Estudio de la biodiversidad fúngica en el suelo del viñedo de la

PROYECTO FIN DE CARRERA
Título
Estudio de la biodiversidad fúngica en el suelo del viñedo
de la Finca La Grajera
Autor/es
Alejandro Burgos Ramírez
Director/es
María del Mar Hernández Álamos y Cristina Menéndez Menéndez
Facultad
Facultad de Ciencias, Estudios Agroalimentarios e Informática
Titulación
Proyecto Fin de Carrera
Departamento
Agricultura y Alimentación
Curso Académico
2013-2014
Estudio de la biodiversidad fúngica en el suelo del viñedo de la Finca La
Grajera, proyecto fin de carrera
de Alejandro Burgos Ramírez, dirigido por María del Mar Hernández Álamos y Cristina
Menéndez Menéndez (publicado por la Universidad de La Rioja), se difunde bajo una
Licencia
Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 3.0 Unported.
Permisos que vayan más allá de lo cubierto por esta licencia pueden solicitarse a los
titulares del copyright.
©
©
El autor
Universidad de La Rioja, Servicio de Publicaciones, 2014
publicaciones.unirioja.es
E-mail: publicaciones@unirioja.es
Facultad
Facultad de Ciencias, Estudios Agroalimentarios e Informática
Titulación
Ingeniería Técnica Agrícola - Hortofruticultura y jardinería
Título
Estudio de la biodiversidad fúngica en el suelo del viñedo de la
Finca La Grajera
Autor/es
Alejandro Burgos Ramírez
Director/es
Mª del Mar Hernández Álamos - Cristina Menéndez Menéndez
Departamento
Agricultura y Alimentación
Curso académico
2013/2014
ESTUDIO DE LA BIODIVERSIDAD FÚNGICA EN EL SUELO DEL VIÑEDO DE LA FINCA LA GRAJERA
RESUMEN:
La diversidad fúngica del suelo tiene gran importancia como indicador de la
fertilidad y del estado sanitario del suelo, por lo que va a jugar un papel fundamental
en el desarrollo de las especies vegetales instaladas en el mismo.
Las prácticas agrícolas condicionan y ejercen una influencia importante en la
biodiversidad al modificar las condiciones de equilibrio que suelen darse en los
ecosistemas naturales.
El objetivo de este trabajo ha sido el estudio de la biodiversidad de los hongos
filamentosos en el suelo del viñedo, para lo que se ha muestreado en las zonas con
cubierta y sin cubierta de este cultivo en las cuatro estaciones del año.
Para extraer los hongos del suelo se ha utilizado el método de diluciones y para
la identificación y estudio de las poblaciones se realizó el cultivo in vitro de estas
diluciones y de los morfotipos aislados. Se identificaron hongos de los géneros
Aspergillus, Penicillium, Alternaria, Paecilomyces y Rhizopus, muy habituales, todos
ellos, en los estudios de diversidad del suelo independientemente de los métodos
utilizados para ello.
Los resultados obtenidos nos dicen que no se han observado grandes
diferencias entre las poblaciones de hongos en las distintas estaciones del año salvo en
el otoño. En el caso de los suelos con cubierta vegetal, se obtuvieron valores
ligeramente superiores de poblaciones y morfotipos con respecto a los suelos
cultivados con laboreo.
El índice de diversidad de Shannon tuvo valores aproximados entre 2 y 3,
acordes a una diversidad media en consonancia con un monocultivo como puede ser el
viñedo.
Alejandro Burgos Ramírez
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ESTUDIO DE LA BIODIVERSIDAD FÚNGICA EN EL SUELO DEL VIÑEDO DE LA FINCA LA GRAJERA
ÍNDICE:
1. INTRODUCCIÓN.
1.1. Importancia de los hongos en el suelo.
1.2. Métodos de estudio de los hongos en el suelo.
1.3. Influencia de los factores abióticos y bióticos
en los hongos del suelo.
1.4. Principales géneros de hongos que aparecen en el suelo.
3.
3.
3.
2. OBJETIVOS.
7.
3. MATERIALES Y MÉTODOS.
3.1. Localización de la zona de estudio.
3.2. Toma de muestras.
3.3. Siembra de diluciones.
3.4. Siembra de morfotipos aislados.
3.5. Descripción de las características macroscópicas.
3.6. Descripción de las características microscópicas.
3.7. Índices ecológicos.
8.
8.
10.
10.
11.
11.
12.
13.
4. RESULTADOS
4.1. Estudio general de las poblaciones de hongos.
4.2. Estudio general del número de morfotipos.
4.3. Estudio detallado de los morfotipos y géneros identificados.
4.4. Estudio de los índices ecológicos.
4.5. Identificación de los morfotipos aislados.
4.5.1. Género Aspergillus: Morfotipos A1, B1, N1, V2 y V5.
4.5.2. Género Penicillium: Morfotipos B4, V3 y V4.
4.5.3. Género Alternaria: Morfotipos N2 y V1.
4.5.4. Género Paecilomyces: Morfotipos B3 y R2.
4.5.5. Género Rhizopus: Morfotipo G1.
4.5.6. Géneros sin identificar: Morfotipos A2, B2 y R1.
15.
15.
15.
16.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
5. DISCUSIÓN.
27.
6. BIBLIOGRAFÍA.
29.
7. AGRADECIMIENTOS.
33.
8. ANEXO 1.
34.
Alejandro Burgos Ramírez
5.
7.
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1. INTRODUCCIÓN.
1.1.
Importancia de los hongos en el suelo.
La diversidad microbiana puede ser un buen indicador de la salud de los suelos
(Garbisu et al, 2007)). Esta diversidad, es particularmente importante cuando se
considera la suficiencia de los ecosistemas para responder a condiciones ambientales
cambiantes ya que incrementa la capacidad de amortiguación y de resilencia de éstos
a situaciones de estrés.
De los microorganismos encontrados en el suelo, los hongos tienen una
importancia excepcional en la degradación de la materia orgánica. Además del
beneficio que reporta esta actividad al cultivo en cuanto al incremento de la fertilidad
del suelo, varios estudios han demostrado que la diversidad fúngica del suelo se
relaciona con la disminución de la incidencia de enfermedades en los cultivos (Manici
and Caputo, 2010) favoreciendo la presencia y desarrollo de antagonistas y
estimulando el sistema de defensa de las plantas, reafirmando los estudios que
contemplaban su potencial como agentes de control biológico sobre otros hongos,
nematodos y artrópodos (Alexopoulos et al. 1996).
Los hongos representan la mayor parte de la biomasa microbiana en el
volumen del suelo, donde pueden formar estructuras de resistencia que les permiten
sobrevivir en ambientes desfavorables presentando una baja probabilidad de extinción
local (Maron et al. 2011). Además juegan un papel importante en la formación de
macroagregados, afectando a la estructura del suelo a través de mecanismos físicos
donde las hifas mantienen unidas las partículas del suelo mientras invaden nuevos
poros. De esta manera el micelio y algunas partículas del suelo se van extendiendo
conjuntamente creando una capa mullida de tierra cultivable que favorece el
crecimiento de las raíces. (Celik et al., 2004)
1.2.
Métodos de estudio de los hongos del suelo.
Los estudios que conllevan la cuantificación de la biodiversidad del suelo y el
análisis de su papel en el funcionamiento biológico de los ecosistemas son mucho
menos comunes que aquellos similares que se han llevado a cabo para organismos
sobre el nivel de la tierra, en particular sobre las plantas.
El cultivo “in vitro” de hongos a partir del método de diluciones (en el que se
basó nuestro estudio) nos aporta información sobre las colonias desarrolladas que
proceden de esporas u otros propágulos (Warcup, 1957). Las limitaciones que tiene
este método incluyen la dificultad para extraer esporas de las partículas del suelo
(Tabacchioni et al., 2000), la incapacidad del cultivo de un gran número especies de
hongos en las condiciones de crecimiento (temperatura, pH, luz) a las que se someten
en el laboratorio para su desarrollo y la potencial inhibición de ciertas colonias por la
acción de otras colonias en el medio de cultivo (kirk et al, 2004). Además, el tamaño de
la placa de cultivo favorece a los microorganismos que crecen con más rapidez y a
aquellos hongos que producen un mayor número de esporas (Dix and Webster, 1995).
Alejandro Burgos Ramírez
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Las limitaciones que presenta el estudio de la diversidad de hongos en el suelo
no dependen solamente de los métodos de estudio sino también del desconocimiento
sobre cómo clasificar e identificar las especies presentes (Kirk et al. 2004). En cuanto a
la metodología, una de las dificultades es la heterogeneidad innata del suelo y de la
distribución espacial de los microorganismos en el mismo (Trevors, 1998; Franklin and
Mills, 2003). Lo mismo pasa con la distribución temporal que hace que los resultados
de los estudios realizados en intervalos de tiempo amplios la variabilidad sea muy
grande (Klironomos et al. 1999).
