métodos de aislamiento de proteínas a partir de materiales biológicos
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Prácticas de Bioquímica I Práctica: Métodos de Aislamiento de Proteínas MÉTODOS DE AISLAMIENTO DE PROTEÍNAS A PARTIR DE MATERIALES BIOLÓGICOS Objetivos Al finalizar la práctica el alumno estará en capacidad de: - Analizar los principios químicos que rigen los métodos empleados en la separación de proteínas. - Aplicar algunos métodos de separación de proteínas. - Aislar proteínas a partir de materiales biológicos, basados en sus propiedades físicoquímicas. Introducción El aislamiento, caracterización e identificación de biomoléculas está basado en las características estructurales así como en las propiedades físico-químicas de las mismas. Las proteínas constituyen un grupo de biomoléculas numeroso que juegan un papel central en la bioquímica celular, por lo que resulta de interés una revisión de los métodos de aislamiento o separación de estas moléculas. Estas moléculas son polímeros de aminoácidos que presentan características estructurales y propiedades físico-químicas particulares que permiten su separación del medio que las contiene, entre estas las más utilizadas son el peso, forma, tamaño, solubilidad y carga. La separación de determinadas proteínas contenidas en una célula o tejido en particular involucra la utilización de una o varias técnicas en forma secuencial. Algunos de estos métodos se describen a continuación: 1. Separación de proteínas basada en el peso Cuando una suspensión que contiene proteínas se somete a un campo de fuerza centrífuga, sus componentes son separados basados en el peso de los mismos. Este método se llama centrifugación y se basa en la acción de la fuerza centrífuga (fuerza generada cuando un 1 Easy PDF Creator is professional software to create PDF. If you wish to remove this line, buy it now. Prácticas de Bioquímica I Práctica: Métodos de Aislamiento de Proteínas rotor está girando sobre un eje) necesaria para desplazar hacia afuera un determinado peso en dirección radial. Esto hace que los componentes más pesados se sedimenten más rápido que los más livianos. Sin embargo esta relación no siempre es lineal debido a que el tamaño y la forma también influyen en la velocidad de sedimentación. Después de la centrifugación de una suspensión, se diferencian dos fases: sedimento (componentes más pesados que sedimentan en el fondo del tubo) y sobrenadante (suspensión que contiene los componentes más livianos que no sedimentaron) (Figura 1) Sobrenadante Suspensión de proteínas Centrifugación n Sedimento Figura 1. Fases de una suspensión de proteínas centrifugadas Diferentes formas de centrifugación son utilizadas dependiendo de lo que se desee separar. Las partículas grandes o agregados de una suspensión se separan con centrifugación a bajas velocidades (2.500 – 5.000 rpm) durante 10 ó 20 minutos en un rotor de ángulo fijo (ejemplo: sedimentación de núcleos y membranas después del rompimiento de células, esto generalmente es el primer paso para la separación de proteínas). Para separar moléculas más pequeñas como proteínas que quedan suspendidas en el sobrenadante, se emplea la ultracentrifugación la cual consiste en una centrifugación a alta velocidad (20.000 -60.000 r.p.m). 2. Separación de proteínas basada en el tamaño Las proteínas pueden separarse con base a las diferencias de tamaño molecular con otras proteínas u otras moléculas orgánicas e inorgánicas mediante diálisis o ultrafiltración En la diálisis se utilizan “bolsas” cuyas paredes son membranas selectivamente permeables de material poroso, en el interior de la cuál se coloca la mezcla que contiene la 2 Easy PDF Creator is professional software to create PDF. If you wish to remove this line, buy it now. Prácticas de Bioquímica I Práctica: Métodos de Aislamiento de Proteínas proteína a separar. Esta bolsa se cierra y se sumerge bajo agitación, en un recipiente que contiene agua destilada. La diferencia en la concentración de solutos entre el interior de la bolsa y el medio externo (gradiente de concentración) favorece la difusión de las moléculas cuyo tamaño es inferior al diámetro del poro, desde el medio más concentrado (interior de la bolsa de diálisis) hacia el de menor concentración (agua destilada). Las moléculas que tienen un tamaño superior al tamaño del poro son retenidas en el interior de la bolsa de diálisis. En la ultrafiltración la mezcla que contiene las moléculas a separar, se hace pasar por filtros o membranas sintéticas con poros microscópicos (menores a 1 µm) aplicando alta presión (aire comprimido o alto vacío). Después de aplicado este proceso se obtienen dos fracciones: el concentrado localizado en la superficie del filtro, que contiene las moléculas de mayor tamaño y el permeado que contiene las moléculas más pequeñas que atravesaron el filtro. 