellas que influyen en la señal analítica, tarea que resulta larga y tediosa cuando se examina
cada variable en forma independiente.
Por lo antes expuesto, el objetivo de este trabajo fue optimizar, aplicando un diseño central compuesto (DCC) 24+* con 7
réplicas del punto central, la cuantificación de As III, As V, DMAs y MMAs en muestras de agua, mediante la técnica
acoplada en línea HPLC-HG-AAS. Esta técnica estadística permite establecer la influencia de los factores más
relevantes como así también las posibles interacciones que influyen en la señal, usando un reducido número de ensayos.
(Bergoña et al., 1999; Hashemi et al., 2005).
Materiales y Métodos
Reactivos y patrones
En todos los casos se emplearon reactivos grado reactivo-analítico y agua bidestilada para la preparación de patrones,
estándares y reactivos. Las soluciones de trabajo se prepararon por dilución apropiada de soluciones stock de 1000
mg.L-1 de As III (Tritrisol®, Merck, Darmastadt, Germany); las soluciones de As V, MMAs y DMAs se prepararon por
dilución de (Na2HAsO4.7H2O, SIGMA), (CH3AsO3Na2.6H2O, CHEM SERVICE, West Chester PA. USA), y
(CH3)2AsO(OH), FLUKA). Ácido clorhídrico (HCl). Buffer Fosfato (Na2HPO4 – NaH2PO4) 17 mmol.l-1 pH 7. Solución
de Tetraborohidruro de sodio (NaBH4) (estabilizado en NaOH al 0.5%(p/v)). Solución de Yoduro de potasio (KI).
Equipamiento
El sistema utilizado en este trabajo se esquematiza en la Fig. 1 y consiste en un cromatógrafo líquido de alta
performence (GILSON), equipado con bomba (Modelo 307), sistema de-gassing (Modelo DG-4400) y válvula de
inyección (RHEODYNE 7125) con loop de 100 :l (WILSON) conectada a la columna analítica (PHENOMENEX). La
bomba peristáltica de cuatro vías (GILSON Minipuls 3) bombea los reactivos hacia el coil de reacción donde una
corriente del gas inerte (Argón) impulsa el hidruro generado (previo paso por el separador gas-líquido) hacia la celda de
cuarzo en forma de “T” (VARIAN) que se halla en el espectrofotómetro de absorción atómica (METROLAB 4200 con
corrector de fondo y lámpara de cátodo hueco PHOTRON). La señal del espectrofotómetro se registra con un
convertidor analógico-digital, empleando para el análisis el software cromatográfico RIAC-PROCESAR V 2.0.
Fig. 1: esquema del sistema HPLC-HG-AAS
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La Tabla 1 resume las condiciones operativas empleadas.
Tabla 1: Condiciones operativas para HPLC-HG-AAS
Cromatografía líquida de alta performance
Columna
Fase móvil
Volumen de inyección
Generación de hidruro
Pre-reductor
Reductor
HCl
Gas carrier
Espectrofotometría de absorción atómica
Longitud de onda
Ancho de banda
Tº de celda
10 µm Nucleosil SB 100 A (250 x 4,6 mm)
Buffer fosfato Na2HPO4-NaH2PO4 17 mmol.l-1 pH 7
100 µl
KI 15 ml.min-1 flow rate
NaBH4 1,5 ml.min-1 flow rate
1,5 ml.min-1 flow rate
Argón 100 ml.min-1 flow rate
193,7 nm
1,5 nm
900 ºC
Diseño Experimental
De acuerdo a trabajos previos (Gettar et al., 2000; Martín et al., 1995) y nuestras posibilidades de variar diversos
parámetros se optó por analizar la influencia de cuatro factores con el fin de encontrar las mejores condiciones para
cuantificar las cuatro especies de arsénico en estudio. Se utilizó un diseño central de superficie de respuesta rotable, que
responde al arreglo de composición central 24 + 4 x 2 + 7 con repetición del punto central, para estimar la influencia
sobre la señal de cada especie de arsénico (Montgomery D. y Runger G., 2000). Las variables se seleccionaron en
función de trabajos previos (Morand et al., 2003), las mismas se analizaron en dos niveles: velocidad de flujo del buffer
Na2HPO4-NaH2PO4 (0,8 – 1,4 ml.min-1), concentración de HCl (1,2 – 3,0 mol.l-1); IK (0,9 – 2,5 % p/v) y NaBH4 (0,8 –
2,0 % p/v). La Tabla 2 muestra los valores codificados de los niveles de los factores seleccionados y sus respectivos
valores experimentales (-α, -1, 0, 1, α), donde α =2.00.