Otra es la dificultad que presentan muchas especies de hongos para su cultivo
en laboratorio (Van Elsas et al., 2000). Para solucionar este problema se han
desarrollado una serie de métodos basados en técnicas moleculares de extracción de
DNA y RNA. Estas técnicas no están exentas de sus propias limitaciones entre las que
está la eficiencia de lisis de las estructuras fúngicas, así las esporas pueden romperse
de distinta forma que el micelio y los micelios de diferentes edades también presentan
esta diferencia a la hora de romperse (Proser, 2002). Además, los métodos de
extracción de DNA y RNA pueden descomponer los ácidos nucleicos provocando
problemas en la detección posterior con el PCR (Wintzingerode et al. 1997). En
muestras tomadas en medios naturales, en las que aparecen ácidos húmicos se tiende
a realizar procesos de purificación que suelen acarrear la pérdida de parte de DNA y
RNA con la consiguiente devaluación de los resultados (Kirk et al., 2004).
Como ya se ha mencionado, también existen dificultades a la hora de identificar
los hongos. La mayor parte de las corrientes taxonómicas se basan en el estudio de los
órganos de reproducción sexual de los hongos y el problema existe cuando intentamos
identificar las estructuras vegetativas que están en el interior del suelo (Horton, 2002).
Los métodos moleculares han avanzado en este sentido pero las bases de datos en las
que se apoyan no son lo suficientemente amplias para resolver muchas incógnitas.
La Taxonomía AMF (hongos micorríticos arbusculares) también se encuentra
con problemas a la hora de identificar esporas morfológicamente similares. Esto hace
que exista una limitación importante de la utilización de las técnicas moleculares con la
taxonomía AMF dada la falta de comprensión de polimorfismo genético en esta
clasificación (Redecker et al. 1999).
Pese a estos inconvenientes que se han expuesto, la metodología con la que
hemos llevado a cabo el estudio nos ha permitido, en un plazo corto de tiempo, con un
coste mínimo y una serie de conocimientos básicos que se han ido adquiriendo a lo
largo del mismo, obtener una relación de datos que nos han servido para evaluar la
biodiversidad fúngica del suelo de las zonas de muestreo establecidas en el viñedo con
resultados muy similares a estudios realizados con este mismo objetivo.
Alejandro Burgos Ramírez
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1.3.
Influencia de los factores abióticos y bióticos en los hongos del suelo.
El nivel y tipo de materia orgánica influye en las comunidades de hongos que
aparecen en el suelo ya que las plantas constituyen los hábitats y fuentes de energía
para la mayoría de las especies fúngicas que siempre presentan algún grado de
especificidad por el hospedante o el tipo de sustrato (Jansen, 1988; Sarrionandia
Areitio, 2006).
Los hongos suelen tener mayor capacidad de adaptación a rangos de pH más
amplios que otros microorganismos del suelo, aunque el óptimo es entre 4 y 6 (Rousk
et al, 2009).
La salinidad influye sobre el desarrollo de la vegetación por lo que la cantidad y
calidad de la materia orgánica disminuye afectando así a los hongos que se establecen
en estos suelos. (Samaniego-Gaxiola and Chew-Madinaveitia, 2007)
En general, la mayoría de los géneros de hongos que se encuentran en el suelo
son mesófilos, es decir su temperatura óptima de crecimiento está entre los 15 y 35ºC,
aunque pueden soportar temperaturas de 0 a 62ºC (Ramos and Zúñiga, 2008).
Al aumentar el nivel de humedad en el suelo, necesario para la mineralización
de la materia orgánica, se favorece el desarrollo de los hongos, aunque el exceso
impide la difusión de O2 inhibiendo la actividad de los hongos aeróbicos. (SamaniegoGaxiola and Chew-Madinaveitia, 2007)
A medida que descendemos en el perfil del suelo, el contenido en materia
orgánica y la presencia de O2 disminuyen, debido a la falta de agregados y espacios
porosos, por lo que se limita el desarrollo de los hongos (Grantina et al,. 2012).
A nivel biológico, en el suelo, los hongos establecen relaciones complejas entre
ellos y con el resto de los microorganismos que habitan este ecosistema (bacterias,
algas, protozoos, helmintos, artrópodos). Muchos Ascomicetes del suelo y sus
anamorfos producen compuestos con actividad inhibitoria sobre otros organismos,
como los antibióticos, dióxido de carbono, etileno o amonio. Los antibióticos son
sustancias derivadas de su metabolismo secundario, y se producen cuando las fuentes
de carbono son abundantes pero el crecimiento está limitado por la carencia de otros
nutrientes esenciales (Carlile et al., 2001). También establecen relaciones con las
plantas actuando como saprófitos, degradando la materia orgánica muerta que
generan, como patógenos afectando a los tejidos vivos de los vegetales (algunos
hongos como Armillaria mellea pueden comportarse como saprófitos y como
patógenos cuando tienen un huésped que parasitar, son lo que se llaman saprófitos
facultativos y como organismos simbiontes beneficiándose de su convivencia con las
mismas. (Redmond et al, 1986).
La presencia del hombre y el desarrollo de su actividad tienen una enorme
influencia en los ecosistemas. Se ha demostrado que las diferentes prácticas agrícolas,
el tipo de plantas que se cultivan, la fertilización y los tratamientos con pesticidas y
herbicidas tienen un marcado efecto en la diversidad de las comunidades microbianas
de suelos (El Fantroussi, et al., 1999; 2003; Girvan, et al., 2004).
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La vid es uno de los cultivos más importantes en el mundo. España es el país
con más superficie dedicada al cultivo de la vid a nivel mundial, extendiéndose por
todas las provincias españolas y representando aproximadamente el 8% de la
superficie total cultivada, siendo superada sólo por trigo y olivo.
En el manejo más habitual del viñedo, los suelos requieren del aporte añadido
de insumos como son fertilizantes, productos químicos para el manejo fitosanitario y
de la realización de laboreo para evitar la competencia de adventicias con el cultivo.
El uso de la cubierta vegetal en este cultivo es poco significativo a nivel de la superficie
en que se lleva a cabo, aunque se va introduciendo, cada vez más, en fincas en las que
la inclusión de esta técnica de cultivo no implica un exceso de competencia con el
desarrollo adecuado del viñedo. En el plan de ordenación territorial, en La Rioja, se va
a proponer en viñedos situados en zonas con más de un 8% de inclinación.
El uso de cubierta vegetal incrementa la diversidad de plantas en este cultivo,
sobre todo cuando se favorece el desarrollo de la vegetación autóctona, y además
tiene una serie de consecuencias favorables como la reducción del riesgo de erosión, la
mejora de la estructura del suelo evitando el lavado de nutrientes y contribuyendo al
reciclaje de los mismos, así como el aumento del contenido en materia orgánica con la
consiguiente mejora de la actividad biológica del suelo. En los cultivos donde existe
una mayor diversidad de plantas se ha demostrado que la biodiversidad puede ser una
herramienta importante en el equilibrio de la interacción entre plantas, insectos y
microorganismos (Altieri, 2002).
La cubierta vegetal permanente en cultivos leñosos, tiene como consecuencia
la creación de la típica cama rica en material herbáceo, que da lugar a la existencia de
hongos que están relacionados con la descomposición de este material herbáceo y que
forman parte de las comunidades de hongos que habitan en la capa superficial del
suelo (Manici and Caputo, 2010).
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1.4.
Principales géneros de hongos encontrados en los suelos.
La mayor parte de las especies identificadas pueden ser consideradas
saprófitas, es decir, se desarrollan sobre materia orgánica muerta y así se refleja en la
mayoría de los estudios llevados a cabo sobre la presencia de hongos en el suelo.
Como los patrones o modelos de aislamiento suelen ser los mismos para este
tipo de estudios es habitual encontrarnos con el mismo tipo de géneros de hongos
independientemente del lugar del mundo donde el estudio se lleve a cabo. (Azaz 2003,
Cavalcanti et al. 2006, Tangjang et al. 2009).
Debido a los métodos utilizados para la identificación de los hongos del suelo,
se tienden a encontrar aquellos géneros que producen estructuras como conidias,
clamidosporas y/o esclerocios. Así es muy común encontrar e identificar géneros como
Penicilliun, Aspergillus, Trichoderma y Fusarium entre los Hyphomicetos y Mucor,
Rhizopus o Mortiriella entre los Zygomicetos. La mayoría de estos géneros se repiten
en estudios realizados en plantaciones de melocotón en Italia (Manici and Caputo,
2010), bosques tropicales de La India (Satish et al. 2007), bosques atlánticos de Brasil
(Costa et al. 2011), reservas forestales de Nigeria (Adeduntan, 2009), cultivos de Nogal
en México y desiertos de Israel (Samaniego-Gaxiola and Chew-Madinaveitia, 2007) y
entre ellos aparecen siempre Penicillium y Aspergillus.