3. Separación de las proteínas basada en su solubilidad Las proteínas son biopolímeros que presentan carga eléctrica. La magnitud de la carga depende del número y tipo de aminoácidos presentes en la molécula (polar, polar sin carga o no polar). La carga eléctrica de las proteínas determina su afinidad por el solvente y la repulsión entre ellas, lo que favorece su solubilidad y evita la formación de agregados proteínicos. Por otro lado, la solubilidad de las proteínas es alterada por diversos factores: pH, fuerza iónica del medio, propiedad dieléctrica del agua y temperatura. 3.1. Efecto del pH Cuando el número de cargas positivas y negativas presentes en las proteínas se igualan, la carga neta de la molécula es cero, a esto se conoce como punto isoeléctrico. Cada proteína posee un valor de pH en el cual alcanza su punto isoeléctrico que se conoce como pH isoeléctrico. A ese valor de pH las proteínas de un mismo tipo y por lo tanto, de igual carga neta que se mantenían dispersas debido a la repulsión electrostática, comienzan a agregarse y precipitan, perdiendo su solubilidad. 3 Easy PDF Creator is professional software to create PDF. If you wish to remove this line, buy it now. Prácticas de Bioquímica I Práctica: Métodos de Aislamiento de Proteínas El pH de la leche se encuentra entre 6,5 y 6,7, al ajustar este valor con ácido acético (CH3COOH) u otro ácido débil hasta el pH isoeléctrico de las caseínas (4,7), estas proteínas (que constituyen el 80% de las proteínas de la leche) precipitan y se pueden separar del resto de las proteínas lácteas por centrifugación u otro método. El precipitado de caseínas puede redisolverse en NaOH y precipitarse nuevamente con CH3COOH. 3.2. Efecto de la fuerza iónica. Agregado de sales neutras. El aumento de la fuerza iónica (medida de la concentración y número de las cargas presentes en el solvente) es otro factor que altera la solubilidad de las proteínas La presencia de cargas adicionales en el medio donde se encuentran disueltas las proteínas, puede conllevar a la precipitación de algunas de ellas. Al agregar pequeñas cantidades de sales como el cloruro de sodio (NaCl) o el sulfato de amonio ((NH4)2SO4) produce en principio, un pequeño incremento en la solubilidad de las proteínas que se conoce como SALTING IN (término inglés) y se debe al efecto pantalla que produce el agua debido a su alta constante dieléctrica. Al aumentar la concentración de sales en el medio, éstas comienzan a competir con las proteínas por el agua de hidratación reduciendo así la relación proteína-agua. De esta manera, las proteínas pierden el agua que las mantenía en solución y precipitan, este efecto que se conoce como SALTING OUT. La precipitación se aprecia mejor si previamente se modifica el pH del medio hasta llevarlo al pH isoeléctrico de la proteína que queremos precipitar. 3.3. Efecto de la fuerza iónica. Agregado de sales de metales pesados Las proteínas al exponerse a la presencia de iones metálicos como el plomo (Pb+2), mercurio (Hg+2) o la plata (Ag+) precipitan, debido a que estos iones son atraídos por los grupos carboxílicos (COO-) presentes en la estructura proteica, esto anula las cargas negativas que mantenían a las proteínas separadas unas de otras y en solución. Al desaparecer la repulsión entre estas, se agregan y precipitan. 4 Easy PDF Creator is professional software to create PDF. If you wish to remove this line, buy it now. Prácticas de Bioquímica I Práctica: Métodos de Aislamiento de Proteínas 3.4. Efecto de la temperatura Las temperaturas elevadas ocasionan la “desnaturalización” de las proteínas. Bajo estas condiciones, algunas proteínas experimentan un proceso llamado coagulación por calor. La coagulación se produce cuando, por efecto de temperaturas elevadas, los grupos sulfhidrilo de los residuos de cisteína se unen para formar puentes disulfuro (enlaces covalentes) entre las moléculas de proteína formando cistina. Este entramado molecular produce un coagulo insoluble de proteínas desnaturalizadas. Proteínas como la albúmina (de huevo o sérica), rica en cisteína coagula con rapidez, mientras que las caseínas (proteínas de la leche) que no contienen cisteína en su estructura química, no forman coágulos al aumentar la temperatura. MATERIALES Y REACTIVOS - Beakers ó Erlenmeyer - Tubos de centrífuga. - Pizetas. - Varilla de vidrio. - Papel filtro. - Soporte para embudo. - Embudos. - Pipetas graduadas 2 mL, 1 mL, 10 mL. - Cilindro graduado. - Goteros. - Centrífuga. - Leche descremada. - Sulfato de amonio saturado (al menos 30%) - Reactivo de Biuret: 1,5g de CuSO4:5 H2O y 6g de Tartrato de sodio y potasio se disuelven en 500 mL de agua. Añadir 300 mL de NaOH al 10% p/v y aforar a 100 mL. - Leche descremada. - Ácido acético glacial. - NaOH 0,1N. - Etanol 95%. - Etanol absoluto. - Acetato de plomo 10 %. Experimento 1. Precipitación de proteínas con sales neutras. 