El modelo seleccionado, responde a la siguiente
Tabla 2: Valores experimentales para los
parámetros de trabajo seleccionados
Códigos
A
B
C
D
Parámetros
Flujo de buffer (ml.min-1)
HCl concentración (mol.l-1)
KI concentration (% p/v)
NaBH4 concentration (% p/v)
-2
0,5
0,3
0,1
0,2
ecuación:
-1
0,8
1,2
0,9
0,8
0
1,1
2,1
1,7
1,4
1
1,4
3,0
2,5
2,0
2
1,7
3,9
3,3
2,6
donde E(Y) es el valor de la respuesta esperada, β0, βi,
βij parámetros del modelo, Xi y Xj son los códigos de
los factores estudiados y k es el nº de factores
analizados.
Discusión de Resultados
Integrados los cromatogramas, se usó el programa computacional Statgraphics Plus 5.0 para determinar los coeficientes
de regresión del modelo de segundo orden. La significancia y ajuste del modelo se realizó mediante análisis de la
varianza. Los resultados obtenidos para cada especie fueron diferentes y como el objetivo del trabajo fue encontrar las
mejores condiciones para cuantificarlas a la vez; se utilizó un artilugio matemático de manera de relacionar todas las
especies, el cual fue sumar la relación área x altura de cada una ya que de esta manera se compensan las diferencias de
señal que hay entre una especie y otra.
El análisis de la varianza expresa la variabilidad en la respuesta para cada uno de los efectos por comparación del
cuadrado de la media y el error experimental estimado. Los resultados del ANOVA, mostraron que existen nueve
efectos con p-valor menores a 0,05 lo cual indica que dichas variables y sus interacciones tienen una significativa
influencia sobre la respuesta (95%). El valor de la prueba de falta de ajuste fue mayor a 0,05 confirmando que el ajuste
del modelo es adecuado, para un nivel de confianza del 95%. El cálculo del estadístico Durbin Watson fue superior a
1,40, con lo cual se pudo probar, que no existe autocorrelación o correlación serial significativa. Los resultados del test
ANOVA para la relación área x altura pueden observarse en la Tabla 3. El diagrama de Pareto (Fig. 2) muestra cada
uno de los efectos estimados en orden decreciente de magnitud. Los efectos individuales más significativos fueron HCl
(B) y velocidad de flujo del buffer (A), mientras que las interacciones más importantes fueron las afectadas por la
concentración del reductor AD (velocidad de flujo de buffer y concentración de NaBH4), BD (concentración de HCl y
concentración de NaBH4) y CD (concentración de KI y concentración de NaBH4) como se observa en la Fig. 3.
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Tabla 3: Tabla ANOVA para la relación área x altura
Fig. 2: Diagrama de Pareto para la relación
áreaxaltura
Fig. 3: Interacciones de efectos más significativos
Las condiciones óptimas para lograr la máxima respuesta, derivadas de la relación entre los efectos de las cuatro
especies de As fueron las siguientes: flujo del buffer 1,2 ml.min-1, HCl 3 mol.l-1, KI 1,7 % (p/v), NaBH4 1,4 % (p/v)
(Tabla 4). Dichas condiciones se representan mediante una superficie de respuesta generada por el DCC (Fig. 4), que
permite visualizar las regiones óptimas y determinar la influencia de los factores sobre la relación área x altura.