2. OBJETIVO.
El objetivo de este trabajo fue evaluar la diversidad fúngica en el suelo del
viñedo situado en la Finca de La Grajera en Logroño. Se compararon dos sistemas de
manejo del cultivo, con cubierta vegetal y laboreo convencional, en los que se
estudiaron las poblaciones de hongos del suelo en cada una de las cuatro estaciones
del año. Este trabajo se integra dentro del Proyecto Life BioDivine que reside en el
ICVV. Mi contribución ha sido el muestreo, siembra, identificación y análisis de los
resultados obtenidos durante el año 2013 en las zonas establecidas en el viñedo, así
como el estudio comparativo de los datos.
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3. MATERIALES Y MÉTODOS.
3.1.
Localización de la zona de estudio.
El estudio se llevó a cabo en el viñedo de la Finca de La Grajera situada en la
carretera nacional a 3 km de Logroño.
Esta finca está caracterizada por dos tipos de uso del terreno: reserva natural y
viñedo. La reserva natural representa un alto porcentaje sobre el total de superficie
donde el viñedo ocupa el 23,81%. El resto de la superficie está ocupada por praderas
(gramíneas), matorral, bosque mediterraneo y cultivo de olivo.
El clima es el típico de las zonas mediterráneas, con unas precipitaciones
anuales que oscilan entre 400-500 mm, una evapotranspiración intensa, superior a los
800 mm anuales. La temperatura media es de 13-14ºC y la duración media del período
seco oscila entre 4-5 meses. Incluye también microclimas condicionados por su
orografía y la presencia de un pantano que fue construido en 1883 y ampliado en
1908, con el fin de aprovechar esa reserva de agua procedente del río Iregua para
regar las huertas del sur de la ciudad.
Los suelos son de origen sedimentario y están constituidos por arcillas calcáreas
rojas más o menos limosas y en algunas zonas, bandas de arenisca intercaladas que se
corresponden con depósitos de antiguos canales.
La vegetación natural del espacio estaría representada por matorrales
nitrófilos, con especies como la ontina, y especies propias de suelos salobres como
albardín y orgaza. También vemos carrascas, representando a la restante vegetación
destacable en la zona y áreas de coscoja en la zona oeste. Más cerca de la zona
húmeda, crecen ejemplares como sauces, olmos, álamos blancos y tamarices.
En lo concerniente a las prácticas agrícolas, la cubierta vegetal en el viñedo se
limita a una zona donde se esta estudiando la influencia de cubiertas de gramíneas y
leguminosas sobre el desarrollo de las plantas de vid (hay que ver como se referencia).
En cuanto a la protección fitosanitaria hay que reseñar que parte del área cultivada de
viñedo y olivo, dentro de la Grajera, está sujeta a la normativa de producción en
Agricultura Ecológica.
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Figura 1: Mapa de distribución de las diferentes zonas que componen La Grajera y que se detallan en la
tabla1 (Escala 1:10.000).
Zonas
Áreas artificiales
Gramíneas
Viñedo
Olivar
Bosque
Vegetación dispersa
Pantano
Agua
Total
Superficie (Ha)
18.86
12.86
96.26
18.47
91.92
115.50
13.12
37.24
404.24
%
4.77
3.20
23.81
4.57
22.74
28.57
3.25
9.21
100
Tabla 1. Descripción de las diferentes zonas que componen la Finca de La Grajera con su superficie y el
porcentaje que ocupan dentro de la misma
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3.2.
Toma de muestras.
La toma de muestras se realizó en la superficie destinada al cultivo del viñedo.
Se diferenciaron cuatro zonas de muestreo:
CC Calle: Calle entre líneas de cultivo con cubierta vegetal. Las muestras fueron
recogidas en el centro de la calle.
CC Cepa: Líneas de cultivo con cubierta vegetal. Las muestras fueron recogidas a 50 cm
del pie de la cepa en la misma línea de cultivo.
SC Calle: Calle entre líneas de cultivo sin cubierta vegetal. Las muestras fueron
recogidas en el centro de la calle.
SC Cepa: Líneas de cultivo sin cubierta vegetal. Las muestras fueron recogidas a 50 cm
de la cepa en la misma línea del cultivo.
Cada toma de muestra se realizó en un perfil de suelo entre 5 y 20 cm,
recogiendo, aproximadamente, 500 gr de tierra de cultivo.
Se extrajeron dos muestras en cada zona de muestreo. En cada extracción se
limpiaron con alcohol los utensilios (azada, pala jardinera,…) utilizados, evitándose así
contaminaciones de unas tomas a otras.
Las muestras extraídas se llevaron a laboratorio, allí se colocaron cada una de
ellas sobre un papel, en el que se detalló el origen de la misma (zona de muestreo
donde se ha recogido). Se dejaron secar, en una habitación aireada, durante dos
semanas.
3.3.
Siembra de las diluciones.
Las muestras, se cribaron utilizando un tamiz de 2 mm y se pasaron cada una
de ellas por separado, limpiando bien con alcohol al cambiar de muestra. De cada una
de ellas se separaron 50 gramos.
Se tomaron 50 gramos de las dos muestras de la misma zona de muestreo y se
juntaron, removiendo hasta uniformizar la mezcla. De estos 100 gramos, se escogieron
10 gramos y se introdujeron en un matraz, añadiéndose 90 ml de agua destilada,
previamente esterilizada en autoclave. El matraz con la disolución, después de taparse
se introdujo en un agitador a 120 r.p.m. durante 20 minutos.
Con esta disolución 10 -1 se cogieron 0,5 ml (500 µl) y se introdujeron en un
tubo de ensayo, añadiendo 4,5 ml de agua esterilizada previamente en autoclave,
obteniéndose una dilución 10-2. De cada dilución se sembraron 3 placas Petri de 9 cm
de diámetro en medio de cultivo RB (rosa bengala), añadiendo 100 µl de la disolución
en cada placa para cada zona de muestreo.
La siembra se llevó a cabo en una cámara de flujo, donde se mantenía
encendido un mechero Bounsen para evitar las contaminaciones y desinfectar el asa
Digralsky con la que se extendió la disolución depositada en cada placa.
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Una vez sembrados se cerraron con parafilm las placas y se introdujeron en una
cámara de incubación a 25ºC de temperatura y humedad del 80% durante 5 días.
Al cabo de una semana, se tomaron las placas y se realizó el conteo del número de
morfotipos y UFCs (unidades formadoras de colonias) que aparecían en cada placa.
Después se eligieron los morfotipos de hongos más representativos y aquellos que no
se habían aislado en estudios anteriores. Cada uno de los morfotipos se definió, con un
código alfanumérico, según su color. Se marcó la posición en la placa donde fueron
elegidos.
Se contaron el número total de colonias en cada una de las placas, tanto en el
anverso como en el reverso, así como el número de morfotipos para calcular la riqueza
de cada zona y las UFCs de cada morfotipo en las placas de la dilución 10 -2.
3.4.
Siembra de los morfotipos aislados.
Se seleccionaron 16 morfotipos para su identificación. Se prepararon cuatro
placas Petri de 5 cm por morfotipo: dos con medio RB (Rosa Bengala) y dos con medio
PDA (Patata dextrosa agar). La siembra de los aislados se llevó a cabo en la cámara de
flujo, donde se mantuvo un mechero Bunsen de gas encendido para evitar
contaminaciones y desinfectar la aguja con la que realizamos la extracción de parte del
micelio de la placa matriz para su inoculación en las placas de aislados.
Se cerraron con parafilm cada una de las placas y se introdujeron en la cámara de
crecimiento a 25 ºC de temperatura, sin fotoperíodo, en oscuridad durante 24 horas y
con humedad del 80 %.
Se mantuvieron en la cámara de crecimiento hasta que su desarrollo invadió la
superficie total de la placa (en la mayoría de ellos), midiendo el crecimiento miceliar
cada día, a partir del día siguiente a la siembra en cada una de las placas de los dos
medios (PDA y RB), repitiéndose esta operación durante 12 días.
Al término de estas mediciones, se definieron las características más
importantes de cada morfotipo aislado, describiéndose las características
macroscópicas relacionadas con la forma, color, textura, topografía, presencia de
anillos o radios en su desarrollo y aparición de exudados y/o secreciones.
3.5.
Descripción de las características macroscópicas.
Las referencias para describir macroscópicamente los morfotipos aislados
fueron las siguientes:
Forma
Punteada
Circular
Filamentosa
Irregular
Rizoide
Lanceolada
Figura 2: Formas de desarrollo en placa de los aislados cultivados.
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Topografía
Plana
Elevada
Convexa
Cúpula
Umbonada
Umbilicada
Figura 3: Topografía del desarrollo en placa de los aislados cultivados.
Textura
Textura algodonosa: Se caracteriza por un micelio aéreo denso y muy alto, con
aspecto de algodón.
Textura granular o pulverulenta: con facilidad se desmenuzan por la excesiva
producción de conidias. Con frecuencia estos dos términos se intercambian, sin
embargo la textura granular es más rugosa semejante al azúcar granulado, mientras
que la pulverulenta parece harina.