1. Rotule dos (2) tubos de centrífuga 1 y 2. 2. Agregue 3 mL de plasma en el tubo 1. 5 Easy PDF Creator is professional software to create PDF. If you wish to remove this line, buy it now. Prácticas de Bioquímica I Práctica: Métodos de Aislamiento de Proteínas 3. Adicione a al tubo 4 mL de sulfato de amonio saturado (NH4) 2SO4. 4. Agregue 7 mL de agua al tubo 2 y úselo como contrapeso. 5. Agite en un agitador vortex y observe la aparición de un precipitado blanquecino. 6. Para comprobar la separación de proteínas en el precipitado, centrifugue ambos tubos a 3.500 rpm por 10 minutos y colecte el sobrenadante en un tubo de ensayo. 7. Disuelva el precipitado en el tubo de centrífuga hasta 10 mL con agua destilada. 8. Usando 2 mL del precipitado resuspendido y 0,5 mL de sobrenadante, verifique la presencia de proteínas mediante la reacción de Biuret agregando 5 gotas de NaOH al 30% y 4 gotas de CuSO4 al 1 %. 9. Anote los resultados en la siguiente tabla e interprete Fracción Color obtenido con la reacción de Biuret Resultado Positivo Negativo Interpretación Sobrenadante Precipitado resuspendido Experimento 2. Precipitación de proteínas con sales de metales pesados. 1. En un tubo de ensayo agregue 3 mL de suspensión de ovoalbúmina al 2%. 2. Agregue 0,5 mL de acetato de plomo al 10% 3. Observe y anote los resultados en la tabla anexa Solución de proteína Efecto observado Interpretación Ovoalbúmina 6 Easy PDF Creator is professional software to create PDF. If you wish to remove this line, buy it now. Prácticas de Bioquímica I Práctica: Métodos de Aislamiento de Proteínas Experimento 3. Efecto de la temperatura sobre la ovoalbúmina. 1. En un tubo de ensayo agregue 2 mL de una suspensión de ovoalbúmina al 2%. 2. Coloque el tubo en baño de agua a 100°C durante 10 minutos. 3. Saque el tubo del baño y observe. 4. Anote lo resultados en la tabla anexa. Solución de proteína Efecto observado Interpretación Ovoalbúmina Experimento 4: Efecto el pH sobre las caseínas de la leche 1. En un beaker de 100 mL coloque 10 mL de leche descremada y agregue 40 mL de agua destilada. 2. Añada dos gotas de ácido acético glacial y mezcle con una varilla de vidrio. Observar la precipitación floculada de las caseínas. 3. Centrifugue 10 mL del material obtenido a 3.500 rpm durante 10 minutos. 4. Descarte el sobrenadante y reserve el precipitado. 5. Redisuelva el precipitado en 10 mL de NaOH 0.1 N. 6. Adicionar gota a gota al material resuspendido 0,2 mL de ácido acético y mezclar. 7. Centrifugue a 3.500 rpm por 5 minutos, reserve el precipitado y lávelo con 10 mL de agua fría. Centrifugue de nuevo a las mismas condiciones anteriores. 8. Resuspenda el precipitado en 10 mL de agua (si no se disuelve fácilmente agregue 3 a 4 gotas de NaOH 0,1N). 7 Easy PDF Creator is professional software to create PDF. If you wish to remove this line, buy it now. Prácticas de Bioquímica I Práctica: Métodos de Aislamiento de Proteínas 9. Tome 0,5 mL del precipitado resuspendido y adicione 5 gotas de NaOH al 30% y 4 gotas de CuSO4 al 1 % (prueba de Biuret). 10. Observe y anote los resultados de la prueba en la tabla anexa. Solución Efecto observado Interpretación Leche + ácido acétíco Precipitado resuspendido + Biuret Resultado (+ 0 -) Autoevaluación 1. Explique el efecto del Sulfato de amonio (NH4)2SO4 saturado cuando es agregado a una solución de proteínas. 2. Mencione cuatro métodos utilizados para la separación de proteínas y diga en que están basados. 3. Establezca las diferencias entre la diálisis y ultrafiltración. 4. Mencione cuatro factores que afectan la solubilidad de las proteínas. 5. Explique en que se basa la precipitación de las caseínas de la leche. Bibliografía Alemany, M; Font, S. Práctica de Bioquímica. Edit Alhambra. España 1.983. Pavia, Donald; Lampman, Gary; Kriz George. Introduction to organic laboratory techniques. Saunders editores. 1976. Plummer, David. Bioquímica práctica. Mc Graw Hill. 1981. Robyt, John; White Bernard. Bioquemical Techniques. Waveland Press. 1987 8 Easy PDF Creator is professional software to create PDF. If you wish to remove this line, buy it now.