Tabla 4: Optimización de la respuesta en función de los niveles
máximos y mínimos de los factores experimentales
Fig. 4: Superficie de respuesta estimada
para la relación área x altura
Una vez halladas las óptimas condiciones para la separación de las cuatro especies de arsénico consideradas, se validó
la metodología analítica, y para minimizar los efectos de matriz la curva de calibración se realizó mediante un proceso
de adiciones estándares, añadiendo cantidades conocidas de patrones de As III, As V, DMAs y MMAs sobre muestras
reales. La curva de adiciones estándares se construyó en siete niveles de concentración para cada especie: 0,01 - 0,025 0,05 - 0,1 - 0,25 - 0,5 y 1 mg.l-1. Cada punto se procesó por triplicado.
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Los resultados obtenidos se evaluaron mediante la aplicación de regresión lineal simple, la cual mostró que existe una
relación lineal entre la respuesta analítica y la concentración de las especies dentro del rango estudiado para un nivel de
confianza del 95%.(Tabla 5). En todas las lecturas los coeficientes de variación fueron menores al 5%.
Para evaluar la exactitud del método, se realizaron ensayos de recuperación adicionando un patrón de 0,5 mg.l-1 cada
especie a muestras de aguas termal, potable, y subterránea de baja y alta concentración salina. En todos los casos los
valores obtenidos se encuentran dentro del rango de 90 a 110 % como se establece en APHA, AWWA, WFF, (1992).
Tabla 5: Parámetros de validación para determinación de As III, DMAs, MMAs y As V en agua
As III
DMAs
MMAs
Coef. de Correlación (r)
Coeficiente de Determinación (R2)
Intersección
Pendiente (mg.l-1)
Error típico
Límite de detección (mg.l-1)a
Límite de cuantificación (mg.l-1)b
Rango Lineal(mg.l-1)
a
0,995
0,991
0,008
0,24
0,007
0,01
0,05
0,025- 1,0
0,998
0,997
0,003
0,21
0,004
0,02
0,06
0,05 - 1
0,998
0,997
0,001
0,11
0,002
0,05
0,11
0,5 - 1
As V
0,991
0,998
0,001
0,19
0,003
0,02
0,05
0,05-0,1
Definido como 3σ/pendiente (n = 10). bDefinido como 10σ/ pendiente (n = 10).
Conclusiones
De los resultados obtenidos en este estudio preliminar cuyo objetivo fue optimizar, aplicando un Diseño Central
Compuesto 24+* con 7 réplicas del punto central, la cuantificación de As III, As V, DMA y MMA en agua, mediante la
técnica acoplada en línea HPLC-HG-AAS, se puede concluir que:
Debido a que cada especie por separado exhibió diferentes condiciones experimentales para dar la máxima respuesta, se
relacionaron las respuestas de las cuatro especies, que derivaron en las siguientes condiciones óptimas: velocidad de
flujo del buffer 1,2 ml.min-1, HCl 3 mol.l-1, KI 1,7 % (p/v), NaBH4 1,4 % (p/v).
El valor de la prueba de falta de ajuste confirmó con un 95% de confianza que el ajuste del modelo es adecuado. El
cálculo del estadístico Durbin Watson fue superior a 1,40, confirmando con un 95% de confianza que no existe
correlación serial significativa. Los resultados derivados de la validación, mostraron que la metodología propuesta
resultó ser lineal, precisa y exacta dentro del rango en estudio para cada especie, lo que permitiría cuantificar
simultáneamente As III, DMAS, MMAs y As V, en muestras de aguas.
Cabe destacar que esta metodología está en continuo estudio a fin de realizar un análisis más detallado y mejorar los
resultados obtenidos.
Agradecimientos
Los autores agradecen el financiamiento brindado por la A.P.C.yT. (PICT: 13-05328) y la S.G.C.yT. UNNE.
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