Textura terciopelo: Produce micelio aéreo bajo, con aspecto de felpa o terciopelo.
Textura glabrosa o cerosa: No producen micelio aéreo, por lo tanto tienen una
superficie pareja. Generalmente se presentan en las colonias de levaduras
Figura 4: Textura del desarrollo en placa de los aislados cultivados
Color: Se hizo referencia al color del aislado en el anverso de la placa.
Crecimiento miceliar
Muy rápido o invasor: Ocupa la placa en 1 ó 2 días.
Rápido: Ocupa la placa en 3-7 días.
Moderado: Crece de 10-30 mm en 7-12 días.
Lento: Crece menos de 10 mm en más de 12 días
Figura 5: Velocidad de crecimiento miceliar.
3.6.
Descripción microscópica de los morfotipos
Para el estudio microscópico se precisó de un microscopio con una lente de 100
aumentos en el que se pudiera acoplar una cámara fotográfica de precisión. Se dispuso
de un “portaobjeto” además de cinta adhesiva de celo con la que se extrajo parte de la
estructura del hongo para fijarla en el “portaobjeto” sin dañarla. Añadimos una gota
de aceite de inmersión, cada vez que se observó al microscopio una muestra, para
optimizar el paso de los rayos de luz y tener una imagen más nítida. Se miró cada
muestra hasta lograr visualizar imágenes de hifas y/o esporas y cuerpos fructíferos,
realizándose fotografías de las mismas.
Estas fotografías microscópicas junto con el estudio de crecimiento de los
aislados y su descripción macroscópica nos ayudaron a determinar el género de varios
de los morfotipos aislados.
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Los hongos aislados fueron identificados en base a las características
morfológicas macroscópicas y microscópicas usando las claves taxonómicas más
relevantes (Ellis, 1971; Nelson et al., 1983; Samson and van Reenen-Hoekstra, 1988;
Watanabe, 2002)
3.7.
Índices ecológicos.
Después de determinar el número de morfotipos en las diferentes muestras,
para las cuatro estaciones del año, se aplicaron a los resultados obtenidos los
siguientes índices (Costa et al, 2012):
Índice de diversidad de Shannon-Wiener (H’)
Este índice es una medida de la incertidumbre para predecir a qué especie
pertenecerá un individuo elegido al azar de una muestra de S especies y N individuos.
Por lo tanto, H’ = 0 cuando la muestra contenga solo una especie, y, H’ será máxima
cuando todas las especies S estén representadas por el mismo número de individuos
ni .
Combina tanto la riqueza de especies como la equitabilidad:
H´= pi = ni/N donde:
N: número total de morfotipos de la muestra
ni: número de individuos de cada morfotipo
Varía entre valores de 0 y un valor máximo que suele estar cerca de 5, aunque
hay ecosistemas excepcionalmente ricos que pueden superar este valor.
Indice de equitabilidad de Pielou (J´)
Este índice hace referencia a cómo la abundancia (número de individuos,
biomasa, cobertura, etc.) se distribuye entre las especies de la comunidad. Por
ejemplo, en una comunidad con 10 especies, si el 90% de los individuos pertenecen a
una sola especie y el restante 10% se distribuye entre las otras 9, la equitabilidad se
considera baja. En cambio, si cada una de las 10 especies cuenta con el 10% del total
de los individuos, la equitabilidad se considera máxima.
H´: Índice de diversidad de Shannon-Wiener
S: Riqueza de morfotipos de cada muestra
Adquiere valores comprendidos entre 0 y 1.
Alejandro Burgos Ramírez
Página 13
ESTUDIO DE LA BIODIVERSIDAD FÚNGICA EN EL SUELO DEL VIÑEDO DE LA FINCA LA GRAJERA
Índice de dominancia de Berger-Parker (d)
Tiene en cuenta parámetros inversos al concepto de uniformidad o
equitabilidad de la comunidad. Mide la dominancia del morfotipo más abundante sin
evaluar la contribución del resto de los morfotipos.
N max: Número de individuos del morfotipo más abundante
N total : Número de individuos de una muestra.
Este índice adquiere valores comprendidos entre 0 y 1.
Alejandro Burgos Ramírez
Página 14
ESTUDIO DE LA BIODIVERSIDAD FÚNGICA EN EL SUELO DEL VIÑEDO DE LA FINCA LA GRAJERA
4. RESULTADOS.
4.1.
Estudio general de las poblaciones de hongos.
Los datos obtenidos sobre población total de hongos, en cada una de las zonas
de muestreo, en las diferentes estaciones se interpretan a partir de la tabla 1. La
estación en la que se obtuvo la mayor población fue el otoño, especialmente en la calle
con cubierta y en la línea de cepas sin cubierta.
ESTACIONES
INVIERNO
PRIMAVERA
VERANO
OTOÑO
CC CALLE
23,00
32,00
26,33
56,67
ECOSISTEMAS
CC CEPA
SC CALLE
26,33
18,33
30,00
30,33
22,00
33,33
32,67
27,00
SC CEPA
22,00
24,33
27,00
40,00
Tabla 2. Unidades formadoras de colonias (UFC x 103/ g de suelo) de hongos aislados en el viñedo de la
Finca La Grajera.
En invierno, primavera y otoño el número de UFCs en la zona de muestreo con
cubierta fue ligeramente más alto que en el de sin cubierta. En verano se dio el caso
contrario, al obtenerse un mayor número de hongos en la zona sin cubierta, aunque
las diferencias no fueron significativas.
Con respecto a los resultados en las zonas de muestreo de cepa y calle, se
observó que en las calles (en las estaciones de primavera y verano) el número de
hongos fue mayor que en las muestras recogidas en la línea de las cepas. En invierno el
número de hongos fue mayor en las cepas, mientras que en el otoño las diferencias en
la población fúngica entre calle y cepa son significativas, en la cubierta fue mayor en
calle mientras que sin cubierta los mayores números los obtuvimos en la cepa.
4.2.
Estudio general del número de morfotipos.
Los resultados relacionados con el número de morfotipos en cada uno de las
zonas de muestreo en las diferentes estaciones se indican en la Figura 6. Se observó
que el otoño es la estación que presentó mayor número de morfotipos en cada una de
las zonas de muestreo. Los valores máximos se obtuvieron en la calle con cubierta
vegetal y en la línea de cepas sin cubierta. Por el contrario, la estación de primavera es
la que menos morfotipos presentó, con un valor mínimo en la calle sin cubierta.
En el caso de la cubierta, el mayor número de morfotipos se dio en las
estaciones de invierno y otoño. En el muestreo sin cubierta, el menor número de
morfotipos se obtuvo en la calle, significativamente más bajo en la estación de
invierno con respecto al resto de las zonas de muestreo.
Alejandro Burgos Ramírez
Página 15
ESTUDIO DE LA BIODIVERSIDAD FÚNGICA EN EL SUELO DEL VIÑEDO DE LA FINCA LA GRAJERA
25
20
Invierno
15
Primavera
Verano
10
Otoño
5
0
CC Calle
CC Cepa
SC Calle
SC Cepa
Figura 6. Número de morfotipos de cada muestra en las diferentes estaciones.
4.3.
Estudio de los índices ecológicos.
La tabla 3 muestra los índices que se consideraron más representativos para
valorar las poblaciones de hongos en el suelo.
INDICES
ESTACIONES
(J)
Índice de
equitabilidad de
Pielou
CC Calle
INVIERNO
0,64
PRIMAVERA 0,82
VERANO
0,64
OTOÑO
0,48
ECOSISTEMAS
CC Cepa
SC Calle
0,71
0,63
0,72
0,78
0,45
0,54
0,73
0,52
SC Cepa
0,76
0,74
0,63
0,69
(d)
Índice de
dominancia
de Berger-Parker
INVIERNO
PRIMAVERA
VERANO
OTOÑO
0,39
0,21
0,31
0,62
0,25
0,26
0,47
0,23
0,28
0,33
0,40
0,27
0,33
0,25
0,29
0,28
(H´)
Índice de
diversidad de
Shannon-Wiener
INVIERNO
PRIMAVERA
VERANO
OTOÑO
2,69
3,04
2,43
2,07
2,91
2,67
1,90
3,03
2,27
2,70
2,20
2,23
2,97
2,80
2,46
2,97
Tabla 3. Índices de equitabilidad de Pielou (J), de dominancia de Berger-Parker (D), y de diversidad de
Shannon-Wiener (H´).
El índice de diversidad de Shannon varió en este estudio entre valores mínimos
aproximados de 2 y valores máximos aproximados de 3. Se trata de valores que indican
una diversidad media en consonancia con un monocultivo como es el viñedo
Destaca el valor (2,07) en el índice de Shannon-Wiener de otoño en la calle con
cubierta vegetal, que se explica por la alta presencia del morfotipo B5 (41 UFCs) en
Alejandro Burgos Ramírez
Página 16
ESTUDIO DE LA BIODIVERSIDAD FÚNGICA EN EL SUELO DEL VIÑEDO DE LA FINCA LA GRAJERA
esta zona de muestreo incrementando la dominancia de este morfotipo frente al resto
y haciendo que disminuya considerablemente el índice de diversidad.
El valor más bajo de este índice (1,90) se da en verano en la línea de cepa con
cubierta, donde aparece el menor número de morfotipos y se puede deber al exceso
de competencia por la falta de humedad que hace que, solamente, aquellos más
adaptados mantengan su actividad en esta época. (Ramos y Zúñiga, 2008).
El índice de equitabilidad de Pielou tiene su mayor valor en primavera, donde
alcanza resultados muy altos en todas las zonas de muestreo. Su valor más bajo es en
otoño en la calle con cubierta.
El índice de dominancia de Berger-Parker tiene valores por debajo de 0,5 en
todas las estaciones y zonas de muestreo, salvo en otoño en la calle con cubierta.
Alejandro Burgos Ramírez
Página 17
ESTUDIO DE LA BIODIVERSIDAD FÚNGICA EN EL SUELO DEL VIÑEDO DE LA FINCA LA GRAJERA
4.4.
Estudio detallado de los morfotipos y géneros identificados.
INVIERNO
PRIMAVERA
VERANO
OTOÑO
MORFOTIPOS CC CALLE CC CEPA SC CALLE SC CEPA CC CALLE CC CEPA SC CALLE SC CEPA CC CALLE CC CEPA SC CALLE SC CEPA CC CALLE CC CEPA SC CALLE SC CEPA
A1
A2
B1
B2
B3
B4
B5
B6
B7
G1
M1
N1
N2
N3
NA1
R1
R2
V1
V2
V3
V4
V5
V6
1
1
1
1
1
2
9
5
1
2
1
2
2
1
4
1
2
5
1
1
1
1
1
3
2
4
6
6
9
3
4
3
6
1
1
5
1
1
4
1
1
4
1
3
11
8
1
6
1
10
1
1
3
4
5
7
2
1
10
3
8
1
8
2
4
1
2
3
1
6
1
6
41
1
2
1
4
1
9
1
8
12
8
4
3
2
8
1
2
8
9
8
3
1
1
2
3
2
1
2
2
5
2
1
1
1
2
1
1
1
2
6
1
4
12
2
1
1
1
1
1
3
3
1
6
4
14
5
2
3
1
5
1
5
Tabla 4. Mofotipos que aparecen en los diferentes muestreos en las estaciones de 2013.
Alejandro Burgos Ramírez
Página 18
ESTUDIO DE LA BIODIVERSIDAD FÚNGICA EN EL SUELO DEL VIÑEDO DE LA FINCA LA GRAJERA
La tabla 4, nos dio una idea de la presencia y número de cada uno de los
morfotipos en las diferentes zonas de muestreo en las cuatro estaciones del año. Los
morfotipos B2, B5, B6 y B7 aparecen en todas las zonas de muestreo y en todas las
estaciones, por lo que se puede decir que son aquellos que soportan mejor las
variaciones edafoclimáticas y los diferentes manejos del suelo.
Los morfotipos G1, NA1 y N3, sólo aparecen en una estación del año, otoño,
invierno y primavera respectivamente por lo que probablemente sean especies que
aparezcan en unas condiciones ambientales específicas y se desarrollen, solamente,
cuando estas condiciones sean propicias para su establecimiento. Solo N3 se encontró
en las zonas con cubierta y sin cubierta y en las muestras de calle y en las de la línea.
El morfotipo V3 es exclusivo de la línea de cepas donde se realiza laboreo,
apareciendo en todas la estaciones excepto en verano y los morfotipos A1, R2 y V2 son
exclusivos de zonas de muestreo con cubierta vegetal.
En la zona con cubierta estarían representados todos los morfotipos aislados,
mientras que en la zona sin cubierta no aparecerían 3 de los 16 morfotipos. En ambas
hubo una representación de los géneros identificados.
En la calle sin cubierta sólo aparecen 6 de los 16 morfotipos identificados,
quedándose sin representación los géneros Alternaria, Paecilomyces y Rhizopus.
En la línea de cepas con cubierta se quedaría sin representar el género
Rhizopus y en la de sin cubierta aparecen todos los géneros.
4.5.
Identificación de los aislados.
La evaluación de las características macro y microscópicas de los 16 aislados
permitió identificar 5 géneros de hongos. Los morfotipos aislados (R1, A2 y B2) se
quedaron sin determinar. Los morfotipos identificados pertenecen a los géneros:
Aspergillus (A1, B1, N1, V2 y V5), Penicillium (B4, V3 y V4), Alternaria (N2 y V1),
Paecilomyces (R2 y B3) y Rhizopus (G1).
En el ANEXO 1, se encuentran las imágenes del desarrollo del cultivo de los
morfotipos aislados en placas con medio de cultivo PDA (Patata Dextrosa Agar) y las
fotografías microscópicas de cada uno de ellos.
Alejandro Burgos Ramírez
Página 19
ESTUDIO DE LA BIODIVERSIDAD FÚNGICA EN EL SUELO DEL VIÑEDO DE LA FINCA LA GRAJERA
4.5.1. Género Aspergillus: Morfotipos A1, B1, N1, V2 y V5.
En la tabla 5, se detallan las características macroscópicas de los morfotipos
identificados dentro del género Aspergillus que forman colonias entre aterciopeladas y
granulosas.
Presentan hifas relativamente anchas, conidióforos rectos sin ramificar de
tamaño variable que terminan en una vesícula apical que puede ser redonda,
hemiesférica o elipsoidal. Las esporas, en ocasiones, tienen estrías en su contorno
(Tabla 11 del ANEXO 1).
La velocidad de crecimiento miceliar en la placa fue entre moderada y rápida en
los morfotipos de este género (Figura 7).
A1
Circular
B1
Circular
Color
Marrón
sobre fondo
blanco
Blanco
Textura
Terciopelo
granulosa
Ligeramente
convexa
Pulverulenta
Forma
Topografía
Anillos
Radios
Secreción
Exudados
N1
Ovaladocircular
Negro sobre
fondo
amarillo
transparente
Granulosa
V2
Ovalado
irregular
Verde pistacho
sobre fondo
amarillo
transparente
Granulosa
Plana
Ligeramente
convexa
Anillos
exterior
granuloso
marrón
Radios
dispuestos
de forma
irregular en
el reverso
Secreción
amarillo
transparente
Anillos muy
marcados
Anillos en el
reverso
Plana,
ligeramente
umbonada
Anillos
difuminados
grumosos en
el reverso
No presenta
radios
Secreción
amarillo
chillón
Secreción
amarillo
transparente
Secreción
amarillo claro
No se
aprecian
Exudado
con gotas
gruesas y
pequeñas
No se
aprecian
No se aprecian
Radios muy Radios en el
anillo central
marcados
en anverso y
reverso
V5
Circular
Verde
negruzco en
el centro
TerciopeloGranulosa
Plana
Anillos muy
numerosos y
marcados en
el reverso
Radios muy
numerosos y
marcados
Secreción
amarillo
verdoso
brillante
Exudado en
gotas
pequeñas
Tabla 5. Descripción macroscópica de morfotipos identificados dentro del género Aspergillus en placas
con medio de cultivo PDA (Patata Dextrosa Agar).
Alejandro Burgos Ramírez
Página 20
ESTUDIO DE LA BIODIVERSIDAD FÚNGICA EN EL SUELO DEL VIÑEDO DE LA FINCA LA GRAJERA
60
50
40
A1
B1
30
N1
V2
20
V5
10
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Figura 7. Gráfica del crecimiento en medio PDA expresada en mm/día
4.5.2. Género Penicillium: Morfotipos B4, V3 y V4.
En la tabla 6, se describen las características macroscópicas de aquellos
morfotipos identificados dentro del género Penicillium, que presentan hifas
relativamente delgadas que dan origen a conidióforos rectos y septados. Éstos pueden
ser únicos (monoverticilados) o ramificados (bi o terverticilados)
Presentan el típico penicilio (pincel) con métulas y fiálides que generan conidios
ovoides o elipsoides, unicelulares y en cadena (Tabla 12 del ANEXO 1)
En el desarrollo en placa del aislado aparecieron varias colonias que acabaron
ocupando toda la superficie de la placa con un crecimiento lineal moderado (Figura 8).
Forma
Color
Textura
Topografía
Anillos
Radios
Secreción
Exudados
B4
Circular
Gris ceniza
Terciopelo
Pulverulenta
Plana, ligeramente
umbonada
Anillos muy marcados
No presenta radios
V3
Ovalo-circular
Verde grisácea
Terciopelo
Pulverulenta
Ondulada como
formando terrazas
Anillos muy marcados
No presenta radios
Secreción grisácea
pulverulenta
No presenta exudado
Secreción grisácea
No presenta exudado
V4
Ovalo-circular
Verde grisácea
Terciopelo Pulverulenta
Plana, ligeramente
umbonada
Anillos muy marcados
Radios muy marcados
en el reverso
Secreción gris
transparente
No presenta exudado
Tabla 6. Descripción macroscópica de morfotipos identificados dentro del género Aspergillus en placas
con medio de cultivo PDA (Patata dextrosa Agar).
Alejandro Burgos Ramírez
Página 21
ESTUDIO DE LA BIODIVERSIDAD FÚNGICA EN EL SUELO DEL VIÑEDO DE LA FINCA LA GRAJERA
60
50
40
B4
30
V3
V4
20
10
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Figura 8. Gráfica del crecimiento en medio PDA expresada en mm/día
4.5.3. Género Alternaria: Morfotipos N2 y V1.
La tabla 7 incluye las características macroscópicas de los morfotipos N2 y V1,
identificados dentro del género Alternaria que se caracteriza por presentar
conidióforos septados, pigmentados simples o ramificados. Conidios oscuros, con
septos transversales y longitudinales, pared lisa o rugosa, pueden estar solos o en
cadenas (Tabla 13 del ANEXO 1).
En la placa, el desarrollo miceliar en la placa tuvo una velocidad de crecimiento
moderada (Figura 9).
Anillos
N2
Ovalado-circular
Negro
Pulverulenta
Plana con ligero tono gris
umbonado
Anillos difusos
Radios
Secreción
Exudados
No presenta radios
Secreción gris amarillenta
No se aprecian
Forma
Color
Textura
Topografía
V1
Circular con perímetro irregular
Verde, negruzco en el centro
Terciopelo Pulverulenta
Plana, ligeramente umbonada
Anillos irregulares con manchas
grumosas
Radios marcados
Secreción marrón amarillenta
No se aprecian
Tabla 7. Descripción macroscópica de morfotipos identificados dentro del género Alternaria en placas
con medio de cultivo PDA (Patata Dextrosa Agar).
Alejandro Burgos Ramírez
Página 22
ESTUDIO DE LA BIODIVERSIDAD FÚNGICA EN EL SUELO DEL VIÑEDO DE LA FINCA LA GRAJERA
40
35
30
25
N2
20
V1
15
10
5
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Figura 9. Gráfica del crecimiento en medio PDA expresada en mm/día.
4.5.4. Género Paecilomyces: Morfotipos B3 y R2.
La tabla 8 incluye las características macroscópicas de los dos morfotipos
identificados dentro del género Paecilomyces que presenta conidióforos lisos o
rugosos, ramificados en cuyo extremo se desarrollan fiálides de base ancha y cuello
largo, conidios unicelulares lisos, elípticos o elipsoides (Tabla 14 del ANEXO 1).
En la placa el desarrollo del micelio tuvo un crecimiento rápido (Figura 10).
Forma
Color
B3
Circular
Blanco amarillento
Textura
Topografía
Terciopelo algodonosa
Plana, ligeramente umbonada
Anillos
Radios
Secreción
Exudados
Anillos marcados
No presenta radios
Secreción amarilla
No se aprecian
R2
Circular
Blanco con tono verde difuso en
el centro
Terciopelo
Plana, muy ligeramente
umbonada
Anillos poco marcados
Radios muy difusos
Secreción blanquecina
Exudados de gotas pequeñas en
el centro
Tabla 8. Descripción macroscópica de morfotipos identificados dentro del género Paecilomyces en
placas con medio de cultivo PDA (Patata Dextrosa Agar).
Alejandro Burgos Ramírez
Página 23
ESTUDIO DE LA BIODIVERSIDAD FÚNGICA EN EL SUELO DEL VIÑEDO DE LA FINCA LA GRAJERA
60
50
40
B3
30
R2
20
10
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Figura 10. Gráfica del crecimiento en medio PDA expresada en mm/día
4.5.5. Género Rhizopus: Morfotipo G1.
En la tabla 9 se describen las características macroscópicas del morfotipo G1
identificado dentro del género Rhizopus presentando hifas aseptadas que terminan en
la típica apófisis (hinchamiento apical del esporangióforo) circular. (Tabla 15 del
ANEXO 1).
Micelio de crecimiento muy rápido (Figura 10).
Forma
Color
Textura
Topografía
Anillos
Radios
Secreción
Exudados
G1 (Rhizopus)
Circular
Gris blanquecino
Algodonosa
Elevada
Anillos muy difusos en el reverso
No presenta radios
No se observa secreción
No se aprecian
Tabla 9. Descripción macroscópica del morfotipo identificado dentro del género Rhizopus en placas con
medio de cultivo PDA (Patata Dextrosa Agar).
Alejandro Burgos Ramírez
Página 24
ESTUDIO DE LA BIODIVERSIDAD FÚNGICA EN EL SUELO DEL VIÑEDO DE LA FINCA LA GRAJERA
60
50
40
30
G1
20
10
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Figura 11. Gráfica del crecimiento en medio PDA expresada en mm/día
4.5.6. Géneros sin identificar: Morfotipos A2, B2 y R1.
No se identificaron puesto que no se encontraron, en las observaciones
microscópicas, cuerpos de fructificación que se correspondieran con lo de un género
concreto en las claves utilizadas.
El morfotipo A2 presenta hifas septadas que aparecen entrelazadas con
esporas irregulares que se presentan agrupadas.
El morfotipo B2 presenta hifas septadas y esporas que aparecen agrupadas.
El morfotipo R1 presenta hifas septadas y esporas circulares agrupadas. (Tabla
16 en el ANEXO 1)
El crecimiento miceliar en la placa en estos casos fue rápido (Figura 11).
Forma
Color
Textura
Topografía
Anillos
Radios
Secreción
Exudados
A2
Circular
Blanco amarillento
Terciopelo algodonosa
Plana, ligeramente
umbonada en el centro
con un penacho blanco
Anillos poco marcados
No presenta radios
Secreción amarillo
marrón
No se aprecian
B2
Circular
Blanco
Ligeramente
algodonosa
Plana, ligeramente
umbonada
R1
Circular
Blanco amarillento
Pulverulenta
granulosa
Plana
No presenta anillos
No presenta radios
Secreción amarillo
marrón
No se aprecian
Anillos marcados
No presenta radios
Secreción blanco
amarillenta
Exudado en gotas
grandes en el centro y
más pequeñas en el
anillo extremo
Tabla 10. Descripción macroscópica de los morfotipos sin identificar en placas con medio de cultivo PDA
(Patata Dextrosa Agar).
Alejandro Burgos Ramírez
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ESTUDIO DE LA BIODIVERSIDAD FÚNGICA EN EL SUELO DEL VIÑEDO DE LA FINCA LA GRAJERA
60
50
40
A2
30
B2
R1
20
10
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Figura 12. Gráfica del crecimiento en medio PDA expresada en mm/día
Alejandro Burgos Ramírez
Página 26
ESTUDIO DE LA BIODIVERSIDAD FÚNGICA EN EL SUELO DEL VIÑEDO DE LA FINCA LA GRAJERA
5. DISCUSIÓN.
Los estudios sobre la biodiversidad fúngica en el suelo del viñedo no son muy
habituales, hay mas información relacionada sobre la introducción y adaptación de
AMF (hongos micorríticos arbusculares) (Adams, 2011) o sobre la presencia de posibles
hongos patógenos o toxinas derivadas de alguno de ellos que pueden afectar
negativamente al cultivo como la ocratoxina de Aspergillus ochraceus (Eltem et al,
2008). En este trabajo se han aislado 16 morfotipos de los que se han identificado 6
géneros, otros autores han llegado a identificar hasta 66 especies agrupadas en 16
géneros diferentes entre los que destacaban Aspergillus, Penicillium, Alternaria y
Rhizopus, al igual que en nuestro estudio; pero también identificaron otros géneros
como Cladosporium y Fusarium entre otros. (Eltem et al. 2008)
La mayoría de estos géneros se repiten en todos los trabajos relacionados con
el estudio de los hongos del suelo independientemente del uso, manejo o cultivo que
se lleve a cabo en él. Se han descrito en en plantaciones de melocotón en Italia (Manici
y Caputo, 2010), bosques tropicales de La India (Satish et al. 2007), bosques atlánticos
de Brasil (Costa et al. 2011), reservas forestales de Nigeria (Adeduntan, 2009), cultivos
de Nogal en México e incluso en desiertos de Israel (Samaniego-Gaxiola and ChewMadinaveitia, 2007).
En lo que se refiere al análisis de los resultados obtenidos en nuestro trabajo, la
estación en la que se obtuvo la mayor población de hongos y se observó el mayor
número de morfotipos fue el otoño. Se puede deber a que la temperatura y la
humedad en esta estación son más adecuadas para la proliferación de hongos, además
del enriquecimiento que se produce en el suelo con la materia vegetal que se
desprende de las plantas. El hecho de que la calle sin cubierta, en esta estación, tenga
las menores poblaciones puede estar influido por la falta de exudados radiculares que
procuren un medio nutricional adecuado para su desarrollo (Fokkema and Schippers,
1986; Martínez Peña, 2008).
En general, la población de hongos fue mayor en las zonas con cubierta, sin
embargo, en verano, se dio el caso contrario. Una de las razones posibles es que, en
esta época, la competencia por el agua es mayor en la zona con cubierta ya que la
evapotranspiración es muy elevada, aspecto que puede provocar el descenso de
población que se observa en esta estación (Ramos and Zúñiga, 2008). Pasó lo mismo,
probablemente por este motivo, con el índice de diversidad de Shannon que obtuvo su
valor más bajo en esta estación (1,90) en la línea de cepa con cubierta.
Se observó que en el caso de la cubierta se contabilizaron un mayor número de
individuos en la zona de calle que en la zona de cepa en todas las estaciones salvo en
invierno. Esto puede ser debido a que en las zonas con cubierta vegetal, los exudados
radiculares proporcionan recursos nutricionales para las poblaciones de hongos
(Medina, 2012). En el invierno la poca actividad general, tanto de la cubierta como del
cultivo, puede provocar que la actividad fúngica disminuya y los datos obtenidos varíen
en este sentido. En la zona sin cubierta la población fúngica fue relativamente menos
abundante, esto puede explicarse por la poca disponibilidad de los recursos
nutricionales (reserva de carbono orgánico en el suelo) y en el caso de las estaciones
Alejandro Burgos Ramírez
Página 27
ESTUDIO DE LA BIODIVERSIDAD FÚNGICA EN EL SUELO DEL VIÑEDO DE LA FINCA LA GRAJERA
frías por la mayor exposición de los hongos a las bajas temperaturas (Ramos and
Zúñiga, 2008).
El número de morfotipos encontrado en las líneas de cepas mantiene unos
valores similares para las zonas de muestreo con cubierta y sin cubierta en las distintas
estaciones. Este resultado puede deberse a que el cultivo del viñedo mantiene unas
condiciones óptimas en el entorno radicular de la cepa que favorecen el asentamiento
de una serie de hongos que se ven poco condicionados por el resto de factores que
pueden influir en su desarrollo.
En cuanto al estudio de la diversidad fúngica, se evaluó en función del índice de
Shannon que varió en nuestro trabajo entre valores mínimos aproximados de 2 y
valores máximos aproximados de 3. Estos resultados estarían en consonancia con los
datos publicados en estudios realizados en suelos de viñedo en Saruhanli (Turquía)
donde se obtuvieron valores máximos de este índice de 3,28.(Eltem el al., 2008), los
llevados a cabo en viñedos en Eskisehir (Turquía) que alcanzaron valores máximos del
índice de Shannon de 3,55. (Demirel et al, 2005) o también, en viñedos de los Altos del
Golán (Israel) que llegaron a unos valores máximos de este mismo índice de 2,82
(Grishkan y Nevo, 2004). Se puede convenir, en base a esta información, que los
valores obtenidos en nuestro estudio indican una diversidad media, acorde con los
valores de diversidad que podemos encontrar en un monocultivo como es el viñedo.
Los resultados obtenidos no indican que la biodiversidad fúngica en el suelo sea
mayor en el viñedo con cubierta vegetal que en el manejo con laboreo convencional.
Sin embargo, datos como que el mayor número de morfotipos y de UFCs se den en
esta zona, nos ayuda a pensar que haya mayor actividad fúngica ya que la cubierta
vegetal contribuye, con fotoasimilados a nivel radicular, a incrementar los recursos
como la fuente de carbono para los microorganismos del suelo además de favorecer la
formación y la estabilidad de los agregados, mejorando el hábitat donde éstos se
desarrollan al incrementar el movimiento de gases, la humedad y las reservas del suelo
(Barriga, 2009).
Tanto en el manejo con laboreo, donde se rompen los agregados del suelo y los
entramados de hifas y micelios que forman ciertos hongos (Simpson et al., 2004),
como en el manejo con herbicida, donde se reducen los recursos de carbono al
eliminar la vegetación de la que se derivan parte de éstos, se influye negativamente
sobre la vida microbiana en el suelo y por consiguiente se estaría influyendo sobre el
número y la diversidad de hongos (Soto González et al, 2010).
Como cada vez parece más interesante el uso de la cubierta vegetal en el
viñedo, bien sea para evitar la erosión en terrenos con pendiente o bien para controlar
el vigor del viñedo con criterios de sanidad vegetal y calidad de la uva (Aguirrezábal et
al, 2012; Ibánez, 2013), se considera por nuestra parte necesario el estudio aplicado a
distintas clases de cubierta que cumplan estos cometidos y que nos permitan valorar
cómo influyen éstas en la diversidad fúngica del suelo.
Alejandro Burgos Ramírez
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6. BIBLIOGRAFÍA.
Adams, K. E. (2011). Influence of vineyard floor management practices on soil
aggregate stability, total soil carbon and grapevine yield. Thesis presented to the
Faculty of California Polytechnic State University, San Luis Obispo.
Adeduntan, S. A. (2009). Diversity and abundance of soil mesofauna and microbial
population in South-Western Nigeria. African Journal of Plant Science. Vol 3, pp. 210216.
Aguirrezábal Bujanda, F.; Sagües Sarasa, A.; Cibrián Sabalza, F.; Suverbiola Ripa, J.; Oria
Ostiz, I. (2012). Cubiertas vegetales en viña. Serie de Investigaciones y Desarrollos
Agrarios del Gobierno de Navarra.
Alexopoulos, J. C., Mims, C. W.,Blackwell, M. (1996). Introductory Mycology, 4th
Edition ISBN: 978-0-471-52229-4 880 pp.
Altieri M.A. (2002). Agroecology: The Science of Natural Resource Management for
Poor Farmers in Marginal Enviroments. Agriculture, Ecosystems and Environment 93,
pp 1-24.
Azaz, A.D. (2003). Isolation and identification of soilborne fungi in fields irrigated by
GAP in Harran Plain using two isolation methods. Turk. J. Bot. 27, pp 83-92.
Barriga Barrientos, R. F. (2009). Recuperación física de un alfisol degradado mediante
diferentes cubiertas vegetales. Universidad de Concepción, Facultad de Agronomía.
Chile.
Calcavanti, M.A.Q., Oliveira, L.G., Fernandes, M.J. and Lima, D.M. (2006). Fungus
filamentosos do solo em municipios na regiao Xingó, Brasil. Acta Botanica Brasilica. 20,
pp 831-837.
Carlile, M.J., Watkinson, C.S., Goday, G.W. (2001). The Funghi. Academic Press,
London.
Celik, I., I. Ortas and S. Kilic (2004). Effect of compost, mycorrhiza, manure and
fertilizer on some physical properties of a Chromoxerert soil. Soil Till. Res. 78. pp 59-67
Costa, P. M. O.; Souza-Motta, C. M. and Malosso, E. (2012). Diversity of filamentous
fungi in different systems of land use. Agroforest Syst. 85, pp 195-203.
Demirel, R., Ilhan, S., S. Asan, A., Kinaci, E., and Oner, S. (2005). Microfungi in cultivated
fields in Eskisehir province (Turkey). J. Basis Microbiol. 45, pp 279-293.
El Fantroussi, S., Verschuere, L., Verstraete, W., Top, E.M. (1999). Effect of phenylurea
herbicides on soil microbial communities estimated by análisis of 16s rRNA gene
fingersprints and community-level physiological profiles. Appl. Environ. Microbiol. 65,
pp 982-988.
Alejandro Burgos Ramírez
Página 29
ESTUDIO DE LA BIODIVERSIDAD FÚNGICA EN EL SUELO DEL VIÑEDO DE LA FINCA LA GRAJERA
Ellis, M.B. (1971). Dematiaceous Hyphomycetes. Commonwealth Mycological Institute,
Kew, U.K.
Eltem, Regine ;Evrim Taskin and Selda Pazarbasi (2009). Biodiversity and flora of
microfungi from sultana-type vineyard soils in Turkey. Fresenius Environmental
Bulletin, 18, nº 1.
Franklin, R. B. and Mills, A. L (2003). Multi-scale variation in spatial heterogeneity for
microbial community structure in an eastern Virginia agricultural field. FEMS
Microbiology Ecology 44, pp 335-346.
Fokkema, N.J. and Schippers, B. (1986). Phyllosphere versus rhizosphere as
environments for saprophytic colonization. In N.J. Fokkema and J. Van den Heuvel ed.
Migrobiology of the phyllosphere. Cambrige University Press, Cambrige, England. pp
137-159.
Garbisu, C., Becerril, J.M. Epelde, L y Alkorta, I. (2007). Bioindicadores de la calidad del
suelo: herramienta metodológica para la evaluación de la eficacia de un proceso
fitorremediador. Ecosistemas. 16 (2), pp 44-49
Givan M.S., Bullimore,K. Ball, A.S., Pretty, J.N. and Osborn, A.M. (2004). Responses of
Active Bacterial and Fungal Communities in Soils under Winter Wheat to Different
Fertilizer and Pesticide Regimens. Appl. Environ. Microbiol. 70, pp 2692-2701.
Grantina, L.; Bondare, G.; Janberga, A.; Tabors, G.; Kasparinskis, R.; Nikokajeva V. and
Muiznieks, I. (2012). Monitoring seasonal changes in microbial populations of spruce
forest soil of the Northern temperature Zone. Estonial Journal of Ecology. 61,3, pp 190214.
Grishkan, I. and Nevo, E. (2004). Soil microfungi of Nadal Meitsar, Golan Heigth. Plant
Biosys. 138, pp 21-26
Horton, T.R. (2002). Molecular approaches to ectomycorrhizal diversity studies:
variation in ITS at a local scale. Plant Soil 244, pp 29-39.
Ibáñez Pascual, S. (2013). Gestión del suelo en viñedo mediante cubiertas vegetales.
Incidencia sobre el control del rendimiento y vigor. Aspectos ecofisiológicos,
nutricionales, microclimáticos y de calidad del mosto y el vino. Tesis doctoral.
Departamento de Agricultura y Alimentación. Universidad de La Rioja. 306 pp.
Jansen, A.E., Enie, H.W.(1988). Relations between mycorrhizas and fruitbodies o
mycorrhizal fungi in Douglas-fir plantations y The Netherlands. Acta Bot. Neerl. 37, pp
243-249.
Kirk, J. L.; Beaudette, L. A.; Hart, M.; Moutoglis, P.; Klironomos, J.N.; Lee, H. and
Trevors, J T. (2004). Methods of studying soil microbial diversity. Journal of
Microbiological Methods. 58, pp 169-188.
Alejandro Burgos Ramírez
Página 30
ESTUDIO DE LA BIODIVERSIDAD FÚNGICA EN EL SUELO DEL VIÑEDO DE LA FINCA LA GRAJERA
Klironomos, J.N., Rilling, M.C., Allen, M.F. (1999). Designing belowground field
experiments with the help of semi-variance and power analyses. Appl. Soil Ecol. 12, pp
227-238.
Manici, L.M. and Caputo, F.(2010) Soil Fungal communities as indicators for replaining
new peach orchads in intensively cultivated areas. European Journal of Agronomy. 33,
pp. 188-196
Maron, P. A.; Mougel, C.and Ranjard, L. (2011). Soil Microbial diversity: Methodological
strategy, spatial overview and functional interest. Comptes Rendus Biologies. 334, pp
403-411
Martínez Peña, F. (2008). Producción de carpóforos de macromicetes epigeos en
masas ordenadas de Pinus sylvestris L.
Medina Sierra, M. (2012). Caracterización bioquímica y microbiológica de un suelo de
pradera de Dactylis glomerata y Medicago sativa bajo diferentes proporciones de
siembra. Memoria para optar al grado de Doctor. CSIC y Universidad de Salamanca. pp
179.
Nelson, P.E., Toussoun, T.A., Marassas, W.F. (1983). Fusarium species. An illustrated
manual for identification. The Pennsylvania State, University Park, London, 230 pp.
Neville J. Dix, John Webster (1995). Fungal ecology. Chapman and Hall. 549 pgs.
Prosser, J.L. (2002). Molecular and functional diversity in soil microorganisms. Plant
Soil 224. pp 9-17.
Ramos, E. and Zúñiga D. (2008). Soil Microbial Activity in reponse to the different
conditions of moisture, Tª or pH. Ecología Aplicada. Vol 7.
Redecker, D., Hijri, M., Dulieu, H., Sanders, I.R. (1999). Phylogenetic analysis of a
dataset of fungal 5.8s rDNA sequences shows that highly divergent copies of internal
transcribed spacers reported from Scutellospora castanea are of ascomycete origin.
Fungal Genet. Biol. 28, pp 238-244.
Redmond, J.W., Batley, M., Djordjevic, M.A., Innes, R.W., Kuempel, P.L. and Rolfe, B.G.
(1986) Flavones induce expression of nodulation genes in Rhizobium. Nature, 323. pp
632-635.
Rousk, J., Brookes, P.C., Baath, E. (2009). Contrasting soil pH effects on fungal and
bacterial growth suggest functional redundancy in carbon mineralization. App. Environ.
Microbiol. Vol 75, pp 1589-1596
Samaniego-Gaxiola J.A.and Chew-Madinaveitia, Y. (2007). Diversity o soil fungi genera
in three different condition agricultural fields in La Laguna, Mexico. Revista Mexicana
de Biodiversidad. 78, pp 383-390.
Samson, R.A. and Van Reenen-Hoekstra, E.S. (1988). Introduction to Food-borne Fungi
3rd edn. Baarn: Centraalbureau voor Schimmelcultures.
Alejandro Burgos Ramírez
Página 31
ESTUDIO DE LA BIODIVERSIDAD FÚNGICA EN EL SUELO DEL VIÑEDO DE LA FINCA LA GRAJERA
Sarrionandia Areitio, E. (2006). Estudio de las micocenosis de macromicetos de los
encinares del País Vasco.
Satish, N.; Sultana, S. and Nanjundiah, V. (2007). Diversity of soil fungi in a tropical
deciduous forest in Mudumalai, southern India. Current Sciencie, 93, nº 5.
Simpson, R.T., Frey, S.D., Six J. and Thiet R.K. (2004). Preferential accumulation of
microbial carbon in aggregate structures of no-tillage soils. Soil Sci. Soc. Am. J.. 68, pp
1249-1255.
Soto González, J. L.; Andrade Sánchez, M.; Mestas Zapana, P.; Mota de Oliveira
Gonçalves, M.and Hernán Soto González, H. (2010). Impacto de herbicidas sobre
microorganismos disolventes de fosfatos en un suelo rizosférico de plantas de Solanum
tuberosum. Revista Teoría y Praxis Investigation. 5, nº 2.
Tabacchioni, S., Chiarini L., Bevivino A., Cantale C. and Dalmastri C. (2000). Bias caused
by using different isolation media for assessing the genetic diversity of a natural
microbial population. Microbial Ecology, 40 (3), pp 169-176.
Tangjang, S., K. Arunachalam, A. Arunachalam and A.K Shukla (2009). Microbial
population dynamics of soil under traditional agroforestry systems in Northeast India.
Res. J. Soil Biol. 1, pp 1-7.
Van Elsas, J.D., Frois-Duarte, G., Keijzer-Wolters, A., Smith, E. (2000). Analysis of the
dynamics of fungal communities in soil via fungal-specific PCR of soil DNA followed by
denaturing gradient gel electrophoresis. J. Microbiol. Methods 43, pp 133-151.
Warcup, J.H. (1957). Studies on the occurrence and activity of fungi in a wheat field
soil. Trans. Brit. Mycol. Soc. 40; pp 237-262
Watanabe, T.(2002). Pictorial Atlas of Soil and Seed Fungi. Morphologies of Cultured
Fungi and Key to Species.
Wintzingerode, F. V., Gobel, U.B., Stackebrandt, E. (1997). Determination of Microbial
diversity in environmental samples: pitfalls of PCR-bassed rRNA analysis. FEMS
Microbiol. Rev. 21, pp 213-229.
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7. AGRADECIMIENTOS.
En primer lugar, agradecer a mi directora del Trabajo de fin de Carrera, María
del Mar Hernández Álamos la oportunidad de participar en un Proyecto de
Investigación cuyo ámbito me ha resultado muy interesante.
Agradecer el apoyo desinteresado de Miguel, María y Raquel que han estado
ahí cuando he requerido su ayuda.
Por último, el más grande de los agradecimientos a mi madre que siempre me
ha ayudado a seguir con lo que me he propuesto, a Merche, Guille y Lucas por ese
tiempo que les he robado, a mis hermanos que siempre me han apoyado y dedicárselo
especialmente a mi padre, a quien le debo, entre otras muchas cosas, haber hecho
esta carrera.
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8. ANEXO 1.
Imagen macroscópica
Imágenes microscópicas
A1
B1
N1
V2
V5
Tabla 11. Imágenes de los morfotipos identificados dentro del género Aspergillus.
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Imagen macroscópica
Imágenes microscópicas
B4
V3
V4
Figura 12. Imágenes de los morfotipos identificados dentro del género Penicillium.
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Imagen macroscópica
Imágenes microscópicas
N2
V1
Figura 13. Imágenes de los morfotipos identificados dentro del género Alternaria.
Imagen Macroscópica
Imágenes Microscópica
B3
R2
Figura 14. Imágenes de los morfotipos identificados dentro del género Paecilomyces.
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Imagen macroscópica
Imágenes microscópicas
G1
Figura 15. Imágenes del morfotipo identificado dentro del género Rhizopus.
Imagen macroscópica
Imágenes microscópicas
A2
B2
R1
Figura 16. Imágenes de los morfotipos sin identificar.
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